Evaluación de diferentes tiempos y fuerzas g en semen equino. Caracterización del sobrenadante

Transcripción

1 Facultad de Ciencias Veterinarias -UNCPBA- Evaluación de diferentes tiempos y fuerzas g en semen equino. Caracterización del sobrenadante Ochoa, Agustín; Bruno, Santiago y Fumuso, Elida Mayo, 2016 Tandil

2 Evaluación de diferentes tiempos y fuerzas g en semen equino. Caracterización del sobrenadante Tesina de la Orientación Sanidad Animal, presentada como parte de los requisitos para optar el grado de Veterinario del estudiante: Ochoa, Agustín Simón. Tutor: Méd. Vet. Dr. Bruno, Santiago Director: Méd. Vet. Dra. Fumuso, Elida Evaluador: Méd. Vet. Dr. Cabodevila, Jorge

3 Agradecimientos Agradezco profundamente a todos aquellas personas que me han guiado y ayudado desinteresadamente. Con su tiempo, cariño, respeto, experiencia, consejos, nobleza y su confianza brindada. A todos ellos, eternamente gracias.

4 Resúmen El objetivo de este ensayo fue determinar la mejor combinación de velocidades y tiempos de centrifugación utilizados en el procesamiento de semen equino destinado a IA. A tal fin, se evaluó el sobrenadante de 27 centrifugaciones efectuadas a 312; 360; y 537 g, durante 10, 15 y 20, respectivamente. La cantidad de células espermáticas contadas se tradujeron en cantidades de dosis inseminantes (DI). Para una aceleración de 312 g, a los 10, 15 y 20, se recuperaron en el padrillo A: 2,3; 1,15 y 2,3 DI respectivamente; en el padrillo B: 1,15; 0 y 0 DI y en el padrillo C se obtuvieron 2,3; 0 y 0 DI. Para una aceleración de 360 g, a los 10, 15 y 20, se recuperaron en el padrillo A: 1,15; 0 y 1,15 DI, a los 10; 15 y 20, respectivamente; en el padrillo B: se recuperaron 0; 0 y 1,15 DI; en el padrillo C: 0; 0 y 2,3 DI, respectivamente. Para una aceleración de 537g, a los 10, 15 y 20, en el padrillo A: sólo se recuperaron 1,15 DI a los 20 ; en el padrillo B se obtuvieron 1,15; 0 y 0 DI y en el padrillo C sólo se recuperó 1,15 DI a los 10 de centrifugación. En función de los resultados preliminares obtenidos, posiblemente la mejor combinación para procesar el semen equino destinado a IA sea 360 g, durante 15 min. No obstante, teniendo en cuenta la variabilidad observada entre padrillos, resulta conveniente analizar cada caso en particular. Palabras clave: Centrifugación, semen equino, recuento, dosis inseminante

5 Índice 1. Introducción 1 2. Materiales y métodos Lugar Animales Materiales Metodología Resultados Discusión Conclusión Bibliografía.. 17

6 1. Introducción Implementar la biotecnología en los sistemas de producción permite mejorar el rendimiento y la salud animal. La producción animal, contribuye no solo a proporcionar alimentos y productos derivados, si no también animales deportivos, fuerza de tiro y obtener seguridad financiera. Después de la segunda guerra mundial, los tres grandes sectores de la zootecnia (la nutrición animal, la reproducción y la salud animal) resultaron muy beneficiados a partir de las aplicaciones de varias tecnologías, que han sido usadas ampliamente en los países en desarrollo (Uffo, 2011). Con respecto a la reproducción animal, la genética y el mejoramiento, la introducción de la inseminación artificial en la década del 30 del siglo pasado, representó el inicio de una revolución en la mejora animal tradicional. Esto cobra importancia para la especie equina, especialmente en los casos de crianza con fines deportivos y de recreación, dado que tienen una gran trascendencia económica, razón por la cual los investigadores buscan y evalúan nuevas y mejores tecnologías para esta especie (Uffo, 2011). La centrifugación del eyaculado equino es un proceso utilizado con el objetivo de extraer el plasma seminal cuando se utilizará para una criopreservación o cuando el mencionado plasma está acompañado de contaminantes, tales como, orina que poseen un efecto deletéreo sobre las gametas. En este proceso de centrifugación se pierde un considerable número de espermatozoides viables, debido a que, una vez detenida la centrífuga, las gametas más vigorosas, migran del pellet hacia el sobrenadante (conocido como efecto SWIM UP) y a las propias fallas de la técnica. Según Canisso et al., 2008, los procedimientos utilizados para el congelamiento de semen de équidos implican el examen andrológico, colecta de semen, evaluación seminal, dilución, centrifugación, desecho del sobrenadante, resuspención del pellet con diluyente de congelamiento, envasado, refrigeración, estabilización del semen, congelamiento y evaluación seminal post-descongelado (Papa, 1987 citado por Canisso et al., 2008). Hasta el momento no existe un 1

7 procedimiento estandarizado para cada una de estas etapas, de allí que exista mucha variación entre los resultados experimentales y los procedimientos rutinarios de campo (Canisso et al., 2008). Si bien, la centrifugación es un proceso obligatorio para el congelamiento de semen de équidos, no es un proceso inocuo al espermatozoide. La centrifugación puede inducir la peroxidación lipídica de las membranas espermáticas (Raphael, 2007), por lo que se recomiendan fuerzas de centrifugación leves (400 a 600 g) por 15 (extremos de 10 a 20 ) (Amann y Pickett, 1987; Papa, 1987; Arruda 2000; Alvarenga 2002; Serres et al., 2002; Papa et al 2005 citados por Canisso et al 2008). Según la técnica de congelamiento descripta por Varner, y Blanchard, 2005; el cuarto paso de la técnica consiste en la centrifugación del semen a g por 5-15 a una temperatura ambiente de 25 C, para minimizar daños en los espermatozoides. Rota et al., 2007; describen la utilización de 5 ml de semen en 10 ml de extender el cual centrifugaron por 10 a 700g para luego resuspender los espermatozoides para la criopreservación. Neild et al., 2005 utilizaron semen diluido 1:1 con yema de huevo a modo de extender a 37 C y centrifugaron por 20 a 900g. Loomis, 1986, luego de diluir el semen sedimentaron las células espermáticas durante un centrifugado a 300g por y de esa forma se removió el plasma seminal. Gomes et al., 2002, utilizaron un eyaculado con una motilidad inicial de 60% el cual fue diluido 1:1 con extender a base de leche y centrifugado a 600g por 10 para luego remover el sobrenadante y continuar el proceso hacia la criopreservación. Neild et al., 2006, trabajaron con espermatozoides recuperados de la porción distal del epidídimo diluidos con 20 ml de extender Kenney con ticarcilina y el preparado fue centrifugado a 800g y re diluido en un extender a base de lactosa-edta-glucosayema de huevo y dimetil formamida. Varela et al., 2015, centrifugaron el semen a 1200g por 15 min y el sobrenadante fue descartado, práctica utilizada de rutina. 2

8 Yates y Whitacre (1993) demostraron que en condiciones ideales, se requiere un mínimo de 100 millones de espermatozoides progresivamente móviles, para obtener una eficiencia reproductora máxima, y que no se observa aumento en la fertilidad cuando se inseminan más de 500 millones de espermatozoides. En condiciones, no ideales, la inseminación con 500 millones de espermatozoides progresivamente móviles asegura la máxima eficiencia reproductiva y permite un pequeño margen de error en la evaluación del semen y en la reducción de la movilidad (Yates y Whitacre, 1993). Como se puede observar, en la literatura anteriormente citada, no se menciona una combinación entre tiempo y velocidad estandarizada para la centrifugación del semen equino. Así surge como objetivo de este ensayo, determinar la mejor combinación de velocidades y tiempos. A tal fin, se evaluó el sobrenadante de 27 centrifugaciones efectuadas a 312; 360; y 537 g, durante 10, 15 y 20 respectivamente. 3

9 2. Materiales y métodos 2.1. Lugar El ensayo se llevo a cabo en un haras ubicado en el partido de Tandil, provincia de Buenos Aires Animales Se utilizaron 3 yeguas Silla Argentino como súcubo y se utilizaron 3 padrillos raza silla Argentino, de 5 años de edad. Los animales se encontraban estabulados y alimentados con balanceado Materiales Colecta y filtrado de semen -Vagina artificial modelo Missouri con envase colector -Filtros de celulosa 150 x 60 mm Minitube -Gel lubricante estéril no espermicida Priority Care -Agua 55 C -Guantes descartables Extender y dilución -Dextrosa (anhidra) para análisis -Leche en polvo descremada 0% grasa sin aditivos -Agua destilada estéril -Balanza 200 x 0.1 g -Probeta graduada 250 ml -Jeringa y aguja descartable 4

10 Centrifugación -Centrifugadora Rolco Modelo Tubos Falcon 50 ml Visualización y recuento -Microscopio óptico Minitube, binocular de contraste de faces, con oculares de 10x, 40x y 100x -Cámara de Neubauer -Portaobjetos -Cubreobjetos -Tubos Falcon de 14 ml -Micropipetas en 20 µl -Tips descartables -Solución salina formolada 2.4. Metodología En este ensayo se evaluó: la calidad del semen de tres padrillos en términos de: Volumen, cantidad de espermatozoides y motilidad espermática en cada eyaculado. A su vez luego de la centrifugación a partir del sobrenadante se calculó la motilidad y la cantidad de espermatozoides de acuerdo a la siguiente metodología: 5

11 Colecta de semen Se seleccionaron yeguas receptivas a la monta. Se preparó la vagina artificial a 55 C lubricada y simultáneamente con la ayuda de dos operarios se realizaba la extracción de semen. Filtrado de gel Retirado el envase colector de la vagina se quitaba el filtro de celulosa, quedando solamente el semen. Recuento y evaluación de motilidad en semen puro Se tomaron 0,20 µl de semen puro y se colocaron en 4 ml de solución salina formolada. Luego de realizar una homogeneización manual se hizo el recuento en la cámara de Neubauer. El conteo se realizó detectando espermatozoides en 5 cuadrículas de la cámara. Luego se sumaron los espermatozoides (spz) observados y se realizó la multiplicación por (spz x mm 3 ) y luego se multiplicó por para obtener spz por ml. El objetivo de este conteo fue corroborar la calidad del eyaculado al momento cero. Dilución en partes iguales con extender Kenny El extender se preparó previo a la extracción del semen. Se utilizaron 100 ml de agua destilada estéril, 4,9 gr de dextrosa y 2,4 gr de leche en polvo. Al eyaculado se le agregó la misma cantidad en ml del extender. Esta dilución se dividió en tres partes iguales, de 25 ml a modo de estandarizar, pues no todos los eyaculados eran del mismo volumen. Centrifugación Las centrifugaciones fueron realizadas a tres velocidades 312g (1500 rpm), 360g (1800rpm) y 537g (2000 rpm) durante 10, 15 y 20. Radio del rotor de la centrífuga 12 cm. 6

12 Obtención de sobrenadante para recuento y evaluación de la motilidad progresiva espermática Terminada la centrifugación se formó un pellet de espermatozoides en la base del tubo. Con la ayuda de una micropipeta se tomaron 20 µl de sobrenadante en las proximidades al pellet. Se observó si existían o no espermatozoides, en caso de hallarlos se evaluaba su motilidad progresiva. Luego, nuevamente se tomaron 20µl de sobrenadante de la misma manera y se realizó el recuento en la cámara de Neubauer. Fórmula utilizada para calcular dosis inseminante Luego de la centrifugación, se realizó el conteo de espermatozoides (spz) en sobrenadante Cálculo en la cámara de Neubauer: Concentración: Total de células contadas x Número de cuadrados spz contados en la cámara x = X spz mm 3 X spz mm 3 x = X spz cm 3 1cm 3 de sobrenadante.....x spz cm 3 X cm 3 de sobrenadante centrifugados..x= X spz totales por centrifugado X cantidad de muestras centrifugadas.. X spz totales X cantidad de muestras totales del eyaculado.x spz totales del eyaculado 1 dosis inseminante criopreservada contiene alrededor de spz como se mencionó en la introducción. En el sobrenadante evaluado se contaron X cantidad de spz X cantidad de spz totales = X dosis inseminante perdidas spz 7

13 3. Resultados A continuación se detallan en forma individual los resultados obtenidos para cada padrillo en las diferentes velocidades y tiempos. Padrillo: A 1) Evaluación del semen puro previo a su procesamiento Volumen en Motilidad Espermatozoides Muestras ml espermática en semen puro de 25 ml Eyaculado % cm 3 3 Eyaculado % cm 3 3 Eyaculado % cm 3 3 2) Motilidad progresiva espermática en sobrenadante tiempo velocidad Padrillo A 312 x g (eyaculado1) 360 x g (eyaculado 2) 60% 60% 20% 20% - 20% 537 x g (eyaculado 3) - - 0% 8

14 3) Recuento espermático en sobrenadante tiempo velocidad Padrillo A 312 x g (eyaculado1) 360 x g (eyaculado 2) 2 spz 1 spz 2 spz 1 spz - 1 spz 537 x g (eyaculado 3) spz *Spz= espermatozoides 9

15 Padrillo: Padrillo B 1) Evaluación del semen puro previo a su procesamiento Volumen en Motilidad Espermatozoides Muestras ml espermática en semen puro de 25 ml Eyaculado % cm 3 3 Eyaculado % cm 3 3 Eyaculado % cm 3 3 2) Motilidad progresiva espermática en sobrenadante tiempo velocidad Padrillo B 312 x g (eyaculado1) 360 x g (eyaculado 2) 10% % 537 x g (eyaculado 3) 10 %

16 3) Recuento espermático en sobrenadante tiempo velocidad Padrillo B 312 x g (eyaculado1) 360 x g (eyaculado 2) 1 spz spz 537 x g (eyaculado 3) 1 spz 0 spz 0 spz 11

17 Padrillo: Padrillo C Con este padrillo, se trabajó con dos eyaculados en lugar de tres, debido a que, el volumen de los mismos fue suficiente para las 9 muestras. 1) Evaluación del semen puro previo a su procesamiento Volumen en ml Motilidad Espermatozoides Muestras de espermática en semen puro 25 ml Eyaculado % cm 3 6 Eyaculado % cm 3 3 2) Motilidad progresiva espermática en sobrenadante tiempo velocidad Padrillo C 312 x g (eyaculado1) 360 x g (eyaculado 2) 20% % 537 x g (eyaculado 3) 10 %

18 3) Recuento espermático en sobrenadante tiempo velocidad Padrillo C 312 x g (eyaculado1) 360 x g (eyaculado 2) 1 spz spz 537 x g (eyaculado 3) 1 spz

19 Pérdidas de dosis inseminante en sobrenadante Padrillo A Padrillo B Padrillo C 312 g x 10 2,3 dosis 1,15 dosis 2,3 dosis 312 g x 15 1,15 dosis g x 20 2,3 dosis - - Padrillo A Padrillo B Padrillo C 360 g x 10 1,15 dosis g x g x 20 1,15 dosis 1,15 dosis 2,3 dosis Padrillo A Padrillo B Padrillo C 537 g x 10-1,15 dosis 1,15 dosis 537 g x g x 20 1,15 dosis

20 4. Discusión Al centrifugar una muestra de semen es muy importante tener en cuenta el tiempo y las velocidades para que no se afecten las células espermáticas en calidad y cantidad. En el presente trabajo, se realizó el recuento de los espermatozoides que permanecen en el sobrenadante luego de la centrifugación, debido a que, normalmente éste se desecha, sin tener en cuenta que el mismo puede ser un marcador interesante para la evaluación de la eficiencia del proceso de centrifugación. Las velocidades y tiempos que se utilizaron en este ensayo, coinciden con lo recomendado para separar los espermatozoides del semen, minimizando los daños y mejorando así la calidad espermática (Amann y Pickett, 1987; Papa, 1987; Arruda 2000; Alvarenga, 2002; Serres et al., 2002; Papa et al 2005 citados por Canisso et al 2008). Se trabajó en base a fuerzas de centrifugación leves (400 a 600 g) durante 15 con extremos de 10 a 20. Sin embargo en este ensayo al centrifugar durante 20, se observó una tendencia a la disminución de la motilidad progresiva de los espermatozoides del sobrenadante, si bien no se evaluó la motilidad progresiva del semen, esto indicaría tal vez, que el tiempo de centrifugado podría ser proporcional al daño en los espermatozoides. Lo que podría explicarse a partir de lo observado por Urrego (2008), quién describe un aumento del daño en la membrana plasmática de los espermatozoides centrifugados a medida que aumenta la velocidad de centrifugación. De los tres padrillos dos tuvieron una adecuada respuesta a las centrifugaciones de 15 a 360 y 537g en cuanto a que no se detectaron espermatozoides en el sobrenadante. Se generó una inconsistencia en los resultados de motilidad progresiva a 537g a los 20 en el padrillo A. En base a esto sería necesario confirmar este hallazgo en mediciones repetidas en días consecutivos y en un número mayor de padrillos. 15

21 5. Conclusión En función de los resultados preliminares obtenidos, posiblemente la mejor combinación para procesar el semen equino destinado a IA sea 360 g, durante 15 min. No obstante, teniendo en cuenta la variabilidad observada entre padrillos, resulta conveniente analizar cada caso en particular. 16

22 5. Bibliografía Canisso, I.F; Souza, F.A; Ortigoza Escobar, G.M; Ribeiro de Carbalho, G; Davies Morel, M. C.; Capistrano Dasilva; E; Gimaraes, J.D; Linaresh Lima, A. (2008). Congelamiento de semen de burro (Equus asinus) Revista Internacional vet Perú 2008; 19, (2): Gomes, G.M; Jacob, J.C.F; Medeiros, A.S.L; Papa, F.O; Alvarenga, M.A. (2002). Improvement of stallion spermatozoa preservation with alternative cryoprotectans for the Mangalarga Marchador breed. Theriogenology 58: Loomis, P.R. (1986). Techniques and applications of artificial insemination with frozen equine semen. Equine Veterinary Science, 6 (3): Neild, D.M; Brouwers, J.F.H.M; Colenbrander, B; Aguero, A y Gadella, B. M. (2005). Lipid peroxide formation in relation to membrane stability of fresh and frozen thawed stallion spermatozoa. Molecular Reproduction and Development Neild, D; Miragaya, M; Chaves, G; Pinto, M; Alonso, A; Gambarotta, M; Losinno, L; Aguero, A. (2006). Cryopreservation of cauda epididymitis spermatozoa from slaughterhouse testicles 24 h after ground transportation. Animal Reproduction Science 94, Raphael, CF. (2007). Efeitos da centrifugação nas características de movimento, integridade e peroxidação lipídica das membranas do espermatozóide eqüino refrigerado. Dissertação de Mestrado. São Paulo: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo. 111 p Rota, A; Magelli, C; Panzani, D; Camillo, F. (2007). Effect of extender, centrifugation and removal of seminal plasma on cooled preserved Amiata donkey spermatozooa. Theriogenology 69, Uffo O. (2011). Producción animal y Biotecnologías pecuarias: nuevos retos. Rev. Salud Anim. Vol. 33 No. 1:

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