M408 MERCIA TOXOPLASMA M

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1 REF M408 MERCIA TOXOPLASMA M IVD 1. INTENDED USE The Mercia Toxoplasma IgM EIA kit is an enzyme immunoassay for the detection of Toxoplasma gondii IgM antibodies in human serum and is used as an aid in the diagnosis of Toxoplasma gondii infections. The assay must be performed strictly in accordance with the instructions set out in these instructions for use. The product is intended for professional use only. 2. INTRODUCTION Toxoplasmosis is a systemic disease in animals and humans caused by the parasite Toxoplasma gondii. The parasite is ubiquitous. In normal adults the infection is usually asymptomatic. Maternal infection can cause congenital Toxoplasmosis and can damage the developing foetus. This damage is generally greater when maternal infection occurs in early pregnancy. It is generally accepted that women who are immune to Toxoplasma gondii infection before pregnancy will not transmit the disease to the foetus. However, women who contract a primary Toxoplasmosis during pregnancy may affect the foetus, which can be devastating to the developing child. To reduce the chance of contracting a Toxoplasma infection during pregnancy hygienic precautions are necessary. Thus, it is of importance to screen for immunity early in pregnancy. Serological diagnosis of Toxoplasmosis can be performed by the measurement of Toxoplasma specific IgM and IgA. A significant increase in IgG antibody level in two consecutive sera is also a diagnostic criterion for recent or active Toxoplasmosis. Toxoplasma IgM antibodies may occur longer than one year after onset of the disease in a low percentage (appr. 10%). Its detection also depends on the type of test employed. In IgM capture assays, the Toxoplasma-specific IgM signal decreases earlier when compared to indirect assays. This enables a more precise indication of current or recent infection. Together with clinical symptoms demonstration of Toxoplasma IgM antibodies has considerable diagnostic significance. 3. PRINCIPLE OF THE ASSAY The method for qualitative determination of specific IgM to Toxoplasma gondii is illustrated below. 1. Well coated with anti human IgM is incubated with diluted human serum for 60 minutes at 37 Celsius. 2. After washing with wash buffer purified Toxoplasma antigen conjugated with horseradish peroxidase (conjugate) is added together with control antigen which acts as a blocking agent. Incubation for 60 minutes at 37 Celsius.

2 3. After washing with wash buffer TMB is added. TMB acts as a substrate for the horseradish peroxidase. 4. By incubating the wells in the dark for 30 minutes at room-temperature the colour of the substrate will turn to blue. 5. The enzymatic conversion of TMB is stopped by adding sulphuric acid, 0.5 M. The optical density is measured with a photometric reading instrument at 450 nanometer 3.1 Assay principle The Mercia Toxoplasma M IgM EIA is an antibody class capture immunosorbent assay for the detection of Toxoplasma gondii specific IgM in human serum. Rabbit antibody specific for the µ- chain of human antibodies is coated to the solid phase of the microtitrestrip wells. These antibodies will bind specifically to human IgM present in each serum: capture of the IgM. Purified Toxoplasma gondii antigen (the p30 protein) labelled covalently to peroxidase (the conjugate) will complex to captured T. gondii-specific IgM. The conjugate will act as the indicator for the immunological reaction between the T. gondii antigen in the conjugate and the T.gondii specific human IgM captured, coated on the wells of the microtitreplate. TMB that acts as a chromogen will induce colour proportionally to the amount of T. gondii specific IgM captured. 4. REAGENTS AND ACCESSORIES 4.1 Reagents provided in the kit The kit contains the following reagents. A distinction can be made between reagents that are specific for the assay and universal reagents. CAT. SYMBOL DESCRIPTION QUANTITY CODE CONTROL + M408B Positive control (RED, ready-to-use) 1.0 ml CONTROL - M408D Negative control (YELLOW, ready-to-use) 1.0 ml CONTROL +/- M408C Cut-off control (GREEN, ready-to-use) 2.4 ml CONJ 100X M408F PO-labelled Toxoplasma conjugate (100 x concentrated) 0.2 ml MT PLATE M408A Microtitreplate coated with polyclonal anti IgM (96 wells) 1 plate CONTROL Ag M408L Control Antigen (100 x concentrated) 0.2 ml SUBS TMB M408G TMB Substrate (ready to use) 15 ml DIL SAMP M408K Dilution buffer (BLUE, ready-to-use) 120 ml BUF WASH 20X M408E Wash buffer (20 x concentrated) 60 ml SOLN STOP M408H Stop solution (ready-to-use) 15 ml DIL CONJ M408M Conjugate Diluent (Blue) 20mL 4.2 Materials provided with the kit Resealable bag, 2 x Instructions for use, 1 x 4.3 Equipment and materials required, but not supplied Pipettes to deliver volumes between 10 µl and 1000 µl (trueness ± 2%, precision 1 %) Volumetric laboratory glassware Deionised (or distilled) water Incubator thermostatically controlled at 37 C ± 1ºC Clean disposable tubes for diluting patients sera (capacity appr. 3 ml) Clean disposable tubes for diluting conjugate (capacity 12 ml) Automatic plate washer (optional) with dispense volume µl, wash cycle = 5 times Microtitre plate reader, equipped for measuring absorbances at 450 nm (optionally equipped for dual wavelength measurement at 450 and 620 nm), absorbance range; 0.0 to 3.0 absorbance units Vortex tube mixer Timer

3 5. COMPOSITION AND HANDLING OF REAGENTS 5.1 Specific kit reagents M408B Positive Control A vial containing 1.0 ml of human serum, highly reactive for IgM against Toxoplasma gondii prediluted in PBS buffer, BSA, preservatives and an inert red dye. The reagent is ready-to-use. After use, close cap, replace in the kit box and store between 2-8 C. Handled in this way, the positive control will expire as indicated on the vial label. M408D Negative Control A vial containing 1.0 ml of human serum, non-reactive for IgM antibodies to Toxoplasma gondii prediluted in PBS buffer, BSA, preservatives and an inert yellow dye. The reagent is ready-to-use. After use, close cap, replace in the kit box and store between 2-8 C. Handled in this way, the negative control will expire as indicated on the vial label. M408C Cut-off Control A vial containing 2.4 ml human serum, with a low reactivity for IgM to Toxoplasma gondii prediluted in PBS buffer, preservatives and an inert green dye. The reagent is ready-to-use. After use, close cap, replace in the kit box and store between 2-8 C. Handled in this way, the cut off control will expire as indicated on the vial label. M408F Conjugate A vial containing 0.20 ml Toxoplasma gondii antigen covalently labelled to peroxidase, PBS buffer, BSA and preservatives. Prepare only the amount of working strength conjugate needed for the assay-run and keep the concentrated conjugate at 2-8 C. Handled in this way, the conjugate will expire as indicated on the vial label. Note: The working strength conjugate cannot be stored and should be used immediately after preparation. 5.2 Universal reagents M408A Microtitreplate Microtitreplate (96 wells) with 8-well breakable strips coated with rabbit IgG specific for human IgM. The strips are ready-to-use and should be stored at 2-8 C. After opening replace any unused wells in the resealable plastic bag and store in the kit box between 2-8ºC. Resealed strips expire as indicated on the microtitre plate label. M408L Control Antigen A vial containing 0.2 ml control antigen obtained from sonicated Hep-2 cells in PBS, BSA and preservatives. The reagent should be stored at 2-8 C. Use only the amount needed for the assay-run and keep the concentrated control antigen at 2-8 C. Handled in this way, the control antigen will expire as indicated on the vial label. M408K Dilution buffer The bottle contains 120 ml PBS buffer, proteins, preservatives and an inert blue dye. The reagent is ready-to-use. After use, close lid, replace in the kit box and store between 2-8 C. Handled in this way, the dilution buffer will expire as indicated on the bottle label. M408E Wash buffer The bottle contains 60 ml PBS buffer, Tween 20 and preservatives. The wash buffer is 20 times concentrated and may develop crystalline deposits during prolonged storage at 2-8ºC. The working concentration must be prepared according to protocol. After use, close lid, replace in the kit box and store between 2-8 C. Handled in this way, the wash buffer will expire as indicated on the bottle label. Stability at working concentration is one week at room temperature or one month at 2-8 C. M408G TMB substrate (chromogen) The bottle contains 15 ml tetramethybenzidine in organic solution. The TMB is ready to use. The chromogen solution should be stored in the dark between 2-8 degrees C. After opening take out the

4 volume needed and immediately close the bottle. The TMB should at all times be kept away from direct light, as this can induce auto-colouration. Handled in this way, the TMB substrate will have the shelf life expiry date indicated on the bottle label. M408H Stop Solution The bottle contains 15 ml 0.5 M sulphuric acid solution. The reagent is ready-to-use. After use, close cap and replace in the kit box. Handled in this way, the Stop Solution will expire as indicated on the vial label. M408M Conjugate Diluent The bottle contains 20 ml buffered solution. The reagent is ready-to-use. After use, replace in the kit box and store between 2-8ºC. Handled this way, the Conjugate Diluent will expire as indicated on the label. 6. COLLECTION, HANDLING AND STORAGE OF SERUM SPECIMENS Either human serum or plasma may be used. Samples must not be haemolysed, nor contain particulate material. To obtain sera for the detection of Toxoplasma gondii IgM antibodies, patient blood should be drawn and allowed to clot at room temperature. Centrifuge within one day, transfer the serum into a vial. Sera may be stored at 4 C for up to 7 days. If storage time exceeds 7 days, store at -20 C to -70 C. Avoid repeated freeze-thaw cycles. 7. PROCEDURE 7.1 Washing procedure Efficient washing is a fundamental requirement of EIA's. It is essential that each rinsing procedure is carried out with care to obtain reproducible inter- and intra- assay results. Prepare the wash as follows: The 20x concentrated Wash buffer may have developed crystalline deposits during prolonged storage at 2-8ºC. These should be re-dissolved by standing the bottle in a 37ºC water bath until the crystals disappear. Mix per 8-well strip 3 ml wash buffer (20x) with 57 ml distilled water. Alternatively, mix the total volume (60 ml) of the wash buffer (20x) with 1140mL distilled water. Both manual washing and washing with an automatic plate washer can be done: Manual washing 1. Empty the contents of each well by turning the strips in the holder upside down followed by a firm short vertical movement. Keep the strips tightened by pressing the sides of the strip holder. 2. Fill all the wells to the rims ( µl) with wash buffer, for instance with a 8-channel pipette. Be aware of carry-over. 3. Turn the strips upside down and empty the wells by a firm short vertical movement. 4. This washing cycle (2 and 3) should be carried out 5 (five) times. 5. Place the inverted plate on absorbent paper towels and tap the plate firmly to remove residual washing solution in the wells. 6. Take care that none of the wells dries out before the next reagent is dispensed. Therefore, proceed immediately with the next step washing with automatic microtitreplate wash equipment When using automatic plate wash equipment, check that all wells can be aspirated completely, that the wash buffer is accurately dispensed reaching the rim of each well during each washing cycle. The washer should be programmed to execute 5 (five) washing cycles. After the last cycle, remove the wash buffer from the wells by tapping firmly the plate on absorbent towels. 7.2 Assay and reagent preparation procedure Note: Bring all reagents to room temperature (18-23 C) before assaying. Perform all assay steps in the order given and without any appreciable delays between the steps. Check the expiry date before use 1. Dilute patient sera (1+100): mix 1.0 ml dilution buffer (BLUE) with 10 µl patient serum. After dilution thoroughly mix with a vortex to ensure adequate mixing. The negative control, positive control and cut-off control are ready-to-use and need no further dilution.

5 2. Leave as many wells as needed in the holder. Label appropriately. Note: Bring the coated strips to room temperature before opening the pouch to avoid condensation in the wells. Place unused strips in the pouch, securely reseal and store at 2-8 C. 3. Dispense per well 100 µl of the negative and positive control in duplicate, and of the cut-off control in quadruplicate (see scheme). Use 8 wells for controls: POS (RED), Cut-off (GREEN) and NEG (YELLOW). Dispense 100 µl of each diluted patient serum (BLUE) into a well A + S1 B + S2 C - S3 D - S4 E CO S5 F CO S6 G CO S7 H CO S8 + = Positive Control CO = Cut-Off Control S1 = Diluted Sample S3 = Diluted Sample - = Negative Control S2 = Diluted Sample S4 = Diluted Sample 4. Incubate the wells in a second resealable bag or in 100% moist atmosphere for 60 minutes ± 5 minutes at 37 C ± 1ºC. 5. Prepare working strength Toxoplasma gondii-po conjugate: mix per 8-well strip 1.0 ml Conjugate dilution buffer (BLUE) with both 10 µl Toxoplasma gondii-po conjugate (100x) and 10 µl Control Antigen (100x). See scheme below. Number of 8-well strips in use Dilution scheme for preparation of Toxoplasma gondii-po conjugate Conjugate Dilution buffer (BLUE) 1 ml 2 ml 6 ml 12 ml Toxoplasma gondii- PO Conjugate (100x) 10 µl 20 µl 60 µl 120 µl Control Antigen (100 x) 10 µl 20 µl 60 µl 120 µl 6. When incubation has completed, aspirate the liquid and wash the 8-well strips 5 (five) times with wash buffer according to the washing protocol (see 7.1). 7. Dispense 100 µl per well working strength Toxoplasma gondii-po conjugate (BLUE). 8. Incubate the strips in the resealable bag or in a 100% moist atmosphere for 60 minutes ± 5 minutes at 37 C ± 1ºC. Note: In case the incubations cannot be performed in a 100% moist atmosphere, the background OD levels may rise. In that case it is advised to incubate with 150 µl working strength conjugate per well.

6 9. Wash the strips 5 (five) times with wash buffer according to the rinsing protocol (see 7.1). 10. Dispense 100 µl per well ready to use TMB. 11. Incubate for 30 minutes ± 2 minutes at room temp (18-23 C), in the dark. 12. Add 100 µl stop solution per well (colour shift: blue yellow) in the same order and the same rate as for TMB-substrate 13. Measure the absorbance of specimens with a photometer at 450 nm (optionally with a 620 nm reference filter) within 10 minutes of adding the stop solution. 8. CALCULATION OF RESULTS 8.1 Calculations 1. Calculate the mean absorbance value of the cut-off control, the positive control, the negative control and patient sera. 2. The Antibody Index of Toxoplasma gondii specific IgM is determined by dividing the absorbance value of a patient sample by the mean absorbance of the cut-off control: Toxoplasma gondii IgM Antibody Index (mean) absorbance (OD) of control or patient sample mean absorbance (OD) of the Cut-off control Note: Use not more than one decimal to express the Antibody Index. Be sure to calculate the Antibody Index from the OD-values of patient sample and Cut off control obtained in the same run and same microtitreplate! 8.2 Validation of test The following criteria must be met to validate each run. 1. Cut-off control: The mean absorbance should be between OD and Negative control: The Toxoplasma gondii-igm antibody index should be < Positive control: The Toxoplasma gondii-igm antibody index should be > 2.0 Note: If these criteria are not met, the run should be considered invalid and must be repeated. The ranges for the OD values can be seen as a guide. When OD values of a run are out of the indicated range, the validity ranges given for the Antibody Index should be considered as the ultimate criteria against which a run is considered valid.

7 8.3 Interpretation of results The Antibody Index results are interpreted as follows: RESULTS POSITIVE NEGATIVE EQUIVOCAL INTERPRETATION A serum should be considered positive for Toxoplasma gondii specific IgM antibodies when the Antibody Index is > 1.1 Interpretation needs to be done with care as indicated in section 11, Limitations of the assay. A serum should be considered negative for Toxoplasma gondii specific IgM antibodies when the Antibody Index is < 0.9. Interpretation needs to be done with care as indicated in section 11, Limitations of the assay. A serum may be considered equivocal, if the Toxoplasma gondii IgM Antibody Index is between 0.9 and 1.1. In such case it is advised to confirm the results by testing that serum again in duplicate. Ifthe repeated result is again equivocal, a second serum should be tested and judged for a change in result (as expressed in A.I.) 9. SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS When the kit is employed according to the instructions given, and the appropriate equipment is used in optimal conditions, the following performances could be reached. The performance of the kit can be expressed by different parameters namely assay precision, analytical specificity, diagnostic specificity and diagnostic sensitivity. 9.1 Assay precision Different samples containing different levels of the parameter determined, were assayed to assess repeatability and reproducibility of the assay (within- and between-assay variability). The assay precision computed on these samples gives coefficient of variation values lower then 10%. 9.2 Analytical specificity Analytical specificity may be defined as the ability of the assay to detect specific analyte in presence of potentially interfering factors in the sample matrix (e.g. anticoagulants, haemolysis, effects of sample treatment). Controlled studies of potentially interfering substances or conditions showed that the assay performance was not significantly affected by either anticoagulants (EDTA), slight haemolysis or freezing. Next to this a serum panel marked positive for IgM to various infectious agents were tested; EBV (8), CMV (11), Borrelia (17), VZV (8), HSV (10) and HAV (10). Of these potentially interfering sera, one serum marked positive for Borrelia was also tested positive in the Toxoplasma gondii IgM assay. 9.3 Diagnostic specificity Diagnostic specificity was assessed internally by testing 76 samples selected from a population expected to be negative for IgM to Toxoplasma gondii: documented non-infected (20) and blood donors (56). Diagnostic specificity is the probability of the assay procedure of scoring negative in samples of non-infected cases: TN Diagnostic specificity = TN + FP TN = True Negatives, FP = False Positives Out of 76 samples expected to be negative, the kit proved to be true negative in 75 cases and false positive in 1 case, giving a diagnostic specificity of 99%. 9.4 Diagnostic sensitivity Diagnostic sensitivity was assessed internally by testing 25 samples selected from patients documented with active or recent Toxoplasma gondii infection: a population expected to be positive for IgM to Toxoplasma gondii. Diagnostic sensitivity is the probability of the assay procedure of scoring positive in samples of infected cases: TP Diagnostic sensitivity = TP + FN TP = True Positives, FN = False Negatives Out of the 25 samples marked positive for Toxoplasma IgM 24 samples were tested true positive in the

8 Mercia Toxoplasma IgM assay and 1 false negative, therefore the diagnostic sensitivity is 96%. 9.5 Patients with a latent Toxoplasma infection The Toxoplasma IgM reactivity in patients with a latent Toxoplasma gondii infection were tested in 68 samples drawn at least 3 month after onset of symptoms. In this group, using the Mercia Toxoplasma IgM assay, 65 samples tested negative and 3 samples tested positive, or 96% of the cases were found negative for Toxoplasma IgM. 10. TRACEABILITY OF CONTROLS The level of the cut-off control as presented in this kit, represents the level as used in the clinical trials as shown above. This is organised such that a manufacturer s working reference is maintained to which manufacturer s product reference is calibrated. This manufacturer s product reference is used for validating kit performance. In this way the sensitivity and specificity of each lot represents that as shown above. 11. LIMITATIONS OF THE ASSAY Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of the specimens may affect the absorbance values of the samples with consequent alterations of IgM antibody to T. gondii levels. Diagnosis of an infectious disease should not be established on the basis of a single test result. A precise diagnosis, in fact, should take into consideration clinical history and symptoms as well as serological data. Serological data, however, have restricted value in immunosuppressed patients. The performance characteristics mentioned in section 11 are acquired with the utmost care. However, a negative result does not totally exclude a recent T. gondii infection. Therefore results need to be interpreted with caution. To estimate (active or recent) T. gondii infections by serology it is advised to test serum pairs. The second serum of a pair can be drawn days after the first serum is obtained. Each serum pair should be tested on the same day and in the same test run to allow interpretation of significant antibody level differences. It is advised to perform a combination of IgM, IgA and IgG testing. This test is suitable only for investigating single samples, not sample pools. 12. WARNINGS AND PRECAUTIONS All reagents supplied are for in vitro use only. The reagents used in the kit should be checked at all times before use. No results obtained with the kit may be trusted when the reagents have expired beyond the expiry date. No results obtained with the kit may be trusted when the reagents have been contaminated and/or particulate matter is visible in the components used. All control sera from human origin that are provided in this Toxoplasma gondii-igm test kit, have been assayed for Hepatitis B antigen, anti-hcv and anti-hiv antibodies and found negative. However, these sera must be considered as potentially infectious, and sera should be handled by appropriate procedures. The reagents included in the kit have been formulated with materials of animal origin. These materials are sourced where possible from countries that have no current status of outbreaks of TSE s or other transmittable infectious agents within cattle, or are treated during the manufacturing process in such a way as to protect personnel and preserve the performance of the device. However, the reagents must be considered as potentially infectious, and should be handled by appropriate procedures. Avoid contact of substrate, sulphuric acid, rinsing and dilution buffer with skin and mucous membranes. If these reagents come into contact with skin or mucous membranes, wash with abundant tap water. Each well is ultimately used as an optical cuvette. Therefore, do not touch the undersurface of the strips, prevent damage and dirt. Use only components that are provided in this kit: intermixing between kits may cause interpretation problems. The reagents supplied should be used only as indicated in this instruction manual. Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics in the assay laboratory. Do not pipette solutions by mouth. Avoid direct contact with all potentially infectious materials by using protective clothing such as lab coats, protective glasses and disposable gloves. Wash hands thoroughly at the end of each assay. Avoid splashing or forming an aerosol. Any reagent spill should be washed with 3% sodium hypochlorite solution and disposed of as though potentially infectious. All samples, biological reagents and materials used in the assay must be considered potentially

9 able to transmit infectious agents. Disposal should be according to local, state or national legislation. Dispose through local authority facilities or pass to chemical disposal company. Disposable ignitable materials must be incinerated; liquid waste and non-ignitable materials must be decontaminated with sodium hypochlorite at a final concentration of 3 % for at least half an hour. Liquid waste containing acid must be neutralised before treatment. Any materials to be reused must be autoclaved using an overkill approach. A minimum of one hour at 121 C is usually considered adequate, though the users must check the effectiveness of their decontamination cycle by initially validating it and routinely using biological indicators. - Thiomersal is included as a preservative in some of the components included in the kit. Thiomersal has been reported to form mercury build-up in the laboratory plumbing. To prevent build-up, flush plumbing with a large volume of water while disposing of these solutions in the sink. Stop Solution (Stopping reagent, H 2 SO 4, 0.5 M): Irritating to eyes and skin ;In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water, and seek medical advice. 13. QUICK REFERENCE PROTOCOL QUICK REFERENCE PROTOCOL FOR Toxoplasma gondii-igm EIA* PREPARATION OF REAGENTS TEST PROCEDURE A. Dilute patient test serum mix 1.0 ml dilution buffer (BLUE) + 10 µl patient test serum. 1. Dispense 100 µl per well of each control: Pos (RED) and Neg (YELLOW) in duplicate, and Cut-off (GREEN) in quadruplicate, diluted patient test sera (BLUE), and incubate 60 ± 5 minutes at 37 ± 1ºC in a resealable bag or in a 100% moist chamber. B. Prepare diluted conjugate mix per 8-well strip: 1.0 ml conjugate dilution buffer (BLUE) +10 µl Toxoplasma gondii-po conjugate (100x)+10 µl Control Antigen (100x) C. Prepare wash buffer mix per 8-well strip: 57.0 ml distilled water ml Wash Buffer (20x). 2. Wash 5 times, dispense per well 100 µl diluted conjugate (BLUE) and incubate 60 ± 5 minutes at 37 ± 1ºC in a resealable bag or in a 100% moist chamber. 3. Wash 5 times, dispense per well 100 µl substrate and incubate in the dark 30 ± 2 minutes at room temperature. 4. Add per well 100 µl stop solution and read absorbance at 450 nm (optionally with 620 nm ref). Read the entire protocol before starting the assay

10 1. INDICACIONES DE USO El kit Toxoplasma IgM EIA de Mercia es un enzimoinmunoanálisis para la detección, en el suero humano, de anticuerpos IgM específicos dirigidos contra Toxoplasma gondii en el suero humano, y se utiliza como método auxiliar para el diagnóstico de las infecciones por Toxoplasma gondii. El análisis debe realizarse estrictamente de conformidad con las instrucciones establecidas en estas instrucciones de empleo. Producto para uso únicamente por profesionales. 2. INTRODUCCIÓN La toxoplasmosis es una enfermedad generalizada que afecta a los seres humanos y a los animales, que es causada por el parásito Toxoplasma gondii. El parásito es ubicuo. En los adultos normales, la infección por lo general es asintomática. La infección maternal puede causar una toxoplasmosis congénita y puede dañar al feto en desarrollo. Por lo general, el daño es mayor cuando la infección materna se produce en las primeras fases del embarazo. Se acepta generalmente que las mujeres que son inmunes a la infección por Toxoplasma gondii antes del embarazo no transmitirán la enfermedad al feto. Sin embargo, las mujeres que contraen una toxoplasmosis primaria durante el embarazo pueden afectar al feto, lo cual puede resultar devastador para el niño en desarrollo. Para reducir la probabilidad de contraer una infección por Toxoplasma durante el embarazo, se requieren precauciones higiénicas. Así pues, es importante efectuar pruebas de detección del estado inmunitario en las fases iniciales del embarazo. El diagnóstico serológico de la infección por toxoplasmosis puede realizarse mediante la determinación de IgM y la IgA específica del Toxoplasma. Un aumento significativo de la concentración de anticuerpos IgG en dos sueros consecutivos también es un criterio diagnóstico para la toxoplasmosis reciente o activa. Los anticuerpos tipo IgM contra el Toxoplasma pueden producirse más de un año después del inicio de la enfermedad, en un porcentaje bajo (aproximadamente) 10%). Su detección también depende del tipo de prueba empleada. En los análisis de captura de IgM, la señal de IgM específica para toxoplasma disminuye antes, en comparación con los análisis indirectos. Esto permite una indicación más precisa de la infección actual o reciente. Además de los síntomas clínicos, la demostración de anticuerpos IgM contra el Toxoplasma tiene una significación diagnóstica considerable. 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO En la figura a continuación se ilustra el método para la determinación cuantitativa de IgM específica para Toxoplasma gondii. E 1. El pocillo revestido con anti-igm humana se incuba con suero humano diluido, durante 60 minutos y a 37 ºC. 2. Después de lavar con tampón de lavado, se añade antígeno purificado de Toxoplasma, conjugado con peroxidasa de rábano (conjugado), junto con el antígeno de control, que actúa como agente bloqueante. Incubación durante 60 minutos a 37 ºC. 3. Después de lavar con tampón de lavado, se añade TMB. La TMB actúa como sustrato para la peroxidasa de rábano.

11 4. Al incubar los pocillos en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente, el color del sustrato virará al azul. 5. La conversión enzimática de TMB se detiene mediante la adición de ácido sulfúrico 0,5 M. Se mide la densidad óptica con un instrumento de lectura fotométrica, a 450 nm. 3.1 Principio del ensayo El kit Toxoplasma M IgM EIA de Mercia es un análisis inmunosorbente de captura de clases de anticuerpo, que sirve para la detección, en el suero humano, de IgM específica para el Toxoplasma gondii. La fase sólida de los pocillos de las tiras de microtitulación tiene un revestimiento de anticuerpos de conejo específicos contra las cadenas µ de los anticuerpos humanos. Estos anticuerpos se unirán específicamente a las IgM humanas presentes en cada suero: captura de la IgM. Los antígenos purificados de Toxoplasma gondii (la proteína p30), marcados con enlaces covalentes con peroxidasa (conjugado), formarán complejos con la IgM capturada, específica para T. gondii. El conjugado actuará como indicador de la reacción inmunológica entre el antígeno de T. gondii en el conjugado y la IgM humana capturada, específica para T. gondii, que forma un revestimiento en los pocillos de la placa de microtitulación. La TMB, que actúa como cromógeno, inducirá un color en proporción a la cantidad de IgM capturada, específica para T. gondii. 4. REACTIVOS Y ACCESORIOS 4.1 Reactivos suministrados en el kit El kit contiene los siguientes reactivos. Puede hacerse una distinción entre los reactivos que son específicos del análisis y los reactivos universales. SÍMBOLO CÓD. CATÁL. DESCRIPCIÓN CANTIDAD CONTROL + M408B Control positivo (ROJO, listo para usar) 1,0 ml CONTROL - M408D Control negativo (AMARILLO, listo para usar) 1,0 ml CONTROL +/- M408C Control de corte (VERDE, listo para usar) 2,4 ml CONJ 100X M408F conjugado de Toxoplasma marcado con peroxidasa (concentrado a 100x) 0,2 ml MT PLATE M408A Placa de microtitulación revestida con anti-igm policlonal (96 pocillos) 1 placa CONTROL Ag M408L Antígeno de control (concentrado a 100x) 0,2 ml SUBS TMB M408G Sustrato de TMB (listo para usar) 15 ml DIL SAMP M408K Tampón de dilución (AZUL, listo para usar) 120 ml BUF WASH 20X M408E Tampón de lavado (concentrado a 20x) 60 ml SOLN STOP M408H Solución de paro (lista para usar) 15 ml DIL CONJ M408M Diluyente del conjugado (azul) 20 ml 4.2 Materiales suministrados con el kit Bolsa resellable, 2x Instrucciones de uso, 1x 4.3 Equipo y materiales necesarios pero que no se suministran Pipetas para administrar volúmenes de 10 a 1000 µl (verosimilitud, ± 2%; precisión, 1%) Material de vidrio volumétrico de laboratorio Agua desionizada (o destilada) Incubador controlado termostáticamente a 37 ± 1 ºC Tubos desechables limpios para diluir sueros de pacientes (capacidad aprox. 3 ml) Tubos desechables limpios para diluir conjugado (capacidad, 12 ml) Lavador de placas automático (opcional) con volumen de dispensación de 300 a 350 µl, ciclo de lavado = 5 veces Lector de placas de microtitulación, equipado para medir absorbancias a 450 nm (equipado opcionalmente para mediciones a longitud de onda doble, a 450 y 620 nm); intervalo de absorbancia: de 0,0 a 3,0 unidades de absorbancia Mezclador de vórtice para tubos Temporizador

12 5. COMPOSICIÓN Y MANIPULACIÓN DE LOS REACTIVOS 5.1 Reactivos específicos del kit M408B Control positivo Un vial que contiene 1,0 ml de suero humano, altamente reactivo para IgM contra T. gondii, prediluido en tampón de PBS, BSA, conservantes y colorante rojo inerte. El reactivo se suministra listo para usar. Después de usar, cerrar el tapón, volver a colocar en la caja del kit y conservar a una temperatura de 2 a 8 ºC. Si se manipula de esta manera, el control positivo caducará en la fecha indicada en la etiqueta del vial. M408D Control negativo Un vial que contiene 1,0 ml de suero humano, no reactivo para anticuerpos IgM contra T. gondii, prediluido en tampón de PBS, BSA, conservantes y colorante amarillo inerte. El reactivo se suministra listo para usar. Después de usar, cerrar el tapón, volver a colocar en la caja del kit y conservar a una temperatura de 2 a 8 ºC. Si se manipula de esta manera, el control negativo caducará en la fecha indicada en la etiqueta del vial. M408C Control de corte Un vial que contiene 2.4 ml de suero humano, con baja reactividad para anticuerpos IgM contra T. gondii, prediluido en tampón de PBS, conservantes y colorante verde inerte. El reactivo se suministra listo para usar. Después de usar, cerrar el tapón, volver a colocar en la caja del kit y conservar a una temperatura de 2 a 8 ºC. Si se manipula de esta manera, el control de corte caducará en la fecha indicada en la etiqueta del vial. M408F Conjugado Un vial que contiene 0,20 ml de antígeno de T. gondii marcado mediante enlaces covalentes con peroxidasa, tampón de PBS, BSA y conservantes. Preparar sólo la cantidad de conjugado con la potencia de trabajo necesaria para la ejecución del análisis y mantener el conjugado concentrado a una temperatura de 2 a 8 ºC. Si se manipula de esta manera, el conjugado caducará en la fecha indicada en la etiqueta del vial. Nota: El conjugado de potencia de trabajo no puede conservarse y deberá utilizarse inmediatamente después de su preparación. 5.2 Reactivos universales M408A Placa de microtitulación Placa de microtitulación (96 pocillos) con tiras rompibles de 8 pocillos, revestidas con IgG de conejo específica para la IgM humana. Las tiras están listas para usar y deberán conservarse a una temperatura de 2 a 8 ºC. Después de su apertura, volver a colocar los pocillos no usados en la bolsa de plástico resellable y almacenar en la caja del kit a una temperatura de 2 a 8 ºC. Las tiras reselladas caducan en la fecha indicada en la etiqueta de la placa de microtitulación. M408L Antígeno de control Un vial que contiene 0,2 ml de antígeno de control, obtenido a partir de células Hep-2 sometidas a sonicación, en PBS, BSA y conservantes. El reactivo deberá conservarse a una temperatura de 2 a 8 ºC. Preparar sólo la cantidad necesaria para la ejecución del análisis y mantener el antígeno de control concentrado a una temperatura de 2 a 8 ºC. Si se manipula de esta manera, el antígeno de control caducará en la fecha indicada en la etiqueta del vial. M408K Tampón de dilución El frasco contiene 120 ml de tampón de PBS, proteínas, conservantes y un colorante azul inerte. El reactivo se suministra listo para usar. Después de usar, cerrar el tapón, volver a colocar en la caja del kit y conservar a una temperatura de 2 a 8 ºC. Si se manipula de esta manera, el tampón de dilución caducará en la fecha indicada en la etiqueta del frasco. M408E Tampón de lavado El frasco contiene 60 ml de tampón PBS, Tween 20 y conservantes. El tampón de lavado está concentrado 20 veces, lo cual puede producir unos depósitos cristalinos durante la conservación prolongada a una temperatura de 2 a 8 ºC. La concentración de trabajo debe prepararse de conformidad con el protocolo. Después de usar, cerrar el tapón, volver a colocar en la caja del kit y

13 conservar a una temperatura de 2 a 8 ºC. Si se manipula de esta manera, el tampón de lavado caducará en la fecha indicada en la etiqueta del frasco. La estabilidad a la concentración de trabajo es de una semana a temperatura ambiente, o un mes a 2 a 8 ºC. M408G Sustrato de TMB (cromógeno) El frasco contiene 15ml de tetrametilbencidina en disolución orgánica. La TMB está lista para usar. La solución de cromógeno deberá conservarse en la oscuridad, a una temperatura de 2 a 8 ºC. Después de abrir el frasco, extraiga el volumen necesario y ciérrelo inmediatamente. La TMB debe mantenerse siempre alejado de la luz directa, ya que ello puede inducir una autodescoloración. Si el sustrato TMB se manipula de esta manera, tendrá la fecha de caducidad del período de validez indicada en la etiqueta del frasco. M408H Solución de paro El frasco contiene 15 ml de solución de ácido sulfúrico 0,5 M. El reactivo se suministra listo para usar. Después de usar, cerrar el tapón y volver a colocar en la caja del kit. Si se manipula de esta manera, la solución de paro caducará en la fecha indicada en la etiqueta del frasco. M408M Diluyente del conjugado El frasco contiene 20 ml de solución tamponada. El reactivo se suministra listo para usar. Después de usar, volver a colocar en la caja del kit y conservar a una temperatura de 2 a 8 ºC. Si se manipula de esta manera, el conjugado caducará en la fecha indicada en la etiqueta. 6. EXTRACCIÓN, MANIPULACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS DE SUERO Pueden utilizarse muestras de suero o plasma humano. Las muestras no deben hemolizarse ni deben contener material en partículas. Para obtener suero para la detección de anticuerpos contra T. gondii, la sangre del paciente deberá extraerse y dejarse coagular a temperatura ambiente. Centrifugar antes de 24 horas y transferir el suero a un vial. Los sueros pueden almacenarse a 4 ºC durante un período de hasta 7 días. Si el tiempo de almacenamiento es superior a 7 días, conservar a una temperatura de -20 a -70 ºC. Evítense los ciclos repetidos de congelación-descongelación. 7. PROCEDIMIENTO 7.1 Procedimiento de lavado Un lavado eficaz es un requisito fundamental de los enzimoinmunoanálisis. Es esencial que cada procedimiento de lavado se realice con cuidado a fin de obtener unos resultados entre análisis e intraanálisis reproducibles. Preparar el tampón de lavado como se indica a continuación: El tampón de lavado, concentrado a 20x, puede haber producido unos depósitos cristalinos durante la conservación prolongada a una temperatura de 2 a 8 ºC. Éstos deberán volver a disolverse dejando el frasco en reposo en un baño maría a 37 ºC, hasta que los cristales desaparezcan. Por cada tira de 8 pocillos, mezclar 3 ml de tampón de lavado (20x) con 57 ml de agua destilada. O bien, mezclar el volumen total (60 ml) del tampón de lavado (20x) con 1140 ml de agua destilada. Pueden realizarse tanto un lavado manual como un lavado con una lavadora automática de placas: Lavado manual 1. Vaciar el contenido de cada pocillo, invirtiendo completamente las tiras del soporte; a continuación, efectuar un movimiento vertical firme y breve. Mantener las tiras sujetas oprimiendo los lados del soporte de las tiras. 2. Llenar todos los pocillos hasta los bordes (300 a 350 µl) con tampón de enjuague, por ejemplo, con una pipeta de 8 canales. Téngase en cuenta el arrastre (carry-over). 3. Invertir por completo las tiras y vaciar los pocillos mediante un movimiento vertical firme y breve. 4. Este ciclo de lavado (2 y 3) deberá realizarse 5 (cinco) veces. 5. Colocar la placa invertida en toallas de papel absorbente y golpear firmemente la placa para eliminar la solución de lavado residual en los pocillos. 6. Téngase cuidado de que ninguno de los pocillos se seque antes de dispensar el siguiente reactivo. Por lo tanto, pasar inmediatamente al siguiente paso Lavado con un equipo de lavado automático de placas de microtitulación Si se utiliza un equipo automático de lavado de placas, comprobar que todas los pocillos se puedan aspirar completamente, que el tampón de lavado se dispensa con exactitud, alcanzando

14 el borde de cada pocillo durante cada ciclo de lavado. La lavadora deberá programarse para que ejecute 5 (cinco) ciclos de lavado. Después del último ciclo, eliminar el tampón de lavado de los pocillos, golpeando firmemente la placa contra toallas absorbentes. 7.2 Procedimiento del ensayo y preparación de los reactivos Nota: Antes de realizar el ensayo, llevar todos los reactivos a temperatura ambiente (18 a 23 C). Realizar todos los pasos del ensayo en el orden indicado y sin retrasos apreciables entre un paso y el siguiente. Antes de usar, verificar la fecha de caducidad. 1. Diluir sueros de pacientes ( ): mezclar 1,0 ml de tampón de dilución (AZUL) con 10 µl de suero del paciente. Después de la dilución, mezclar a conciencia con un vórtice para asegurar una mezcla adecuada. El control negativo, el control positivo y el control de corte están listos para usar y no requieren dilución adicional. 2. Dejar en el soporte los pocillos que sean necesarios. Etiquetar correctamente. Nota: Llevar las tiras revestidas a temperatura ambientes antes de abrir la bolsa, a fin de evitar la condensación en los pocillos. Colocaren la bolsa las tiras sin usar, volver a cerrar herméticamente de manera segura y almacenar a una temperatura de 2 a 8 ºC. 3. Dispensar por pocillo 100 µl de los controles positivo y negativo por duplicado, y del control de corte por cuadruplicado (ver el esquema). Usar 8 pocillos para los controles: POS (ROJO), Corte (VERDE) y NEG (AMARILLO). Dispensar en un pocillo 100 µl de cada suero diluido (AZUL) A + S1 B + S2 C - S3 D - S4 E CO S5 F CO S6 G CO S7 H CO S8 + = Control positivo CO = Control de corte S1 = Muestra diluida S3 = Muestra diluida - = Control negativo S2 = Muestra diluida S4 = Muestra diluida 4. Incubar los pocillos en una segunda bolsa resellable o en una atmósfera húmeda al 100%, durante 60 minutos, a una temperatura de 37 ± 1 ºC. 5. Preparar conjugado Toxoplasma gondii-po con potencia de trabajo: por cada tira de 8 pocillos, mezclar 1,0 ml de tampón de dilución (AZUL) con 10 µl de conjugado T. gondii-po (100x) y 10 µl de antígeno de control (100x). Ver el esquema a continuación. Esquema de dilución para la preparación del conjugado Toxoplasma gondii-po Número de tiras de 8 pocillos en uso Tampón de dilución del conjugado (AZUL) 1 ml 2 ml 6 ml 12 ml Conjugado de Toxoplasma gondii - peroxidasa (100x) 10 µl 20 µl 60 µl 120 µl Antígeno de control (100 x) 10 µl 20 µl 60 µl 120 µl 6. Una vez finalizada la incubación, aspirar el líquido y lavar las tiras de 8 pocillos 5 (cinco) veces con tampón de lavado, de conformidad con el protocolo de lavado (ver 7.1). 7. Dispensar 100 µl por conjugado de T. gondii-po de potencia de trabajo (AZUL). 8. Incubar las tiras en la bolsa resellable o en una atmósfera húmeda al 100%, durante 60 ± 5

15 minutos, a una temperatura de 37 ± 1 ºC. Nota: En caso de que las incubaciones no puedan realizarse en una atmósfera de humedad al 100%, los valores de D.O. de fondo pueden aumentar. En tal caso, se aconseja incubar con 150 µl de conjugado por pocillo. 9. Lavar las tiras 5 (cinco) veces con tampón de lavado, de conformidad con el protocolo de enjuague (ver 7.1). 10. Dispensar 100 µl por TMB list para usar. 11. Incubar durante 30 ± 2 minutos a temperatura ambiente (18 a 23 C), en la oscuridad. 12. Añadir 100 µl de solución de paro por pocillo (cambio de color: azul amarillo), en el mismo orden y a la misma velocidad que el sustrato de TMB. 13. Medir la absorbancia de las muestras con un fotómetro a 450 nm (opcionalmente, con un filtro de referencia de 620 nm), en los 10 minutos siguientes a la adición de la solución de paro. 8. CÁLCULO DE LOS RESULTADOS 8.1 Cálculos 1. Calcular el valor de la absorbancia media del control de corte, el control positivo, el control negativo y los sueros de los pacientes. 2. El Índice de Anticuerpos de la IgM específica contra T. gondii se determina dividiendo el valor de absorbancia de una muestra de un paciente por la absorbancia media del control de corte: 3. Índice de anticuerpos IgM absorbancia (media) (D.O.) del control o de la muestra contra T. gondii = absorbancia media (D.O.) del control de corte Nota: No debe emplearse más de un decimal para expresar el índice de anticuerpos. Asegurarse de calcular el índice de anticuerpos a partir de los valores de D.O. de las muestras de los pacientes y del control de corte obtenido en la misma ejecución y en la misma placa de microtitulación. 8.2 Validación de la prueba Para validar cada ejecución deben emplearse los siguientes criterios: 1. Control de corte: La absorbancia media deberá ser de D.O. 0,200 a 0, Control negativo: El índice de anticuerpos IgM contra Toxplasma gondii deberá ser < 0,7. 3. Control positivo: El índice de anticuerpos IgM contra Toxplasma gondii deberá ser > 2,0. Nota: Si estos criterios no se cumplen, la ejecución deberá considerarse no válida y debe repetirse. Los límites de los valores de D.O. deben considerarse como una guía. Si los valores de D.O. están fuera de los límites indicados, los límites de validez proporcionados para el índice de anticuerpos deberá considerarse el criterio definitivo contra el cual una ejecución se considera válida. 8.3 Interpretación de los resultados Los resultados del Índice de anticuerpos se interpretan como se indica a continuación: RESULTADOS INTERPRETACIÓN POSITIVO Un suero deberá considerarse positivo para anticuerpos IgM específicos contra T. gondii si el índice de anticuerpos es 1,1. La interpretación debe hacerse con cuidado, tal como se indica en el apartado 11, Limitaciones del ensayo. NEGATIVO Un suero deberá considerarse negativo para anticuerpos IgM específicos contra T. gondii si el índice de anticuerpos es < 0,9.

16 La interpretación debe hacerse con cuidado, tal como se indica en el apartado 11, Limitaciones del ensayo. EQUÍVOCO Un suero puede considerarse equívoco si el índice de anticuerpos IgM contra T. gondii tiene un valor de 0,9 a 1,1. En tal caso, se aconseja confirmar los resultados repitiendo la prueba del suero por duplicado. Si el resultado repetido es nuevamente equívoco, deberá examinarse un segundo suero y deberá considerarse un cambio en el resultado (expresado como índice de anticuerpos). 9. CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DEL RENDIMIENTO Si el kit se emplea con arreglo a las instrucciones proporcionadas y si se utiliza el equipo adecuado en condiciones óptimas, deberán alcanzarse los siguientes rendimientos. El rendimiento del kit puede expresarse mediante diferentes parámetros, tales como la precisión del análisis, la especificidad analítica, la especificidad diagnóstica y la sensibilidad diagnóstica. 9.1 Precisión del análisis Se analizaron muestras diferentes que contenían cantidades diferentes del parámetro determinado, a fin de evaluar la repetibilidad y la reproducibilidad del análisis (variabilidad intra y entre análisis). La precisión del análisis calculada en estas muestras da unos valores de coeficiente de variación inferiores al 10%. 9.2 Especificidad analítica La especificidad analítica puede definirse como la capacidad del análisis para detectar un analito específico, en presencia de factores con posible interferencia en la matriz de la muestra (por ejemplo, anticoagulantes, hemólisis, efectos del tratamiento de la muestra). Los estudios controlados de sustancias o condiciones con posible interferencia mostraron que el rendimiento del análisis no resultó afectado de manera significativa por anticoagulantes (EDTA), hemólisis ligera o congelación. A continuación de esto, se examinó un grupo de sueros marcados como positivos para IgM a diversos agentes infecciosos: VEB (8), CMV (11) Borrelia (17), VZV (8), VHS (10) y VHA (10). De estos sueros con interferencia potencial, un suero marcado como positivo para Borrelia también dio un resultado positivo en el análisis de IgM contra Toxoplasma gondii. 9.3 Especificidad diagnóstica La especificidad diagnóstica se evaluó de manera interna mediante el examen de 76 muestras seleccionadas de una población con un resultado esperado negativo para la IgM contra Toxoplasma gondii: no infectados documentados (20) y donantes de sangre (56). La especificidad diagnóstica es la probabilidad del procedimiento de análisis para puntuar como negativo en muestras de casos no infectados: NV Especificidad diagnóstica = NV + FP NV = negativos verdaderos; FP = falsos positivos De 76 muestras esperadas como negativas, el kit demostró dar unos resultados negativos verdaderos en 75 casos, lo cual da una especificidad diagnóstica del 99%. 9.4 Sensibilidad diagnóstica La sensibilidad diagnóstica se evaluó de manera interna mediante el examen de 25 muestras seleccionadas de pacientes con una infección comprobada, activa o reciente, por Toxoplasma gondii: una población con un resultado esperado positivo para IgM contra Toxplasma gondii. La sensibilidad diagnóstica es la probabilidad del procedimiento de análisis para puntuar como positivo en muestras de casos infectados: PV Sensibilidad diagnóstica = PV + FN PV = Positivos verdaderos; FN = Falsos negativos De las 25 muestras marcadas como positivas para IgM contra Toxoplasma, 24 muestras dieron un resultado positivo verdadero en el análisis Toxoplasma IgM de Mercia y un resultado fue falso negativo. Por lo tanto, la sensibilidad diagnóstica es del 96%. 9.5 Pacientes con infección latente por Toxoplasma Se examinó la reactividad de la IgM contra Toxoplasma en pacientes con una infección latente por Toxoplasma gondii, en 68 muestras extraídas por lo menos tres meses después del inicio de los síntomas. En este grupo, con el análisis Toxoplasma IgM de Mercia, 65 muestras dieron un resultado