Actividad Antioxidante de plantas medicinales Paraguayas. (Myrciaria cauliflora, Yvapuru )

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1 Actividad Antioxidante de plantas medicinales Paraguayas (Myrciaria cauliflora, Yvapuru ) Dahiana Espínola Monges, BSc; Mª Odilia Benítez Cabañas, MSc;Mabel Díaz, Lic; Nadia,Villalba. Lic; Francisco, Ferreira. Lic. RESUMEN Paraguay posee una amplia variedad de frutos con potencial medicinal debido a la gran diversidad biológica de la zona. Un sin número de frutos con estas propiedades son utilizados desde tiempos muy antiguos de diversas maneras dentro de la medicina tradicional. Con este estudio, se determinó la presencia de un antioxidante con características hidrosolubles en el fruto de Myrciaria cauliflora, conocido en nuestro país como Yvapurû. Esto se realizó a través de la preparación de extractos acuosos y etanólicos, cuyas muestras posteriormente fueron analizadas empleando para el efecto un espectrofotómetro Genesys 10s UV-Vis, en el cual se realizaron la lectura de las soluciones a distintas longitudes de ondas en el rango UV visible. Se realizó el análisis del contenido total de flavonoides de la muestra, según el método colorimétrico descrito por Zou, Lu, and Wei (2004). También se determinó el ph del extracto acuoso. Tal propiedad antioxidante de este abundante fruto en nuestro país podría ser aprovechada en la contribución de beneficios terapéuticos. Palabras claves: Antioxidantes, Radicales Libres, Especies reactivas del oxígeno (ROS)

2 ABSTRACT Paraguay has a wide variety of fruits with medicinal potential due to the great biodiversity of the area. Countless fruits with these properties are used since ancient times as part of traditional medicine in various ways. In this study we determined the presence of watersoluble antioxidant vitamins in the fruit of Myrciaria cauliflora, known in our country as Yvapurû. This was performed by preparation of aqueous and ethanol extracts of Myrciaria cauliflora by traditional extraction methods, samples of which were subsequently analyzed using an Ultraviolet-visible (UV-vis) NIR Spectrophotometer. The total flavonoid content of Myrciaria cauliflora was determined according to the colorimetric method as described by Zou, Lu, and Wei (2004). It was also determined the ph of the aqueous extract. This antioxidant property of this abundant fruit in our country could be exploited in the contribution of therapeutic benefits. Keywords: Antioxidant, Free radicals, Reactive oxygen species (ROS) INTRODUCCIÓN El Yvapurũ pertenece a la familia de Myrtaceae, Género Myrciaria, Especie M. cauliflora por lo general tienen una aproximada altura de m, con tronco liso de cm de diámetro de hojas simples de 6 7 cm de longitud, 2-3 cm de ancho. Las flores y el fruto están unidas en el caule. Comúnmente crece en campo, bajo la sombra de otros arboles. Se encuentran en el grupo de arboles que aun no han sido estudiadas en su totalidad. El estrés oxidativo ha sido implicado en el desarrollo de numerosas enfermedades crónicas y en el proceso de envejecimiento (Halliwell y Whiteman 2004). El término estrés oxidativo hace referencia al desequilibrio entre la generación de especies oxidantes (radicales libres y otras especies reactivas) y la capacidad de los sistemas de defensa antioxidante del organismo

3 para hacer frente a la agresión oxidativa y sus efectos adversos (Mayne 2003). Trabajos realizados sobre extractos acuosos y etanólicos de frutos de Momordica charantia conocida como Shan Ku Kuan en Taiwán - Asia, han demostrado que éste posee un potente antioxidante lo cual le confiere las propiedades captadoras de radicales libres (Shu Jing Wu, Lean-Teik Ng, 2007). En un estudio realizado por (Jiménez, et al, 2005) se comprobó que las especies de la familia Annonaceae poseen actividad antioxidante y que estas no presentan citotoxicidad. Las técnicas y métodos como el DPPH empleados para evaluar la actividad antioxidante son relativamente sencillas y térmicamente estables según (Mosquera, et al, 2005). PROBLEMÁTICA El estrés oxidativo ha sido asociado a la patogénesis de muchas enfermedades humanas como: arteriosclerosis, artritis, demencia, cáncer, etc. Es por ello, que el uso de antioxidantes es estudiado en forma intensiva, particularmente en el tratamiento de accidentes cerebrovasculares y enfermedades degenerativas. A las moléculas que pueden provocar este tipo daño se las considera como especie oxigeno reactivas (ROS). Éstas se asocian con enfermedades como el cáncer, problemas cardiacos, envejecimiento humano, destrucción de paredes celulares, inactivación de enzimas, debilitamiento de la capacidad defensiva e incluso daño del material genético. (Castañeda, et al, 2008) Un punto de interés en la investigación de productos naturales, es la búsqueda de ensayos capaces de guiar al investigador en la purificación y fraccionamiento del extracto vegetal en estudio, por lo que en este trabajo se busca utilizar sistemas in vitro para analizar la actividad antioxidante de los extractos del fruto de Myrciaria cauliflora, ya que se obtienen de forma más rápida y económica que las pruebas in vivo. No obstante, en trabajos posteriores se

4 pretende realizar pruebas in vivo que son indispensables como ensayos previos a la investigación pre clínica y clínica. (Castañeda, et al, 2008) OBJETIVO GENERAL 1. Determinar la capacidad antioxidante in vitro de los extractos del fruto de Myrciaria cauliflora. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 2. Identificar la presencia de antioxidantes en los extractos acuosos y etanólicos en frutos de Myrciaria cauliflora. 3. Realizar ensayos de identificación del total de flavonoides en la muestra, según el método colorimétrico descrito por Zou, Lu, and Wei. 4. Determinar el porcentaje de captación de radicales libres utilizando como radical modelo al compuesto 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH). 5. Cuantificar el potencial antioxidante aplicando metodologías y distintas técnicas de análisis para el efecto. 6. Comprobar la actividad antioxidante de los extractos realizando ensayos en tejidos hepático y cerebral de ratones Mus musculus.

5 METODOLOGÍA Obtención del Fruto Los frutos fueron recolectados en la Ciudad de Itauguá ubicada en el Departamento Central de la República del Paraguay, durante la segunda quincena del mes de septiembre. Al término de la cosecha, inmediatamente los frutos fueron secados en estufa a una temperatura de 37 ºC y al abrigo de la luz. Al finalizar el proceso de secado se procedió a la trituración de los mismos lográndose de esta forma los frutos en forma de polvo seco de textura y tamaños homogéneos. Preparación de los extractos El extracto acuoso del material en estudio fue preparado mediante maceración de 100 g de polvo del fruto en 1L de agua hirviente durante 1 hora. El extracto se centrifugó durante 10 minutos a 9000 rpm, luego se filtró utilizando papel filtro cualitativo de 25 µm y se repitió el proceso del filtrado dos veces. Para el extracto etanólico, se preparó en remojo 100 g del fruto con 1L de etanol (98%) a temperatura ambiente durante toda la noche. El extracto se almacenó a 4 C hasta su posterior utilización. Ambos extractos; acuoso y etanólico se colocaron en recipientes adecuados, al abrigo de la luz y a 4 ºC hasta su posterior utilización. Análisis del total de flavonoides El contenido total de flavonoides de la muestra se determinó según el método colorimétrico descrito por Zou, Lu, and Wei (2004), donde 0.5 ml de la muestra se mezcló con 2ml de agua destilada, posteriormente con 0.15 ml de solución NaNO 2 al 5%. Después de 6 minutos de reacción, se añadió 0.15 ml de solución de AlCl 3 al 10% y dejó en reposo por 6 minutos, seguido por la adición de 2ml de NaOH al 4%.

6 Inmediatamente después se añadió agua a la mezcla hasta llegar a un producto final de 5 ml, y se dejó reposar durante 15 minutos. Se observó el comportamiento espectral en un espectrofotómetro de barrido en un rango de entre nm, contrastando con un patrón de ácido ascórbico de similar comportamiento. Se realizó un blanco con agua y etanol en tubos de ensayos separados, en las mismas condiciones de reacción que las muestras, a fin de observar el aporte de los reactivos y descartar posibles falsos positivos. ph del Extracto La medida del ph se realizó directamente sobre el extracto acuoso concentrado a temperatura ambiente empleando un ph-metro GLP 21. Comportamiento de los extractos frente a los cambios de ph Se lo conoce también como ensayo de reconocimiento de antocianinas. Las antocianinas se comportan como indicadores acido - base. A ph ácido presentan coloraciones rojas, violetas y moradas; mientras que a ph alcalino presentan coloraciones verdes y azules. A 20 ml de cada uno de los extractos acuoso y etanólicos en forma individual se le agregaron soluciones de hidróxido de sodio y ácido clorhídrico diluidos para el ajuste de ph de acuerdo a los requerimientos del ensayo. Con ayuda de un ph metro se fue controlando en valor del ph y observando los cambios de colores. Las antocianinas toman coloración roja a ph=3.0; coloración violeta a ph=8.5 y coloración azul a ph=11.0.

7 Actividad captadora de radicales libres por el método del DPPH. La medición de la actividad antioxidante se realizará por el método de DPPH de acuerdo al lo descrito por Blois (1958), Chang, Lee, and Ng (2006). Se mezclarán de 1ml de solución de 0.1 mmol/l DPPH con 3 ml de diversas concentraciones del extracto (50, 100, y 300 mg/ml) disueltos en metanol. La mezcla se agitará con vórtex y se dejará durante 30 min a 40ºC bajo resguardo de luz. Para blanco de la muestra se utilizará 3 ml de metanol y se realizará la lectura de la absorbancia de las muestras a 517 nm. Actividad de quelación metálica La quelación de iones ferrosos por el extracto se estimará por el método de Dinis, Madeira, y Almeida (1994). Se mezclará, 1 ml de extracto a diferentes concentraciones (1, 10, y 100 mg/ml) con 3.7 ml de metanol y 0.1 ml de 1 mmol/l FeCl 2. La reacción se iniciará mediante la adición de 0.2 ml de 5 mmol/l ferrozina, seguido por la agitación por vórtex y se dejará reaccionar a temperatura ambiente durante 10 min aproximadamente. Se medirá la absorbancia espectrofotométricamente.

8 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Análisis del total de flavonoides. La figura 1.1 presentada a continuación corresponde a los espectros del extracto etanólico y al del patrón de referencia (solución etanólica de ácido ascórbico). Contrastando los espectros correspondientes a los extractos etanólicos y al patrón de referencia se observa un comportamiento espectral idéntico entre ambos; lo cual se puede atribuir a la presencia de antioxidantes hidrosolubles en el extracto etanólico. La figura 1.2 correspondiente a los espectros de los estractos acuosos y del patrón de referencia (solución acuosa del ácido ascórbico). Como se puede observar en la figura 1.2, los espectros del extracto acuoso no presentan un comportamiento espectral similar al patrón de referencia; por lo que no se puede afirmar la presencia de antioxidantes hidrosolubles, pero tampoco se puede descartar la presencia de los mismos debido a que durante el proceso de obtención de los extractos acuosos la elevada temperatura de maceración pudo haber sido un factor que influyó en la degradación de estos compuestos. Comportamiento de los extractos frente a los cambios de ph - Reconocimiento de antocianinas En la tabla 1.2 se pueden observar los valores de ph y las características de cada uno de los extractos. En los ensayos de cambios de ph realizados sobre ambos extractos (acuoso y etanólico) no se observaron cambios apreciables y coincidentes con la literatura; por lo cual no se puede afirmar la presencia de antocianinas.

9 CONCLUSIÓN Existen diferentes métodos para evaluar la actividad antioxidante, ya sea in vitro o in vivo. Los métodos in vitro nos permite tener una idea aproximada de lo que ocurre en situaciones complejas in vivo. Al utilizar el método colorimétrico se observó un comportamiento similar entre el patrón de referencia empleado para este fin y el extracto etanólico del fruto; lo cual gracias al Espectrofotómetro de Barrido arrojó como resultado un idéntico comportamiento entre los mismos; por lo que sugiere la presencia de algún antioxidante. En el caso del extracto acuoso, no se observó ninguna línea espectral que coincida con el patrón de referencia. Por lo tanto, no podemos afirmar que la muestra no contenga antioxidantes debido a que si esta la presenta, pudo haberse degradado por algún otro factor. Se sugieren otros análisis posteriores, teniéndose en cuenta factores como la temperatura, ph, etc. en la obtención de los extractos. En la medición de ph en el extracto acuoso se halló un valor ácido igual a 3.58, mientras que en el extracto etanólico se obtuvo un ph igual a AGRADECIMIENTO Expresamos nuestro reconocimiento y agradecimiento al Laboratorio de Instrumenta de la FaCEN quienes nos proporcionó las facilidades de algunos materiales del Laboratorio de Instrumental y participaron directamente en la ejecución del proyectos. Al laboratorio del Departamento Fitoquimica de la FCQ. A la Srta. Cinthia Guerrero Basualdo quién nos proporcionó la muestra de yvapuru.

10 LITERATURA CITADA 1- Blois, M. S. (1958). Antioxidant determinations by the use of stable free radical. Nature, 26, Castañeda C. B.1, Q.F. Ramos LL. E. 2, Dra. Ibáñez V. L. (2008). Evaluación de la capacidad antioxidante de siete plantas medicinales peruanas 3- Chang, W. C., Lee, E. L., & Ng, L. T. (2006). Factors influencing the 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging assay in the natural product analysis. Tajen Journal, 28, Dinis, T. C. P., Madeira, V. C. M., & Almeida, L. M. (1994). Action of phenolic derivates (acetoaminopehn, salycilate and 5-aminosalycilate) as inhibitors o membrane lipid peroxidation and as peroxyl radical scavengers. Archives of Biochemistry and Biophysics, 315, Halliwell, B., & Gutteridge, J. M. (1984). Lipid peroxidation, oxygen radicals, cell damage, and antioxidant therapy. Lancet, 23, Jimenez, Londoño, J. Arango. (2005). Actividad Captadora de Radicales Libres y Citotoxicidadde Plantas Colombianas de la Familia Annonaceae 7- Mayne ST.(2003) Antioxidant nutrients and chronic disease: use of biomarkers of exposure and oxidative stress status in epidemiologic research. 8- Shu-Jing Wua, Lean-Teik Ng. (2007) Antioxidant and free radical scavenging activities of wild bitter melon (Momordica charantia Linn. var. abbreviata Ser.) in Taiwan. 9- Zou, Y. P., Lu, Y. H., & Wei, D. Z. (2004).Antioxidant activity of a flavonoid-rich extract of Hypericum perforatum L. in vitro. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52,

11 ANEXO Fig Fig. 1.2

12 Tabla 1.1 EXTRACTO ph Acuoso 3,58 Etanólico 4,25 Tabla 1.2 Extracto Acuoso Color Extracto Etanólico Color Literatura ph inicial = 3.58 Marrón ph inicial = 4.25 Amarillo 1. ph = 3.0 Marrón ph = 3.0 Amarillo claro Rojo ph = 8.5 Marrón ph = 8.5 Marrón claro Violeta ph = 11.0 Marrón fuerte ph = 11.0 Marrón oscuro Azul