Control biológico de enfermedades fúngicas en postcosecha de pera Rocha

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1 Control biológico de enfermedades fúngicas en postcosecha de pera Rocha 2 revista de Fruticultura Especial 2015

2 POSCOSECHA RESUMEN La podredumbre azul causada por Penicillium expansum es una de las enfermedades más importantes en postcosecha de pera Rocha y causa pérdidas económicas considerables. El uso de fungicidas sintéticos es el principal método utilizado para reducir estas pérdidas. Sin embargo, la creciente preocupación con el impacto de los fungicidas sobre la salud humana y el medio ambiente torna necesario el desarrollo de nuevas estrategias más seguras. El control biológico mediante el uso de antagonistas microbianos y compuestos naturales ha demostrado ser una alternativa prometedora. En este trabajo, Aureobasidium pullulans reveló una importante actividad antagonista tanto in vitro como in vivo sobre P. expansum. Con el objetivo de aumentar su eficacia, el antagonista también fue combinado con compuestos antifúngicos naturales tales como quitosano, extractos de plantas aromáticas y aceites esenciales. Palabras clave: Podredumbre azul, Antagonistas, Control biológico, Calidad postcosecha, Fungicidas naturales. ABSTRACT Biological control of postharvest diseases in Rocha pear. Blue mold decay caused by Penicillium expansum is one of the most important postharvest diseases in Rocha pear, causing considerable economic losses. The use of synthetic fungicides has been the main method used in managing this postharvest decay. However, the rising concern for health risks and environmental pollution due to the use of chemicals makes necessary the development of new and safer strategies. Biological control using microbial antagonists and natural compounds has proved to be a promising alternative to chemicals in fighting decays. The yeastlike fungus Aureobasidium pullulans revealed an important biocontrol activity both in vitro and in vivo of P. expansum. Aiming at increasing its biocontrol efficacy, the antagonist A. pullulans was also used in combination with natural antifungal compounds such as chitosan, aromatic plant extracts or essential oils. Key words: Blue mold, Antagonists, Biological control, Postharvest quality, Biofungicides. C. SÁNCHEZ LARA Doctora en Biología. Investigadora Auxiliar. Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária, I.P. (INIAV), Oeiras, Portugal. En la actualidad, las enfermedades de conservación de los frutos constituyen uno de los principales estrangulamientos en lo que respecta a su comercialización y consumo. Existen datos que demuestran que aproximadamente un 25% de la producción total de frutos en los países industrializados se pierde debido a plagas y enfermedades que aparecen tanto en el campo como durante el transporte y la conservación (Spadaro y Gullino, 2004). En países en desarrollo estas pérdidas son aún más elevadas, como consecuencia de la falta de infraestructuras y condiciones adecuadas. Hasta el momento, el manejo tradicional y más eficaz de este problema consiste en la aplicación de fungicidas sintéticos, tanto en el campo como en postcosecha (Mari et al., 2014). No obstante, la creciente preocupación mundial relacionada con las consecuencias a nivel de salud humana y contaminación ambiental derivadas del uso excesivo de químicos, así como el desbalance ecológico provocado por estos compuestos: efectos nocivos sobre enemigos naturales, aparición de microorganismos resistentes, resurgimiento de plagas secundarias, alteraciones de la microbiota del suelo, etc.; hacen que sea necesario un cambio urgente de actitud en el sentido de incrementar la utilización de compuestos ecológicos. Los hongos patogénicos son los principales responsables de las enfermedades de postcosecha en pomóideas y causan una reducción drástica del período de almacenamiento y comercialización. En las peras, las podredumbres típicamente aparecen después de 3 4 meses de conservación en frío y aumentan considerablemente durante largos períodos de conservación. En el caso particular de la pera Rocha, producto de gran importancia económica en revista de Fruticultura Especial

3 Figura 1. Podredumbre azul causada por Penicillium expansum. Portugal, las podredumbres azul y gris causadas por Penicillium expansum y Botrytis cinerea, respectivamente, son las que merecen especial atención debido al elevado grado de incidencia y frecuencia con que aparecen (Figura 1). La pera Rocha es considerada la reina de la fruticultura portuguesa y su producción está concentrada en la región Oeste de Portugal, desde Sintra hasta Leiria. El primer peral de esta variedad, con frutos de calidad fuera de lo común, fue identificado hace más de 170 años en el Concejo de Sintra, en la propiedad del señor Pedro António Rocha, y su denominación actual es Pera Rocha do Oeste (Figura 2). Según datos de la Asociación Nacional de Productores de pera Rocha (ANP), existen actualmente hectáreas de pera y la producción anual alcanzó las toneladas en Según esta misma fuente, el volumen de pera exportada representa actualmente cerca del 50% de la producción nacional total. En este contexto, tanto productores como agentes comerciales, están cada vez más preocupados con las considerables pérdidas que se registran en cada campaña como consecuencia de las podredumbres. Esta situación tiende a agravarse como consecuencia de la reducida disponibilidad en los mercados de pesticidas homologados y a la legislación de países europeos y asiáticos, cada vez más exigente y restrictiva en relación a los residuos mínimos tolerados, lo que incrementa considerablemente las dificultades para exportar frutas para estos países. En respuesta a esta problemática, el Grupo de Postcosecha del Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinaria (INIAV) se ha dedicado en los últimos años al estudio de soluciones alternativas eficientes para el control de enfermedades de postcosecha en peras, particularmente en pera Rocha. Antagonistas microbianos En las últimas décadas han sido realizados diversos estudios en el área del control biológico, destacándose la utilización de antagonistas microbianos como una de las estrategias más efectivas para reducir la incidencia de podredumbres durante el periodo de conservación de los frutos (Droby et al., 2009; Sharma, 2009; Mari et al., 2014). Básicamente existen dos metodologías para la utilización de agentes microbianos: (1) uso de mi- 4 revista de Fruticultura Especial 2015

4 POSCOSECHA Figura 2. Pera Rocha do Oeste DOP (Denominación de Origen Protegida). croorganismos naturalmente existentes en la superficie de frutos, hojas y ramos (microorganismos epífitos), los cuales pueden ser aislados, multiplicados y reintroducidos de manera controlada; y (2) introducción artificial de microorganismos antagonistas de los patógenos. Para ser considerado un buen agente de control biológico, el potencial antagonista debe reunir las siguientes características: ser efectivo en bajas concentraciones, no ser nutricionalmente muy exigente, no producir compuestos secundarios tóxicos, ser capaz de sobrevivir en condiciones adversas, ser eficiente contra diversos patógenos y muy importante, no producir ningún tipo de toxicidad en los frutos. Diversas cepas bacterianas y levaduras parecen reunir varias de estas propiedades, motivo por el cual su utilización ha sido ampliamente estudiada para el control biológico de enfermedades de conservación de los frutos (Janisiewicz and Bors, 1995; Chalutz y Droby, 1998; Zhang et al., 2005; Nunes et al., 2007). En estudios previos realizados en nuestros laboratorios, 32 microorganismos fueron aislados de la superficie de frutas y hojas de perales cultivados en Alcobaça, región Centro Oeste de Portugal (Figura 3) (Borges et al., 2004). El material vegetal fue lavado con agua destilada estéril, mediante agitación, y posteriormente el agua de los lavados fue inoculada en placas de Petri con medio de cultivo PDA (Potato Dextrose Agar) e incubadas durante 48h a 25ºC. A continuación se procedió al aislamiento de las colonias y clasificación de los microorganismos en base a sus características morfológicas y bioquímicas. Entre estos agentes estudiados, uno de los más interesantes fue el hongo levaduriforme Aureobasidium pullulans, que evidenció una importante actividad antagonista, tanto in vitro como in vivo, frente a Penicillium expansum y Botrytis cinerea. Para determinar la capacidad antagonista in vivo de A. pullulans, las peras fueron desinfectadas con una solución de hipoclorito de sodio (0,5%), enjuagadas y secadas al aire. Posteriormente se realizaron revista de Fruticultura Especial

5 Figura 3. Peral de la variedad Rocha cultivado en la Estação Nacional de Fruticultura Vieira Natividade INIAV (Alcobaça, Portugal). 6 revista de Fruticultura Especial 2015

6 POSCOSECHA CUADRO 1. Actividad de biocontrol de A. pullulans en peras Rocha artificialmente heridas e inoculadas con P. expansum y B. cinerea, después de 7 días de conservación a temperatura ambiente. Concentración de A. pullulans (UFC/ml) Concentración 0,0 1,0x10 6 3,2x10 7 del patógeno (conidios/ml) Incidencia Diámetro lesión Incidencia Diámetro lesión Incidencia Diámetro lesión % (mm) % (mm) % (mm) P. expansum ,9 20 4,0 7 0, ,4 43 7,3 33 4, , , ,2 B. cinerea ,2 0 0,0 0 0, ,0 40 8,3 45 7, , , ,8 2 heridas/fruto, con un diámetro y una profundidad de 4x4mm y a una distancia de 1cm de la zona ecuatorial del fruto. Las heridas fueron inoculadas con el antagonista y 2 horas después con los patógenos, en diferentes concentraciones. Después de 7 días a temperatura ambiente (condiciones de conservación comercial o shelf life) los resultados mostraron que A. pullulans, en todas las concentraciones estudiadas, inhibió el desarrollo de las podredumbres provocadas por los dos patógenos (Cuadro 1). El desarrollo de P. expansum en una concentración de 10 3 conidios/ml fue prácticamente controlado en ambos tratamientos con el antagonista. Para las concentraciones más elevadas del patógeno, se observó una disminución del tamaño de las heridas de aproximadamente 70 y 75%. El crecimiento de B. cinerea en una concentración de 10 3 conidios/ml fue totalmente inhibido y en heridas infectadas con una suspensión de 10 4 conidios/ml hubo una reducción del tamaño de las mismas de cerca de 70%, para ambos tratamientos con el antagonista. Estos resultados evidenciaron que A. pullulans representa una alternativa eficaz para el control de enfermedades de postcosecha en pera Rocha. En experimentos recientes se comprobó una eficacia superior a 85% en la reducción del tamaño de las heridas infectadas con P. expansum 10 4 conidios/ ml tratadas con una suspensión del antagonista en una concentración de 10 8 UFC/ml (Figura 4). Otra característica muy interesante es la elevada resistencia de A. pullulans en las condiciones de conservación de la pera Rocha, es decir en cámaras con bajas temperaturas (-0,5 1ºC) y atmósferas controladas (elevadas concentraciones de dióxido de carbono y niveles muy reducidos de oxígeno), lo que es fundamental para ser considerado un potencial biofungicida de postcosecha (Sánchez et al., 2012). En los estudios realizados se demostró que el antagonista es capaz de sobrevivir en la superficie de las peras durante largos períodos de conservación bajo temperaturas de 1ºC. Es importante resaltar que después de 5 meses en estas condiciones, no se evidenciaron síntomas de toxicidad en peras artificialmente heridas y posteriormente sometidas a inmersión en una suspensión del antagonista, lo que demuestra la inocuidad de este antagonista para los frutos (Figura 5). Sustancias antifúngicas naturales Uno de los problemas identificados en relación a los antagonistas microbianos, y que representa un factor limitante para la utilización masiva de los mismos, es su baja eficiencia intrínseca asociada a la inconsistencia y falta de reproducibilidad de los resultados en condiciones comerciales. No obstante, en los últimos años el concepto de control biológico cambió significativamente, considerando no sólo la utilización de antagonistas microbianos para el combate de los patógenos sino también otros métodos físicos y químicos de control de las enferme- revista de Fruticultura Especial

7 Figura 4. Actividad antagonista in vivo de A. pullulans sobre P. expansum. Peras inoculadas con P. expansum (superior) y con P. expansum + A. pullulans (inferior). dades de postcosecha. Esto abrió la puerta a un gran número de alternativas y estrategias integradas de control biológico. De este manera, y con el objetivo de incrementar la eficiencia de biocontrol del antagonista A. pullulans, se realizaron estudios paralelos consistentes en suplementar las suspensiones del antagonista con sales minerales, específicamente con sales de calcio, y con sustancias antifúngicas naturales de origen vegetal o animal. Los resultados obtenidos mediante adición de soluciones de calcio a la suspensión de A. pullulans mostraron un incremento acentuado de la bio eficacia del antagonista frente a P. expansum (Ferreira Pinto et al., 2008). De la misma manera, la substitución de los fungicidas sintéticos por extractos de plantas y/o de aceites esenciales está siendo ampliamente estudiada. Estos compuestos, considerados GRAS (genera- 8 revista de Fruticultura Especial 2015

8 POSCOSECHA Figura 5. Aspecto de las peras artificialmente heridas y seguidamente tratadas con una suspensión del antagonista A. pullulans, después de 5 meses de conservación en cámaras refrigeradas. Las heridas no muestran ningún síntoma de toxicidad. lly regarded as safe), presentan una menor agresividad frente al medioambiente y son mejor aceptados por el consumidor. En estudios preliminares realizados en nuestros laboratorios, fueron analizados diferentes extractos de plantas aromáticas, tales como orégano (Origanum vulgare), menta (Mentha pulegium), cilantro (Coriandrum sativum) y ajedrea (Satureja montana). Estos extractos fueron seleccionados entre varios analizados, en función de su composición química y del elevado contenido de sustancias bioactivas. Los estudios in vitro mostraron resultados prometedores para el uso de estos compuestos como agentes de biocontrol de P. expansum. Sin embargo, cuando los extractos fueron analizados en experiencias in vivo, no se observó ningún efecto ventajoso resultante de la combinación con A. pullulans, con excepción del extracto de orégano. El extracto de Origanum vulgare, así como uno de sus constituyentes principales, el ácido caprílico, mostraron ser eficaces para reducir el crecimiento de P. expansum en las heridas de las peras (Figura 6) durante las primeras 96 h después de la infección (Matos et al., 2012). No obstante, después de 120h a temperatura ambiente esa ventaja comienza a disminuir, probablemente por el hecho de que también comienza a ser afectada la actividad del antagonista. Recientemente, se verificó el aumento significati- revista de Fruticultura Especial

9 FIGURA 6. Control del crecimiento de P. expansum (20µl, 10 4 conidios/ml) observado en peras tratadas con 25µl de A. pullulans (10 8 UFC/ml) + 10µl de ácido caprílico en diferentes concentraciones: 10x10 4 (C1), 25x10 4 (C2) y 50x10 4 (C3), 96 h después de la inoculación. Los resultados expresan la reducción del diámetro de las heridas comparado con el control M1 (P. expansum + H 2 O). vo de la eficiencia del ácido caprílico en tratamientos profilácticos, comparativamente con los tratamientos curativos descritos anteriormente. Otro compuesto estudiado para el control de la podredumbre azul en pera Rocha es el quitosano. Este compuesto, también llamado chitosán (del griego coraza ), es un polisacárido lineal que se obtiene comercialmente mediante la desacetilación alcalina de la quitina, que es un elemento estructural del exoesqueleto de crustáceos, como por ejemplo cangrejos, gambas y langostas; así como también de insectos. El quitosano es ampliamente utilizado en farmacéutica, medicina, agricultura y en la industria alimentaria debido a interesantes características tales como biodegradabilidad, biocompatibilidad, bajo o nulo índice de toxicidad, propiedades antimicrobianas y antioxidantes, capacidad de formar biofilmes, etc. En el caso particular de la agricultura, este compuesto ha recibido una mayor atención por parte de la comunidad científica debido a sus propiedades antifúngicas. En estudios in vitro, el quitosano mostró un marcado efecto inhibidor sobre P. expansum (Figura 7) y un reducido efecto en A. pullulans. En tratamientos curativos in vivo, contrariamente a lo esperado, no fue posible verificar ningún efecto positivo derivado de la combinación de quitosano con el antagonista (Marques, 2012). Aparentemente en las peras (in vivo) el efecto inhibidor del quitosano sobre el antagonista es superior, reduciendo así su eficacia de biocontrolo. Por otro lado, en los tratamientos en los cuales se utilizó quitosano como único agente de control, se observó una reducción del diámetro de las heridas directamente relacionada con la dosis de quitosano utilizada. En peras tratadas con una solución 1% de quitosano, después de 7 días a temperatura ambiente, se obtuvo una eficacia máxima en la reducción del tamaño de las heridas de aproximadamente 10%. Estos resultados indican que para que la enfermedad sea más eficientemente controlada deben usarse concentraciones superiores a las evaluadas. Por otro lado, resultados recientes demuestran que tratamientos profilácticos con soluciones de quitosano son significativamente más eficientes que los tratamientos curativos, lo que parece indicar que uno de los principales modos de acción del quitosano contra el patógeno es la inducción de mecanismos de resistencia en el fruto. Desafíos futuros Los resultados obtenidos hasta el momento demuestran que la cepa de A. pullulans aislada de la superficie de pera Rocha controla la podredumbre azul en esta variedad de peras. No obstante, el mejor conocimiento de los mecanismos de acción de este antagonista, así como la combinación con otros agentes, sustancias o métodos de control biológico permitirá aumentar la eficacia del mismo. Actualmente se están estudiando los efectos de tratamientos de precosecha con formulaciones de A. pullulans o con compuestos antifúngicos naturales, para reducir la carga de microorganismos patógenos de la fruta y así aumentar la eficacia del antagonista usado en postcosecha. Otra estrategia consiste en la utilización de diferentes técnicas culturales durante la producción, cara a de obtener frutos menos sensibles a la pudrición, como por ejemplo peras con más calcio, menos nitrógeno o mayor contenido de compuestos fenólicos. Finalmente podemos concluir que el éxito del control biológico de enfermedades de postcosecha se basa en el desarrollo de estrategias integradas en las que se combinen diversos métodos independientes. Agradecimientos Este trabajo ha sido financiado con proyectos de la Fundação para a Ciência e Tecnologia (PPCDT/ 10 revista de Fruticultura Especial 2015

10 POSCOSECHA FIGURA 7. Crecimiento de las colonias de P. expansum en medio con diferentes concentraciones de quitosano, después de 6 días de incubación a 25ºC. AGR/59270/2004 y PTDC/AGR ALI/118477/2010) de Portugal. La autora agradece la colaboración científica de María da Graça Barreiro y la asistencia técnica de Paula Vasilenko y Mário Santos. Bibliografía BORGES, M.; PEDRO, J.M.; BARREIRO, M.G Biological control of postharvest decay with epiphytic microorganisms of Rocha pear. Proc. IV Simpósio Ibérico de Maturação e Pós colheita 2004, EAN, Oeiras, Portugal, 6 9 October, pp CHALUTZ, E.; DROBY, S Biological control of postharvest disease. In: Boland, G.J., Kuykendall, L.D. (Eds.), Plant Microbe Interactions and Biological Control. Marcel Dekker, New York, USA, pp DROBY, S.; WISNIEWSKI, M.; MACARISIN, D.; WILSON, C Twenty years of postharvest biocontrol research: Is it time for a new paradigm? Postharvest Biol. Technol. 52: FERREIRA PINTO, M.M.; MOURA GUEDES, M.C.; SANTOS, M.R.; SILVA, M.J.; BARREIRO, M.G.; SANTOS, M The antagonistic activity of Aureobasisium pullulans to reduce blue mold in Rocha pear. ISHS Acta Hort. 800: X International Pear Symposium, pp JANISIEWICZ, W.J.; BORS, B Development of a microbial community of bacterial and yeast antagonists to control wound invading postharvest pathogens of fruits. Applied and Environmental Microbiology 61, NUNES, C.; USALL, J.; TEIXIDÓ, N.; ABADIAS M.; VIÑAS, I Pre harvest application of a combined treatment of Candida sake (CPA 1) and Pseudomonas syringae (CPA 5) to control postharvest decay of pome fruits. Bulletin OILB 30: MARI, M., DI FRANCESCO, A.; BERTOLINI, P Control of fruit postharvest diseases: old issues and innovative approaches. Stewart Postharvest Review 1:1. doi: /spr MARQUES, I. Fruit conservation: Reduction of postharvest diseases in Rocha pear MS Thesis. MATOS, O.; SANTOS, M.; VASILENKO, P.; SÁNCHEZ, C.; BARREI- RO G Safe use of caprilic acid for profilactic and curative treatments of Rocha pear. In Avances en postcosecha de frutas y hortalizas. I. Recasens, J. Graell, G. Echeverria (Eds.), pp SÁNCHEZ, C.; FERREIRA PINTO, M.M.; BARREIRO, M.G Characterization of Aureobasidium pullulans, a promising biocontrol agent for postharvest diseases. Acta Horticulturae 934, SHARMA, R.R; SINGH, D.; SINGH, R Biological control of postharvest diseases of fruits and vegetables by microbial antagonists: A review. Biol. Control 50: SPADARO, D.; GULLINO, M.L State of the art and future prospects of the biological control of postharvest fruit diseases. Int. J. Food Microbiol. 91: ZHANG, H.; ZHENG, X.; FU, C.; XI, Y Postharvest biological control of gray mold rot of pear with Cryptococcus laurentii. Postharvest Biol. Technol. 35: revista de Fruticultura Especial