Por: Luis Borrás Falomir (*), José L. Alonso Molina (**), Pernilla Eggöy (***), José Ferrer Polo (*)

Transcripción

1 Resumen La eliminación biológica de fósforo en aguas residuales está cobrando una creciente importancia de un tiempo a esta parte. Se ha desarrollado un método de detección que permite, mediante una tinción simple, confirmar la presencia de polifosfatos (poly-p) en un fango, lo cual evidencia la existencia de bacterias acumuladoras de polifosfatos (PAO). Mediante herramientas informáticas se ha llevado a cabo el análisis de imagen, que permite cuantificar la población de PAO, y llevar un registro de la evolución del contenido en poly-p en un fango. Palabras clave: EBPR, poly-p, PAO, eutrofización, azul de metileno, Turrax, análisis de imagen, ImageJ. Técnica de detección de polifosfatos intracelulares y cuantificación mediante análisis de imagen Por: Luis Borrás Falomir (*), José L. Alonso Molina (**), Pernilla Eggöy (***), José Ferrer Polo (*) (*) Universidad Politécnica de Valencia Dpto. Ingeniería Hidráulica y Medio Ambiente Camino de Vera, s/n 46022, Valencia luiborfa@doctor.upv.es (**) Universidad Politécnica de Valencia Instituto de Hidrología y Medio Natural Camino de Vera, Valencia (***) Halmstad University School of Business and Engineering (Sweden) 56 Abstract Polyphosphates detection method and image analysis quantification The EBPR has become an important process in wastewater treatment. A method has been developed to detect, by a simple stain, the presence of polyphosphates (poly-p) in a sludge, that is an evidence of the presence of polyphosphate accumulating organisms (PAO). Using the appropiate software is possible to do an image analysis to quantify this PAO, and monitorize the evolution of the poly-p content in a sludge. Keywords: EBPR, poly-p, PAO, eutrophication, methylene blue, Turrax, image analysis, ImageJ. 1. Introducción La eliminación biológica de fósforo en aguas residuales (EBPR) (Barnard 1974) ha cobrado una creciente importancia en los últimos años. El fósforo y el nitrógeno, nutrientes esenciales, pueden provocar importantes desequilibrios en sistemas acuáticos tales como ríos, embalses o aguas marinas, favoreciendo el desarrollo desmesurado de fitoplancton, y produciendo problemas de color y olor en las aguas (Meganck et al. 1988). La solución a este problema de eutrofización pasa por la eliminación de estos nutrientes de las aguas residuales, de forma que el efluente de las depuradoras esté libre de nitrógeno y fósforo. En esta experiencia nos hemos centrado en el caso del fósforo. Las bacterias descritas como responsables de la eliminación biológica de fósforo son las PAO (Polyphosphate Accumulating Organisms). Estas bacterias, sometidas a alternancia de condiciones anaerobias aerobias, son capaces de eliminar el fósforo soluble de las aguas (fosfatos, PO 4 3- ), de modo que en la etapa anaerobia toman ácidos grasos de cadena corta presentes en el medio como acetato y propionato, (Gerber et al. 1986), y transforman el polifosfato (poly-p) almacenado interiormente en PO 4 3-, produciendo un incremento de PO 4 3- en el medio. En la etapa aerobia, las PAO toman el PO 4 3- del medio, y lo almacenan en forma de poly-p, resultando una eliminación neta del fósforo como muestra la Figura 1. En la Figura 2 se muestra un esquema simplificado del metabolismo de estas bacterias, (Seviour et al. 2003), aunque existen diversas teorías sobre este metabolismo (Hesselmann et al. 2000). En esta experiencia se ha desarrollado una técnica que permitirá identificar el poly-p acumulado en el interior de las PAO, y su posterior recuento mediante el uso de programas informáticos de análisis de imagen.

2 forma que se pueden realizar recuentos de poblaciones en muestras con un flóculo originalmente muy agregado. Figura 1. Evolución del fósforo soluble (PO 4 3- ) y el poly-p en alternancia de fases aerobia y anaerobia. Figura 2. Metabolismo de las bacterias PAO (Seviour et al. 2003). 2. Materiales y métodos 2.1. Preparación de la muestra Uno de los principales problemas que encontramos a la hora de examinar un fango con elevado contenido en bacterias acumuladoras de polifosfatos es que el fango se encuentra muy floculado, haciendo imposible su observación mediante microscopía óptica convencional. Por ello, en ocasiones se hace necesario realizar un pretratamiento de la muestra que consiste en homogenizar, diluir, y disgregar la muestra. Para ello se ha utilizado el homogeneizador Ultra-Turrax T25 (Wallner et al. 1995), y el disgregador Ultra- Turrex T8 (Ziglio et al. 2002), ambos de IKA Labortechnik, Staufen, Germany. El proceso consiste en tomar una muestra de ml y someterla a la acción de del Ultra- Turrax T25 durante 5 min. en la posición de velocidad 1 ( rpm). Seguidamente, se toman una alícuota del fango homogeneizado, y se diluye con el propio filtrado de la muestra. La filtración se realiza mediante filtro de 0,2 mm. De esta forma se evita la adición de fosfatos presentes en tampones de uso común, que podrían provocar un almacenamiento de poly-p extra por parte de las PAO, dando lugar a resultados erróneos. Seguidamente se someten 5 ml de la muestra diluida al Ultra-Turrax T8 durante 10 min., en la posición de velocidad 5 ( rpm), y con refrigeración. Esta técnica permite disgregar el flóculo de 2.2. Tinción de la muestra Existen varias tinciones convencionales que permiten diferenciar los gránulos de poly-p del resto del flóculo, como la tinción de Neisser, la tinción con o-toluidina, o la tinción con azul de metileno de Loeffler (Serafim et al. 2002). Esta última es la que se ha seleccionado para esta experiencia, por su sencillez, su rapidez, y el contraste obtenido (Figura 3). Este reactivo se puede adquirir ya preparado, o prepararlo en el laboratorio como se describe a continuación. Disolver 0,3 g de azul de metileno en 100 ml de etanol 60% (solución de Loeffler), y disolver 10 mg hidróxido potásico en 100 ml de agua destilada (solución 2). Mezclar las soluciones 1 y 2 en partes iguales (Seviour et al. 1999). Para realizar la tinción se disponen 10 ml de muestra disgregada sobre un portaobjetos, ocupando una superficie de 18 x 18 mm 2, correspondiente a las dimensiones de un cubreobjetos. Se deja la muestra secar al aire durante aproximadamente 30 min, o en una estufa a 37 ºC durante 5-10 min. Cabe destacar que las PAO trabajan con alternancia de ciclos anaerobio aerobio, y que el hecho de extender la muestra sobre el portaobjetos aumenta su superficie de muestra en contacto con el aire, de forma que las bacterias pueden disponer de oxígeno que no se encontraba originalmente en la muestra, provocando así cambios en la localización del fósforo en la muestra, es decir, los fosfatos disueltos podrían pasar a poly-p almacenado intracelularmente. Una vez se encuentre la muestra completamente seca, se cubre con la solución de azul de metileno de Loeffler durante 20 segundos. Seguidamente se lava con cuidado la muestra con agua destilada, de forma que no sean arrastradas las bacterias fijadas en el portaobjetos. Por 57

3 58 Figura x Tinción de poly-p mediante azul de metileno de Loeffler. último, se deja secar la muestra hasta que no quede nada de agua sobre ella. Se observa la muestra en el microscopio óptico con aceite de inmersión (aumentos x1.000). Las inclusiones de poly-p se observan como puntos de color rosa brillantevioleta, mientras que el resto del floculo adquiere un tono ligeramente azulado (Seviour et al. 1999) (Figura 3). Existen otras tinciones como la doble tinción que permiten diferenciar entre el poly-p y el PHB presentes en una muestra (Rees et al. 1992), pero es necesario el uso de microscopios de epifluorescencia, de uso poco común en plantas depuradoras de reales Análisis de imagen El análisis de imagen permite cuantificar las áreas correspondientes a poly-p, y el resto del flóculo. Para ello se ha utilizado la cámara DP12 montada sobre un microscopio BX50, ambos de Olympus. Con el fin de obtener unas imágenes que representen fielmente a la muestra teñida, se realizan 20 fotografías de 20 campos distintos seleccionados al azar en la muestra extendida teñida sobre el portaobjetos. Si se desea comparar resultados entre muestras de distintos días, es importante que las fotografías sean tomadas todas en las mismas condiciones, es decir, se deben mantener la apertura del diafragma, el tiempo de exposición de la cámara, y la luz del microscopio siempre en las mismas condiciones. Una vez realizadas las fotografías se debe hacer uso de un programa de análisis de imagen para obtener el porcentaje, en área, de poly-p en la muestra. El programa que se ha utilizado es el ImageJ 1.31v (Wayne Rasband, Nacional Institutes of Health, USA. gov/ij), de libre distribución. Es conveniente que el tamaño de las fotografías no sea excesivo, de forma que podamos trabajar con varias imágenes simultáneamente. Normalmente se está trabajando con imágenes de 512 x 640. En primer lugar se cargan las imágenes, y se analizan en busca de partes de la muestra teñidas que no sean poly-p. Si existen, se seleccionan, y se determina el área en píxeles mediante la aplicación informática. Figura 4a. A continuación se convierten las imágenes a escala de grises y 8 bit, para que el programa pueda trabajar con ellas, Figura 4b. Una vez se tiene la imagen cargada y convertida a escala de grises se Figura 4. Programa ImageJ de análisis de imagen. ajusta el brillo y el contraste, Figura 4c, de forma que todas las imágenes de distintos días tengan el mismo ajuste. La selección del umbral (threshold) es la más importante. Se deben seleccionar las partículas que se identifiquen como poly-p en una de las fotografías. El programa marca en rojo la selección, Figura 4d, y al aplicar los cambios, convierte la imagen a blanco y negro, Figura 4e, de forma que podrá contar los píxeles negros, Figura 4f. Todos los cambios se realizan automáticamente sobre las 20 imágenes. El resultado dado por el programa es un porcentaje sobre el área total de las imágenes. Es posible que se desee referenciar ese porcentaje al área total de muestra. Para ello se puede trabajar con las mismas imágenes, pero ajustando el umbral (threshold), (Figura 4d) al total del flóculo, de forma que el resultado sea el porcentaje total de muestra en las 20 imágenes. Ahora se puede referenciar el porcentaje de poly-p obtenido anteriormente, al porcentaje total de muestra que se acaba de obtener. En ocasiones, mediante la tinción de azul de metileno no se consigue teñir el total de la muestra. En estos casos se puede realizar, sobre un duplicado de la muestra, una segunda tinción con safranina (Kojecká et al. 2001), que teñirá el total del flóculo.

4 La identificación de los gránulos de poly-p es la parte más importante del método. Para ello, es conveniente fijarse, no sólo en las diferencias de color obtenidas, sino también en la morfología de las zonas teñidas. Normalmente, las PAO forman agregados de un número importante de bacterias. Aunque la sustancia teñida es el poly-p, en el caso de las PAO es tan abundante la cantidad de poly-p almacenada en su interior, que la aplicación del azul de metileno da como resultado la tinción de prácticamente toda la bacteria, observándose una forma bastante circular. Existen algunos tipos de bacterias filamentosas, Microthrix parvicella y Nostocoida limicola (Seviour et al. 1990), que son capaces de almacenar poly-p, aunque en menor cantidad que las PAO. De hecho, no son de utilidad para la EBPR. Su identificación en una muestra teñida con azul de metileno es sencilla, ya que los gránulos se agrupan en forma de cordón, lo que las hace claramente diferenciables. 3. Resultados y discusión Mediante este método se ha podido obtener resultados que muestran claramente una tendencia en el porcentaje de poly-p en un fango con el tiempo (Figura 5). Sin embargo, el método presenta limitaciones a la La principal característica de este método es su rapidez y sencillez hora de comparar muestras aerobias y anaerobias de un mismo sistema. Cuando las bacterias PAO se encuentran en fase anaerobia, deberían tener menos poly-p almacenado intracelularmente que en la fase aerobia (Figura 1). Los resultados obtenidos mediante este método no siempre muestran este comportamiento. Esta anomalía se debe, probablemente, al tratamiento previo al que se somete a las muestras. Una vez las muestras llegan al laboratorio, son homogeneizadas por medio del Ultra-Turrax T25. Se ha comprobado que el uso del homogeneizador provoca un incremento notable en la cantidad de oxígeno disuelto en la Figura 5. Representación típica de la evolución de la proporción de poly-p de un fango. muestra, cambiando así su estado. Este efecto es más importante en el caso de muestras anaerobias, ya que se transforman en aerobias, y por tanto, aumenta su contenido en poly-p intracelular, lo que se apreciará en la tinción con azul de metileno. En este tipo de muestras se podría realizar la homogeneización en una atmósfera de nitrógeno, evitando así la reaireación superficial. Para poder disgregar la muestra y tener un número de células apropiado para su recuento se realiza una dilución. El problema es que si se utiliza un tampón con fosfato, se puede potenciar que las muestras aerobias aumenten su contenido en poly-p, dando como resultado una tinción con más poly-p del esperado. Para ello se ha utilizado el filtrado de la muestra homogeneizada, de forma que los fosfatos disueltos serán los mismos que tenía la muestra originalmente. 4. Conclusiones Mediante el método desarrollado se puede determinar la presencia de poly-p en un fango, y por tanto, la posible presencia de bacterias acumuladoras de poly-p (PAO). Además, una sencilla aplicación informática, permite llevar un registro de la evolución de estas bacterias en una planta depuradora con EBPR. Las principales características del método son su rapidez y su sencillez. Mediante este método no es posible conocer el tipo de bacterias acumuladoras de poly-p presente en un fango, pero se puede conocer con suficiente exactitud su proporción y evolución. Por otra parte, los materiales e instrumentos necesarios para su aplicación son de uso habitual en las plantas depuradoras de aguas residuales, de modo que la inversión en equipo es baja, y tan solo necesitaremos algunos reactivos como el azul de metileno. 5. Agradecimientos Se agradece la colaboración de los miembros del grupo Calagua de 59

5 la Universidad de Valencia, y la Universidad Politécnica de Valencia, y la financiación del MCYT (Proyecto PPQ C0 2 ) Bibliografía [1] Barnard J.L. (1974) Cut P and N without chemicals. Water Wastes Eng. 11: [2] Gerber, A., Mostert, E.S., Winter, C.T. and de Villiers, R.H. (1986) The effect of acetate and other short-chain carbon compounds on the kinetics of biological nutrient removal. Water SA 12, [3] Hesselmann, R.P.X., von Rummel, R., Resnick, S.M., Hanny, R. And Zehnder, A.J.B. (2000) Anaerobic metabolism of bacteria performing enhanced biological phosphate removal. Water Res. 34, [4] Kojecká P., Hartman P., Macek M., and Stara J. Long-term changes in the microbial community structure in two enhanced phosphorus removal wastewater treatment plants. Proceedings 3rd IWA International Specialized. Papers from the IWA Conference on Microorganisms in Activated Sludge and Biofilm Processes III held in Rome, Italy, June [5] Rees G.N., George Vasiliadis, John W. May and Ronald C. Bayly. Differentiation of polyphosphate and poly-b-hydroxybutyrate granules in Acinetobacter sp. isolated from activated sludge. Microbiology Letters 94 (1992) [6] Serafim L. S. Methods for detection and visualization of intracellular polymers stored by polyphosphateaccummulating microorganisms. Journal of Microbiological Methods. 51, 1, Sept [7] Seviour, E.M., Williams, C.J., Seviour, R.J., Soddell, J.A. and Lindera, K.C. (1990) A survey of filamentous bacterial populations from foaming activated sludge plants in Eastern States of Australia. Water Res. 24, [8] Seviour R.J. y Blackall L.L. (1999) The microbiology of Activated Sludge. Kluwer Academic Publishers. [9] Seviour R.J., Takashi Mino, Motoharu Onuki. The microbiology of biological phosphorus renoval in activated sludge systems. FEMS Microbiol. Rev. (2003) 27, [10] Wallner G, Erhart R, Amann R. Flowcytometric analysis of activated sludge with rrna-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 1995; 61(5): [11] Ziglio G., Gianni Andreottola, Silvia Barbesti, Giorgio Boschetti, Laura Bruni, Paola Foladori, Roberta Villa. Assessment of activated sludge viability with flow cytometry. Water Research 36 (2002)