CARACTERIZACIÓN DEL MICROBIOMA INTESTINAL EN PACIENTES DIABÉTICOS

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1 CARACTERIZACIÓN DEL MICROBIOMA INTESTINAL EN PACIENTES DIABÉTICOS Responsable Técnico: Alva Rocío Castillo González. Institución de Adscripción: Universidad Autónoma de Chihuahua. ANTECEDENTES Las enfermedades relacionadas con el metabolismo, como la diabetes y la obesidad representan un problema de salud pública a nivel mundial. Según reportes de la OMS, mundialmente existen en el mundo 422 millones de personas diabéticas y más del 80% de las muertes a causa de la diabetes y sus complicaciones ocurren en países en vía de desarrollo. Desafortunadamente se ha estimado que para el 2030 se duplicarán las muertes a causa de la diabetes y sus complicaciones (1). Por lo cual, la misión del Programa de Diabetes de la OMS es prevenir esta enfermedad siempre que sea posible y, cuando no lo sea, reducir al mínimo sus complicaciones y mejorar la calidad de vida (1). Investigaciones recientes han generado información que señalan al microbioma intestinal como un factor importante de problemas metabólicos como la diabetes y la obesidad. En los últimos años ha incrementado el interés de conocer más sobre la función del microbioma humano (conjunto de genomas de los microorganismos que forman parte de la microbiota del cuerpo) en la salud y en la enfermedad, entender dicha función es punto central para inferir sobre el papel que juegan los microorganismo en la fisiología humana (2, 3). Es decir, establecer estándares normales del microbioma e poder interpretar alguna disbiosis como marcador de enfermedad (3). Por ejemplo, los phyla bacterianos Bacteroidetes y Firmicutes son los que predominan en el ambiente intestinal, por lo cual un cambio significativo en su concentración relativa puede considerarse una disbiosis e interpretarse como un marcador de disbiosis y ser relacionado con una enfermedad, puede representar un objetivo terapéutico prometedor para tratar enfermedades o bien, como biomarcador para el diagnóstico temprano de alguna enfermedad (3). La diabetes es clasificada como enfermedad metabólica, de la cual se conocen dos tipos. la diabetes tipo I, considerada autoinmune ya que las células β del

2 páncreas se encuentran atrofiadas, lo que no permite la secreción de la hormona insulina, por lo tanto, el tratamiento básico es el suministro de insulina de manera exógena y por lo regular aparece antes de los 20 años de edad. En este tipo de diabetes, se incrementa el phylo Bacteroides y disminución de especies bacterianas productoras de butirato.(4). La diabetes mellitus tipo II, se debe a bajas secreción de insulina o bien a la incapacidad de las células para hacer uso de la insulina, este tipo de diabetes se presenta principalmente en adultos maduros y se ha asociado con la obesidad (4). La DM2 está asociada con disbiosis de la microbiota intestinal, además el uso de tratamiento para dicha patología como la metformina también influye en dicha disbiosis. En este tipo de diabetes, disminuyen Firmicutes y Clostridia, e incrementan Betaprotobactteria y la proporción Bacteroides vs Firmucutes (5). Con el uso de técnicas moleculares como la secuenciación masiva y metagenómica junto con avances bioinformáticos se ha logrado dilucidar que el tracto gastrointestinal es el compartimento corporal con mayor diversidad microbiana (6). Esta enfermedad es considerada una enfermedad compleja y multifactorial, ya que es bien sabido que factores como una dieta inadecuada, el sedentarismo y la genética contribuyen en forma considerable a la ganancia excesiva de peso. Sin embargo, en los últimos años, se ha mostrado que la microbiota intestinal actúa como un factor clave en el desarrollo de la obesidad y otras alteraciones metabólicas. A pesar de que las principales causas de la diabetes y sus complicaciones han sido altamente estudiadas, aún el papel de la microbiota intestinal no se ha dilucidado completamente. La microbiota intestinal varía de forma interpersonal y más aún entre diversas poblaciones, esto debido al estilo de vida, la genética y a la ingestión de alimentos, principalmente. Sin embargo, existe un grupo de microorganismos que permanecen constantes entre los individuos de una misma raza, una misma comunidad o bien bajo una misma condición fisiológica, ya sea de salud o enfermedad. En general, se han reportado 10 phylos bacterianos en la microbiota intestinal en el humano, de los cuales Firmicutes y Bacteroidetes constituyen aproximadamente el 90%, mientras que el otro 10% está constituido principalmente por

3 Proteobacterias, Actinobacterias, Fusobactyerias y Verrucomicomicrobia entre otras. Los géneros que predominan en este ambiente son Prevotella y Bacteroides (7), dichas poblaciones varían debido a diversas condiciones, como pueden ser IMC, tipo de dieta, uso de medicamentos, entre otras. Existen varios estudios que han tenido como objetivo la caracterización cualitativa y funcional de la microbiota intestinal bajo diferentes situaciones patológicas, como por ejemplo: el cáncer gástrico donde se ha determinado la acción de Helicobacter pylori (8); en el cáncer colon rectal hay evidencias de la acción de Streptococcus bovis, Helicobacter pylori, Bacteroides fragilis, Enterococcus faecalis, Clostridium septicum, Fusobacterium spp. and Escherichia coli (9); en estreñimiento y síndrome de colon irritable se ha señalado una disminución de Bacteroides y un aumento de Enterobacteriaceae (10), entre otros. Sin embargo, en lo que respecta a la microbiota intestinal en personas con diab, aún no se ha establecido un consenso y la función de las poblaciones bacterianas que principalmente contribuyen a este estado fisiológico. Por lo tanto es necesario conocer aún más los factores de crecimiento y el metabolismo de las diferentes cepa para explicar su función en los diferentes ecosistemas y con ello tratar de dar respuesta al cuestionamiento anterior. Con herramientas biotecnológicas como secuenciación masiva se puede descifrar cuáles son los microorganismos intestinales presentes en diferentes condiciones y mediante PCR en tiempo real se puede definir la concentración de una cepa así como su expresión génica para determinadas enzimas y/o metabolitos. Aportando así argumentos para explicar la presencia y función de las cepas en personas sanas y diabéticas. Además, considerando las posibles diferencias en la microbiota, se puede establecer una relación entre la enfermedad y una dinámica poblacional en particular, generando así una línea base a partir de la cual se puedan identificar las poblaciones microbianas que sirvan como biomarcadores de la enfermedad y con ello coadyuvar a un diagnóstico temprano y al tratamiento de la enfermedad intentando recuperar la microbiota intestinal benéfica para un estado de salud.

4 OBJETIVO GENERAL Caracterizar la microbiota intestinal en personas con diabetes de manera cuantitativa y funcional mediante herramientas biotecnológicas para establecer una relación entre la enfermedad y la presencia de diferentes cepas microbianas intestinales. Y con ello dar pauta a un diagnóstico oportuno de la enfermedad. OBJETIVOS PARTICULARES 1. Definir mediante secuenciación masiva cuáles son las especies microbianas que forman parte de la microbiota intestinal en personas sanas (grupo control) y diabéticas 2. Establecer mediante PCR en tiempo real la concentración de las cepas bacterianas que están presentes en la microbiota intestinal de personas diabéticas y sanas. 3. Con la información obtenida establecer cepas bacterianas que puedan utilizarse como biomarcadores de la enfermedad. METAS Formación de Recursos Humanos Con esta investigación, se pretende formar al menos un estudiante de licenciatura y otro de maestría. Productos entregables Publicación al menos de 2 artículos indexados en el JCR. Plan específico de adaptación de los resultados hacia el sector público, privado o social Una vez que se haga el estudio cuantitativo y funcional de la microbiota intestinal bacteriana, se dará a conocer el conjunto de microorganismos que tengan alto potencial de ser usados como biomarcadores de diabetes. Con esta investigación se establecerán las bases para que se pueda generar un diagnóstico precoz de la diabetes mediante la cuantificación de ciertas cepas bacterianas que sirvan cono

5 miomarcadores y con ello tomar las mediadas necesarias que favorezcan un estado de salud lo antes posibles. TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTO Calculo del tamaño de la muestra. El tamaño de la muestra fue calculado con el programa STATA versión 11.0, según los datos reportados por Schwiertaz (2010), donde la proporción de Firmicutes entre personas diabéticas y no diabéticas fue de 73% vs 51%, respectivamente, considerando un alfa de 0.05 y un poder de prueba del 80%, se estimó un tamaño de muestra mínimo de n=85 personas por grupo. Extracción de ADN de muestras fecales. La extracción del ADN se llevará a cabo bajo las condiciones sugeridas por Hart et al., 2015, haciendo uso del Kit MoBio PowerFecal. Se recolectará las muestras de heces frescas de cada individuo en un tubo cónico con rosca y estéril de 50 ml, una vez en el laboratorio se hará una homogenización con ayuda de una agitador de madera previamente esterilizado. Luego, se alicuotarán cinco fracciones de 0.25 mg en tubos eppendorf estériles de 2 ml, tanto las fracciones de 0.25 mg como la muestra principal, serán congeladas hasta su uso. Una vez que se vaya a extraer el ADN, las muestras se descongelan a temperatura ambiente y se prosigue con la extracción, como lo indica el protocolo del proveeedor (27). Cuantificación y pureza del ADN. La concentración y pureza el ADN extraído se determinará mediante espectrofotometría en un espectrofotómetro NanoDrop (Nanodrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) a una absorbancia de 260/280 y 260/230. Las muestras de ADN serán almacenadas a -20 C hasta su uso. Construcción de librería y secuenciación del ARNr 16S. Luego de cuantificar la concentración de ADN en todas las muestras, éstas se estandarizarán entre 3.5 a 5.0 ng/μl para realizar las amplificaciones de ADN.

6 Los amplicones bacterianos del ARNr 16Sserán generados amplificando una fracción de la región hipervariable V4, usando los iniciadores (primers) universales U515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') y 806R (5'- GGACTACHVGGGTATCTAAT-3') flanqueado por secuencias adaptadoras estándar de Illumina bajo los siguientes parámetros: desnaturalización inicial a 98 C por 3 min, seguido de 25 ciclos, cada uno con una desnaturalización a 98 C por 15 s, alineamiento a 50 C por 30 s y una extensión a 72 C por 30 s, terminando con una extensión final de 72 C por 7 min. Los amplicones serán mezclados para realizar la secuenciación usando el equipo Illumina plataforma MiSeq (28). Análisis de las secuencias de nucleótidos. Una vez que se reciban las secuencias de las muestras enviadas, se realizará una comparación de éstas en la base de datos del GenBank usando el programa Blast del NCBI, con el fin de identificar las bacterias por genero y especie, eligiendo aquellas secuencias del GenBank con mayor porcentaje de similitud (Lesk, 2002). INFRAESTRUCTURA CON LA QUE SE CUENTA Se cuenta con un espacio en el área de laboratorios de investigación.

7 Grupo de trabajo Institución participante integrante Actividades específicas en el proyecto Facultad de Medicina y D.Ph. Alva Rocío Castillo Responsable Técnico Ciencias Biomédicas, González. UACh Facultad de Medicina y Dra. María Alejandra Participará en el manejo Ciencias Biomédicas, Favila Pérez. de las muestras. UACh Facultad de Zootecnia y D.Ph. María Eduviges Participara en el análisis ecología, UACh Burrola Barraza. bioinformático de las cepas aisladas de la microbiota intestinal de personas diabéticas y personas no diabéticas Facultad de Medicina y Ph.D. Sandra Alicia Reza Participará en los Ciencias Biomédicas, López análisis estadísticos y UACh aspectos de nutrición. Facultad Ciencias Dr. Francisco Javier Participará en el análisis Químicas, UACh Zavala de la Serna de pruebas sobre expresión génica. Facultad de Zootecnia y D.Ph. Agustín Corral Participará en el ecología, UACh Luna. desarrollo y estandarización de pruebas enzimáticas. Department of Biology. Ph.D. Hugo Aarón Participará en el la New Mexico State Castillo González. estandarización y análisis University. de pruebas sobre expresión génica.

8 References 1. OMS. Oraganización Mundial de la Salud Gill SR, Pop M, Deboy RT, Eckburg PB, Turnbaugh PJ, Samuel BS, et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science2006;312(5778): Wang JZ, Du WT, Xu YL, Cheng SZ, Liu ZJ. Gut microbiome-based medical methodologies for early-stage disease prevention. Microb Pathog2017;4010(16): Group NDD. Classification and Diagnosis of Diabetes Mellitus and Other Categories of Glucose Intolerance. Diabetes1979;28(12): Bibbo S, Dore MP, Pes GM, Delitala G, Delitala AP. Is there a role for gut microbiota in type 1 diabetes pathogenesis? Ann Med2017;49(1): Consortium. HMP. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature2012;486(7402): Tagliabue A, Elli M. The role of gut microbiota in human obesity: recent findings and future perspectives. Nutr Metab Cardiovasc Dis2013;23(3): Tözün N, Vardareli E. Gut Microbiome and Gastrointestinal Cancer: Les liaisons Dangereuses. J Clin Gastroenterol2016;2016(50): Gagniere J, Raisch J, Veziant J, Barnich N, Bonnet R, Buc E, et al. Gut microbiota imbalance and colorectal cancer. World J Gastroenterol2016;22(2): Gobert AP, Sagrestani G, Delmas E, Wilson KT, Verriere TG, Dapoigny M, et al. The human intestinal microbiota of constipated-predominant irritable bowel syndrome patients exhibits anti-inflammatory properties. Sci Rep2016;6(39399).