Bioinformática Clásica Tema 3: Análisis de Secuencias (1) Los Fundamentos

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1 Bioinformática Clásica Tema 3: Análisis de Secuencias (1) Los Fundamentos Dr. Oswaldo Trelles ac.uma.es Incluso antes de que la información sobre la organización de las secuencias estuviera disponible en medios digitales en los setenta ya se hacía comparación de secuencias por métodos manuales, comprobando visualmente o con ayuda de papel y tijeras qué zonas de dos secuencias se parecían. Hoy existen multitud de servidores que ofrecen el servicio de comparación, y ésta se ha convertido en posiblemente la tarea más rutinaria de la bioinformática.

2 Una secuencia representa un gen o a una proteína, o también una parte funcional de una proteína, o una zona que se expresa, etc. Cuando hablamos de una secuencia nos referimos a la sucesión de letras que representan los nucleótidos en el ADN o los aminoácidos en las proteínas que la forman, o los residuos en general. Por qué comparar secuencias? porque a partir del parecido entre ellas es posible inferir información funcional, estructural y / o evolutiva. Cómo comparar secuencias? Buscando que los residuos que las forman se alineen lo más posible. Se han diseñado varios algoritmos para evaluar el parecido entre secuencias. Los hay desde los exhaustivos que ofrecen precisión a cambio de coste computacional, hasta heurísticos que ganan en velocidad sacrificando algo la precisión. EN la medida en que sepamos como hace su trabajo cada algoritmo podremos saber que estamos obteniendo como resultado Cómo analizar los resultados?. Se trata de sumar al conocimiento y experiencia biológica, el conocimiento de los algoritmos y el efecto de los parámetros usados.

3 Conceptos previos

4 CC -!- FUNCTION: E3 UBIQUITIN-PROTEIN LIGASE WHICH ACCEPTS UBIQUITIN FROM LOCUS AL bp circular BCT 10-MAY-1999 CC AN E2 UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME IN THE FORM OF A THIOESTER AND DEFINITION Bacillus subtilis complete genome. CC THEN DIRECTLY TRANSFERS THE UBIQUITIN TO TARGETED SUBSTRATES (BY ACCESSION AL CC SIMILARITY). THIS PROTEIN MAY BE INVOLVED IN MATURATION AND/OR SOURCE Bacillus subtilis. CC POST-TRANSCRIPTIONAL REGULATION OF MRNA. ORGANISM Bacillus subtilis KW Ubiquitin conjugation; Ligase. Eubacteria; Firmicutes; Low G+C gram-positive gacagtaaag bacteria; FT DOMAIN Bacillaceae; cctcttccca 77 Bacillus. ttgcatgcgg 88 ASP/GLU-RICH taatcaatcc (ACIDIC). gctctaatcc ccttctggaa REFERENCE 1 (bases 1 to ) ttgggcgtgt FT DOMAIN aaacagtcat 127 cacaaacacg 150 PRO-RICH. ttttcaaatt ccagcgtaat cactctgcct AUTHORS Kunst,F., Ogasawara,N., Moszer,I., Albertini,A.M., FT Alloni,G., DOMAIN ASP/GLU-RICH (ACIDIC). Azevedo,V., Bertero,M.G., Bessieres,P., Bolotin,A., tcttggtcat gctcttctac tccgataccg tagatgacct gcagcggttc ttgcttagaa FT Borchert,S., BINDING UBIQUITIN (BY SIMILARITY). Borriss,R., Boursier,L., Brans,A., Braun,M., aaaacagctg SQ SEQUENCE tgccggaata 889 AA; tccttttttc MW; actgcataat DD7E6C7A CRC32; tccagtacac atgatagtct TITLE The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis JOURNAL Nature 390 (6657), (1997) tcaggctgga MMSARGDFLN gatcaacctg YALSLMRSHN gccgtcctgt DEHSDVLPVL atcttcgttt DVCSLKHVAY cctgaagaca VFQALIYWIK AMNQQTTLDT tataatatct FEATURES Location/Qualifiers PQLERKRTRE LLELGIDNED SEHENDDDTS QSATLNDKDD ESLPAETGQN HPFFRRSDSM gcatcctctt ctttcaaata agagaggaaa tccatttttc tcatcacagc ccgcaggccg source VYEYVRKYAE HRMLVVAEQP LHAMRKGLLD VLPKNSLEDL TAEDFRLLVN GCGEVNVQML /organism="bacillus subtilis" tttacattcc ISFTSFNDES atgaaatcaa GENAEKLLQF cttcatgttt KRWFWSIVER catcctcccc MSMTERQDLV cctataaaaa YFWTSSPSLP ASEEGFQPMP agagcaagaa /db_xref="taxon:1423" cccgaaggtc SITIRPPDDQ cttgctcttt HLPTANTCIS acatatcagc RLYVPLYSSK ttactcaccg QILKQKLLLA cttacgtatg IKTKNFGFV gaagtaaagc gene /gene="dnaa" catttgacgt gcgcgtttga tcgctgcagt caatttacgt tggtatttag cgtttgttcc /db_xref="embl: " agttacacga cgtggtaaaa ttttaccgcg ctcagaaaca aactttttaa gaagatctac CDS /gene="dnaa" atctttgtag tcgatgtgcg tgataccgtt agaagtgaaa taacacactt tacggcgttt /function="initiation of chromosome cgcacgaccg replication (DNA cctctgcgtc synthesis)" ctcctgccat tgtcatttcc ctcctttctt tttcatttta /note="alternate gene name: dnah, dnaj, dnak" /codon_start= ggcgataatc acattagaat ggaagatcat catccgagat gtcaatcggt ttgccgtcgt /transl_table= tggcaaatgg gtcatcatta aagctgttcc cctgattgcg tctctggttg ttttgatttc /protein_id="cab " /db_xref="gi: " ccccaaatgg attatcattt tggcctccgc caaagtactg gcctccgccg ctgtttcctt gene /gene="dnan... /translation="menildlwnqalaqiekklskpsfetwmkstkahslqgdtlti cgttgtatcc acctgaacca gaaccgccgc cgtttttcgg ctcaagaaat tgaacacttt APNEFARDWLESRYLHLIADTIYELTGEELSIKFVIPQNQDVEDFMPKPQVKKAVKED TSDFPQNMLNPKYTFDTFVIGSGNRFAHAASLAVAEAPAKAYNPLFIYGGVGLGKTHL cagcttggac ctctgtcacg aagacacgct gtccttgctg gttttcatag tttcttgttt MHAIGHYVIDHNPSAKVVYLSSEKFTNEFINSIRDNKAVDFRNRYRNVDVLLIDDIQF gtaaacggcc atctacgcct gcaaggcttc cttttttcaa gaagtttgca acgttttcgg LAGKEQTQEEFFHTFNTLHEESKQIVISSDRPPKEIPTLEDRLRSRFEWGLITDITPP cttgtcttct ccaagtgaca caattaatga aatcggcctc acgttctccg gactggttcg DLETRIAILRKKAKAEGLDIPNEVMLYIANQIDSNIRELEGALIRVVAYSSLINKDIN taaatgtacg attcacagca agagtaaacg tagcaacagc cgcaccgttt ggcgtataac LSREMTDSSLPKIGEEFGGRDHTTVIHAHEKISKLLADDEQLQQHVKEIKEQLK gaagctctgg gtcttttgtc agtcttccga ctaatacaac tcggttaagc ataagaaaga ccacctttta ccattatata tttcaaaatt gcttattctt cttctttaac aacaatgtgg cgaatgatat cgtcactgat cttagctaga cggtcaaatt cttgaactgc cgcagcgtca Las secuencias conocidas se almacenan en Bases de Datos y están disponible para la comunidad científica. El volumen de datos que se maneja jamás fue imaginado. Además de la secuencia en sí, en las bases de datos se almacena valiosa información acerca de las propiedades y función de la secuencia, con interesantes enlaces a otras fuentes de información sobre su estructura o participación en determinados procesos biológicos. Es decir, en muchos casos se tiene un buen conocimiento de las secuencias almacenadas en las bases de datos.

5 New-Seq SeqDB > qnew-seq 889 AA; SARGDFLNAA YALFFMRSHN FGHSDVLPVL CSLKHVAYWD AYQALIYWIK AMNQQTDTSI TIRPPDDQAF GHHHLPTANT CISRLYVPLY SSK Por ello, cuando se dispone de una nueva secuencia obtenida en el laboratorio cuya función se quiere conocer, la forma bioinformática de resolver el problema consiste en compararla con todas las secuencias conocidas, que se almacenan en las bases de datos. ID 100K_RAT STANDARD; PRT; 889 AA. AC Q62671; DT 01-NOV-1997 (Rel. 35, Created) DT 01-NOV-1997 (Rel. 35, Last sequence update) DT 15-JUL-1999 (Rel. 38, Last annotation update) DE 100 KD PROTEIN (EC ). OS Rattus norvegicus (Rat). OC Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Mammalia; OC Eutheria; Rodentia; Sciurognathi; Muridae; Murinae; Rattus. RN [1] RP SEQUENCE FROM N.A. RC STRAIN=WISTAR; TISSUE=TESTIS; RX MEDLINE; RA MUELLER D., REHBEIN M., BAUMEISTER H., RICHTER D.; RT "Molecular characterization of a novel rat protein structurally RT related to poly(a) binding proteins and the 70K protein of the U1 RT small nuclear ribonucleoprotein particle (snrnp)."; RL Nucleic Acids Res. 20: (1992). RN [2] RP ERRATUM. RA MUELLER D., REHBEIN M., BAUMEISTER H., RICHTER D.; RL Nucleic Acids Res. 20: (1992). CC -!- FUNCTION: E3 UBIQUITIN-PROTEIN LIGASE WHICH ACCEPTS UBIQUITIN FROM CC AN E2 UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME IN THE FORM OF A THIOESTER AND CC THEN DIRECTLY TRANSFERS THE UBIQUITIN TO TARGETED SUBSTRATES (BY CC SIMILARITY). THIS PROTEIN MAY BE INVOLVED IN MATURATION AND/OR CC POST-TRANSCRIPTIONAL REGULATION OF MRNA. CC CC This SWISS-PROT entry is copyright. It is produced through... CC DR EMBL; X64411; CAA ; -. DR PFAM; PF00632; HECT; 1. DR PFAM; PF00658; PABP; 1. KW Ubiquitin conjugation; Ligase. FT DOMAIN ASP/GLU-RICH (ACIDIC). FT DOMAIN PRO-RICH. FT DOMAIN ASP/GLU-RICH (ACIDIC). FT BINDING UBIQUITIN (BY SIMILARITY). SQ SEQUENCE 889 AA; MW; DD7E6C7A CRC32; MMSARGDFLN YALSLMRSHN DEHSDVLPVL DVCSLKHVAY VFQALIYWIK AMNQQTTLDT PQLERKRTRE LLELGIDNED SEHENDDDTS QSATLNDKDD ESLPAETGQN HPFFRRSDSM VYEYVRKYAE HRMLVVAEQP LHAMRKGLLD VLPKNSLEDL TAEDFRLLVN GCGEVNVQML ISFTSFNDES GENAEKLLQF KRWFWSIVER MSMTERQDLV YFWTSSPSLP ASEEGFQPMP SITIRPPDDQ HLPTANTCIS RLYVPLYSSK QILKQKLLLA IKTKNFGFV //

6 New-Seq SeqDB > qnew-seq 889 AA; SARGDFLNAA YALFFMRSHN FGHSDVLPVL CSLKHVAYWD AYQALIYWIK AMNQQTDTSI TIRPPDDQAF GHHHLPTANT CISRLYVPLY SSK Asignación de Función Si durante la comparación se encuentran otras secuencias que se parecen a la secuencia problema o desconocida, entonces podemos inferir por su parecidoque desarrollan funciones biológicas similares. A este mecanismo se le conoce como asignación de función por homología. ID KNWN-SEQ STANDARD; PRT; 889 AA. AC Q62671; DT 01-NOV-1997 (Rel. 35, Created) DT 01-NOV-1997 (Rel. 35, Last sequence update) DT 15-JUL-1999 (Rel. 38, Last annotation update) DE 100 KD PROTEIN (EC ). OS Rattus norvegicus (Rat). OC Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Mammalia; OC Eutheria; Rodentia; Sciurognathi; Muridae; Murinae; Rattus. RN [1] RP SEQUENCE FROM N.A. RC STRAIN=WISTAR; TISSUE=TESTIS; RX MEDLINE; RA MUELLER D., REHBEIN M., BAUMEISTER H., RICHTER D.; RT "Molecular characterization of a novel rat protein structurally RT related to poly(a) binding proteins and the 70K protein of the U1 RT small nuclear ribonucleoprotein particle (snrnp)."; RL Nucleic Acids Res. 20: (1992). RN [2] RP ERRATUM. RA MUELLER D., REHBEIN M., BAUMEISTER H., RICHTER D.; RL Nucleic Acids Res. 20: (1992). CC -!- FUNCTION: E3 UBIQUITIN-PROTEIN LIGASE WHICH ACCEPTS UBIQUITIN FROM CC AN E2 UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME IN THE FORM OF A THIOESTER AND CC THEN DIRECTLY TRANSFERS THE UBIQUITIN TO TARGETED SUBSTRATES (BY CC SIMILARITY). THIS PROTEIN MAY BE INVOLVED IN MATURATION AND/OR CC POST-TRANSCRIPTIONAL REGULATION OF MRNA. CC CC This SWISS-PROT entry is copyright. It is produced through... CC DR EMBL; X64411; CAA ; -. DR PFAM; PF00632; HECT; 1. DR PFAM; PF00658; PABP; 1. KW Ubiquitin conjugation; Ligase. FT DOMAIN ASP/GLU-RICH (ACIDIC). FT DOMAIN PRO-RICH. FT DOMAIN ASP/GLU-RICH (ACIDIC). FT BINDING UBIQUITIN (BY SIMILARITY). SQ SEQUENCE 889 AA; MW; DD7E6C7A CRC32; MMSARGDFLN MMSARGDFLN YALSLMRSHN DEHSDVLPVL DVCSLKHVAY VFQALIYWIK AMNQQTTLDT TIRPPAGAFG LPTANTCISR LYVPLYSMSK SHGTMSEHEN DDDTSQSATL VYEYVRKYAE HRMLVVAEQP LHAMRKGLLD VLPKNSLEDL TAEDFRLLVN GCGEVNVQML ISFTSFNDES GENAEKLLQF KRWFWSIVER MSMTERQDLV YFWTSSPSLP ASEEGFQPMP SITIRPPDDQ HLPTANTCIS RLYVPLYSSK QILKQKLLLA IKTKNFGFV // qnew-seq --SARGDFLNAA YALFFMRSHN FGHSDVLPVL -CSLKHVAY WDAYQALIYW KNOWN-SEQ MMSARGDFLN-- YALSLMRSHN DEHSDVLPVL DVCSLKHVAY VFQALIYW qnew-seq IKAMNQQTDTSI --RPPDDQAF GHHHLPQAMH --SRLYVPHK S-SK----- KNOWN-SEQ IKAMNQQTTLDT TIRPPA---- GAFGLPTANT CISRLYVPLY SMSKSHGTM

7 Cómo comparar secuencias? Bioinformática Clásica Existen diversos algoritmos, desde los básicos hasta los exhaustivos y las buenas aproximaciones. Básicamente se trata de encontrar la posición en la que las dos secuencias son más parecidas (viendo si cada letra es la misma en las dos secuencias, por ejemplo). Pero es necesario añadir el conocimiento biológico que se tiene de los componentes de las secuencias y de ellas mismas. Así hay residuos que pueden ser reemplazados por otros o más afines a otros. Los esquemas de puntuación entre residuos tratan de representar este conocimiento. También es importante hacer el trabajo rápido y bien. Hay tantos datos de secuencias que resulta casi imposible hacer búsquedas o comparaciones exhaustivas; así que hay que simplificar y acelerar usando el conocimiento informático y estadístico para separar el grano de la paja. Esquema de Pesos A C G T A C G T Tabla de Dispersión (Hash) pos : seqx : TCAG ACGA TTG n=11 Tabla Hash (seqx) A 3, 5, 8 C 2, 6 G 4, 7, 11 T 1, 9, 10 Prefijos, ventanas de inspección,...

8 Cómo analizar resultados? Sumar al conocimiento biológico y la experiencia del laboratorio, el conocimiento de los algoritmos de comparación de secuencias y el efecto de los parámetros usados. Los servicios de comparación de secuencias ofrecen atractivas interfases, con multitud de posibilidades... es necesario conocer la influencia de cada parámetros para sacar de ellos el mayor provecho. Por otra parte, dado los grandes volúmenes de información, la más de las veces lo importante es diferenciar un parecido real de un parecido aleatorio o puramente azaroso. En este apartado la estadística juega un papel muy importante para valorar la importancia (estadística) de los resultados.

9 ATG GAC GAT TCA TCG GAG MDDSSE The Standard Code AAA K ACA T AGA R ATA I AAC N ACC T AGC S ATC I AAG K ACG T AGG R ATG M AAT N ACT T AGT S ATT I CAA Q CCA P CGA R CTA L CAC H CCC P CGC R CTC L CAG Q CCG P CGG R CTG L CAT H CCT P CGT R CTT L GAA E GCA A GGA G GTA V GAC D GCC A GGC G GTG V GAG E GCG A GGG G GTG V GAT D GCT A GGT G GTT V TAA. TCA S TGA. TTA L TAC Y TCC S TGC C TTC F TAG. TCG S TGG W TTG L TAT Y TCT S TGT C TTT F El dogma central de la biología molecular establece que el ADN es usado como molde para la síntesis de proteínas. Existe por tanto una relación directa entre las secuencias de ADN y las de proteínas. Para la síntesis el ADN se lee de tres en tres (codones) correspondiendo a cada codón un determinado aminoácido (según lo establece el código genético).

10 Mutaciones: cambios en las secuencias Reemplazo puntual.- Una base es reemplazada por otra pero el nuevo codón codifica el mismo aminoácido (codones GAC -> GAT, o reemplazos sinónimos), pero también el codón resultante puede codificar otro aminoácido (CCA y GCA en el ejemplo) o de mayor impacto, como el cambio de TCG a TAG que resulta en un codón de stop o fin de traducción) Inserción y pérdida de residuos, conocidos como InsDels (inserciones y delecciones) con efecto sobre la pauta de lectura. Traslocación. Colocación fuera de lugar de una trozo largo de ADN Duplicación, o repetición de un trozo de ADN en una zona diferente del cromosoma (o de otro cromosoma) Estos cambios además de producen en todos los niveles y las escalas de organización de la vida. Bioinformática Clásica GAT GCA TAG ATG GAC CCA CGT TCG GAG The Standard Code AAA K ACA T AGA R ATA I AAC N ACC T AGC S ATC I AAG K ACG T AGG R ATG M AAT N ACT T AGT S ATT I CAA Q CCA P CGA R CTA L CAC H CCC P CGC R CTC L CAG Q CCG P CGG R CTG L CAT H CCT P CGT R CTT L GAA E GCA A GGA G GTA V GAC D GCC A GGC G GTG V GAG E GCG A GGG G GTG V GAT D GCT A GGT G GTT V TAA. TCA S TGA. TTA L TAC Y TCC S TGC C TTC F TAG. TCG S TGG W TTG L TAT Y TCT S TGT C TTT F MDPRSE DA * Modelo Evolutivo: Modelo Evolutivo: Aunque la maquinaria biológica es bastante precisa, durante la replicación del ADN se pueden producir fallos, en los que un nucleótido es reemplazado por otro, o se pierden nucleótidos o se añaden de más, o incluso trozos largos de cromosoma pueden pasar a otras posiciones. Los efectos de estos cambios pueden ser desde silenciosos hasta dramáticos afectando incluso la viabilidad del organismo. Pero en algunas situaciones los cambios producen un organismo que resulta viable y que incluso se adapta mejor y evoluciona. Este hecho aceptado, nos permite comparar secuencias, bajo la hipótesis que los genes de los organismos se parecen a los de sus ancestros y que cuanto más cercanos estén evolutivamente, estos genes se parecerán más.

11 Modelo Evolutivo: De esta forma aceptamos que todos los organismos proceden de un organismo base (LUCA, Last Universal Common Ancestor) y comparando sus secuencia podríamos establecer esta relación evolutiva. Lamentablemente, muchos de los organismos intermedios han desaparecido y lo que tenemos es solo una colección incompleta de datos a partir de los cuales debemos inferir estas relaciones

12 La versión ampliada de este tema se encuentra en los apuntes del Tema 3: Análisis de Secuencias, accesibles a través de la plataforma de aprendizaje virtual de la UNIA. Consulta estos materiales para completar tus conocimientos