11 knúmero de publicación: kint. Cl. 6 : C12N 15/12

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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 6 : C12N 1/12 C07K 14/8 A61K 38/16 C12P 21/02 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 k Número de solicitud europea: k Fecha de presentación : k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: ADNc para un péptido natriurético de tipo C de rata, y proteína precursora. k Prioridad: JP 2474/90 k 73 Titular/es: Suntory Limited 1-, Dojimahama 2-chome Kita-ku, Osaka-shi, Osaka, JP Matsuo, Hisayuki k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Matsuo, Hisayuki; Kojima, Masayasu; Kangawa, Kenji y Minamino, Naoto k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Ungría López, Javier ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCION Esta invención se relaciona con un ADNc codificante de un CNP (péptido natriurético de tipo C de rata, abreviado aquí a continuación como rcnp), así como con la proteína precursora del rcnp (prepro rcnp) codificada por dicho ADNc. En los últimos años han sido descubiertos diversos péptidos a los que se hace referencia, de forma colectiva, como péptidos natriuréticos ( NP ) procedentes de los atrios y de los cerebros de diversos animales. Estos NP han sido hoy clasificados en tres tipos, el péptido natriurético de tipo A ( ANP ), el péptido natriurético de tipo B ( BNP ) y el péptido natriurético de tipo C ( CNP ), dependiendo de las similitudes en la secuencia primaria de aminoácidos y de la estructura de sus precursores. Entre los tres tipos, el ANP y el BNP fueron primeramente aislados e identificados a partir del atrio y del cerebro y de aquí que, a veces, se les denomine péptido natriurético atrial y péptido natriurético cerebral, respectivamente (Matsuo, H. y Nakazato, H., Endocrinol. Metab. Clin. North Am., 16, 43, 1987; Sudoh, T. y col., Nature, 332, 78, 1988). Sin embargo, hoy se sabe que el ANP aparece no sóloenelatrio,sino también en el cerebro y que el BNP aparece no sólo en el cerebro, sino también en el atrio. Además, tanto el ANP como el BNP exhiben significativas acciones natriuréticas e hipotensoras, de forma que queda claro que cada uno de estos péptidos funciona no sólo como hormona secretada del atrio a la sangre, sino como transmisor nervioso en el cerebro, ayudando en cualquiera de los casos a regular el equilibrio homeostático del volumen de fluidos corporales y de la presión sanguínea en mamíferos. El CNP ha sido aislado e identificado muy recientemente del cerebro porcino por Sudoh y col. como un tercer tipo de NP que no es asignable ni al ANP ni al BNP (Sudoh, T. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 168, 863, 1990). El primer CNP descubierto consistía en 22 residuos de aminoácidos (este péptido es abreviado a continuacióncomo pcnp-22. Como el ANP y el BNP, el CNP contiene contenía dos residuos de cisteína que formaban un enlace disulfuro intramolecular, produciendo una estructura de anillo compuesta de 17 residuos de aminoácidos. Además, la secuencia primaria de aminoácidos que forma esa estructura de anillo en pcnp-22 resultó ser altamente homóloga a la del ANP y a la del BNP. Sin embargo, el pcnp-22 difiere del ANP y del BNP en que los últimos tienen varios residuos de aminoácidos adicionalmente unidos al extremo C de la estructura de anillo, mientras que no está presente ninguna de tales estructuras de cola en el pcnp-22. En otras palabras, el extremo C de pcnp-22 termina con un residuo de cisteína. En base a estos hechos, se ha visto que la estructura del pcnp-22 es similar a, pero claramente distinguible de, las de ANP y BNP. Además, pcnp-22 exhibía acciones natriuréticas e hipotensoras y se vio también que mostraba una mayor actividad que ANP y BNP en los ensayos de actividad relajante en muestras rectales de pollo. A partir de estas observaciones, se vio que pcnp-22 era un NP asignable a un nuevo tipo, cuyos péptidos fueron denominados CNP. A continuación del pcnp-22, los presentes inventores aislaron e identificaron un segundo péptido asignable como CNP del cerebro porcino (véase Minamoto y col., BBRC, 170(2), 1990, p ). Se vio que el péptido consistía en 3 residuos de aminoácidos con pcnp-22 presente en el extremo C (este péptido es abreviado a continuación como pcnp-3). En otras palabras, se vio que el pcnp-3 era un péptido que tenía 31 residuos de aminoácidos más unidos al extremo N del pcnp-22. Es suficientemente interesante que el pcnp-3 ha resultado aparecer en una cantidad mayor que el pcnp-22 en el cerebro porcino (Solicitud de Patente Japonesa N 18682/1990 comúnmente asignada). Otro estudio muy reciente tuvo éxito en la identificación de la estructura del precursor de pcnp-22 ydepcnp-3poranálisis génico y esto ayudó a desvelar el mecanismo que se oculta tras la biosíntesis de aquellos péptidos (Solicitud de Patente Japonesa N 18683/1990 comúnmente asignada y EP-A ). Los presentes inventores aislaron e identificaron un gen y un ADNc cromosómicos porcinos codificantes de pcnp-22 y pcnp-3; por sus análisis, la estructura de la proteína precursora del CNP porcino (prepro pcnp) quedó desvelada; al mismo tiempo, se vio que cada uno de pcnp-22 y pcnp-3 era traducido primeramente a partir de ARNm como una prepro pcnp compuesta de 126 residuos de aminoácido y que el péptido de señal presente en la región N-terminal de la proteína precursora era entonces escindido en el procedimiento de secreción para ser convertido en pro pcnp, que fue posteriormente escindida de manera específica con enzimas procesadoras para ser convertida en pcnp-3 o pcnp-22 según fuera apropiado. En base a estas observaciones, se vio que, en el caso del ANP y del BNP, tanto pcnp-22 como pcnp-3 son péptidos secretores biosintetizados a partir de una proteína precursora común (prepro pcnp). Sin embargo, en agudo contraste con los péptidos asignables a ANP y BNP, que, según se ha visto por estudios previos, funcionan no sólo como hormonas segregadas desde el atrio a la sangre, sino también como transmisores nerviosos en el cerebro, regulando de este modo el equilibrio homeostático del volumen 2

3 de fluido corporal y de la presión sanguínea, el CNP sigue sin estar claro en muchos puntos concernientes a su distribución in vivo y a sus acciones fisiológicas En cuanto al ANP y al BNP, sus estructuras han sido establecidas en ratas y las acciones fisiológicas en ratas del ANP y del BNP de rata han sido también desveladas, realizando la evaluación de su eficacia farmacéutica con cuidado para eliminar los posibles efectos debidos a diferencias en la especie animal. Sin embargo, hasta la fecha, no se ha identificado la estructura del CNP en ratas. La presente invención ha sido llevada a cabo en estas circunstancias y tiene como objeto identificar las estructuras de CNP en ratas (rcnp), particularmente la estructura de la proteína precursora que corresponde a la prepro pcnp en porcino. La Fig. 1a muestra el mapa de enzimas de restricción para el gen cromosómico de la proteína precursora de rcnp (fragmento de ADN BamHI) y la región cuya secuencia de bases fue determinada. La Fig. 1b muestra la secuencia de bases determinada y la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína precursora de rcnp codificada por ella. La Fig. 2 muestra la secuencia de bases completa del ADNc de CNP y la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína precursora de rcnp codificada por ella. Observando que la secuencia de aminoácidos del ANP y la secuencia de bases del gen que la codifica son mantenidas con una elevada homología a través de las especies animales, los presentes inventores pensaron que habría una gran probabilidad de que la misma situación se produjese en el CNP. En base a esta suposición, los presentes inventores proyectaron un programa en el cual se aisló eladncdercnp usando la sonda de ADN (pdc-3) que utilizaron previamente en el aislamiento del gen o del ADNc cromosómico del CNP porcino y se analizó el ADNc aislado para identificar la estructura de la proteína precursora de los rcnp. Según este programa, los presentes inventores estudiaron en primer lugar una librería génica cromosómica de rata (vector de fago λ que incorpora un fragmento de gen cromosómico) utilizando pdc-3 como sonda de ADN y obtuvieron clones que se hibridaban con pdc-3 en condiciones suaves. El análisis de uno de esos clones (λrcnp G3) mostró que dicho clon albergaba aproximadamente 14 kpb del gen cromosómico de rata y que un fragmento de ADN BamHI de aproximadamente 2,1 kpb de esos 14 kpb se hibridaba con la sonda de ADN pdc-3. Cuando parte de este fragmento de ADN BamHI de aproximadamente 2,1 kpb fue determinada en cuanto a su secuencia de bases, resultó evidente que el ADN de interés codificaría para el gen rcnp. El mapa de enzimas de restricción para el fragmento BamHI y la región cuya secuencia de bases fue determinada (según indican las flechas) aparecen en la Fig. 1a y la secuencia determinada de bases y la secuencia de aminoácidos codificada por ella aparecen en la Fig. 1b. En la siguiente etapa, se estudió una librería de ADNc de cerebro de rata usando como sonda un fragmento de ADN de pb codificante de rcnp-22 cortado a partir del fragmento de ADN BamHI anteriormente mencionado con enzimas de restricción SmaI y MvaI (a continuación, se hace referencia al fragmento de ADN de pb como rdc-22). Como resultado, se obtuvieron 22 clones que hibridaban con rdc-22 y, de esos 22 clones, se vio que el que llevaba el ADNc más largo (aproximadamente 1 kpb) era λrcnp 21. En base a este resultado, se determinó la secuencia de bases completa del fragmento de ADNc compuesto por aproximadamente 1 kpb que era portado por dicho λrcnp 21. Como resultado, se vio que el fragmento de ADNc codificaba para la secuencia completa de aminoácidos de la proteína precursora de rcnp (véase la Fig. 2). Primeramente, el fragmento de ADN en discusión contenía un marco de lectura abierta largo que comenzaba con ATG y que existía en las posiciones 1-3 de la secuencia de bases. Como este ATG era el primer codon de metionina que aparecía en el ADNc y como la secuencia de bases alrededor del codon estaba de acuerdo con la secuencia consenso de un codon de iniciación de la traducción, A/G NNATG (N representa cualquiera de A, T, G y C), que se sabe existe en eucariontes, los presentes inventores estimaron que el ATG de interés sería un codon de iniciación de la traducción para el precursor de rcnp. Se vio que el marco de lectura abierta de interés codificaba un polipéptido compuesto por 126 residuos de aminoácido. También se vio que su secuencia primaria de aminoácidos estaba muy de acuerdo con la del precursor de pcnp. En base a estos hallazgos, los presentes inventores estaban convencidos de que el 3

4 ADNc obtenido era definitivamente un ADNc codificante de rcnp Tal como se ha descrito anteriormente, los presentes inventores aislaron ADNc rcnp y lo analizaron, identificando asíconéxito la proteína precursora de rcnp como un polipéptido compuesto de 126 residuos de aminoácido con la secuencia primaria de aminoácidosmostrada en la Fig. 2. En la región C-terminal de la secuencia primaria de aminoácidos así identificada de la proteína precursora de rcnp (a continuación abreviada como prepro rcnp), CNP-22 de rata, que era la secuencia correspondiente a pcnp-22 cuya estructura fue primeramente determinada a partir de cerebro porcino (rcnp-22: posiciones -126 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 2) y CNP-3 de rata, que era la secuencia correspondiente a pcnp-3 cuya estructura fue también primeramente determinada a partir de cerebro porcino (rcnp-3: posiciones de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 2) y, además, pcnp-22 y pcnp-3 estaban completamente de acuerdo con rcnp-22 y rcnp-3, respectivamente, en términos de secuencia de aminoácidos. Para la síntesis de esos péptidos, sería indispensable que su precursor fuera escindido con enzimas procesadoras. Dado que las secuencias de aminoácidos de prepro rcnp en áreas próximas a las posiciones 22 y 3 a partir del extremo C de prepro rcnp, donde tendría lugar el procesado, estaban en completo acuerdo entre rata y cerdo, la posibilidad de que rcnp-22 o rcnp-3 sean sintetizados en el cerebro de rata sería extremadamente elevada. Además, como en el caso del cerdo, una región rica en residuos de aminoácido hidrofóbicos (en las posiciones -16 de la secuencia primaria de aminoácidos mostrada en la Fig. 2) estaba presente en la región N-terminal de prepro rcnp; de aquí que, en vista de este hecho, hay una elevada posibilidad de que el péptido señal necesario para la secreción exista en la región N-terminal de prepro rcnp. Tomando en consideración los hechos anteriormente discutidos, rcnp-22 y rcnp-3 son presumiblemente sintetizados por la siguiente ruta. En primer lugar, prepro rcnp, compuesto por 126 residuos de aminoácido, es traducido a partir de ARNm. Se escinde entonces el péptido señal presente en la región N-terminal de prepro CNP para la conversión a pro rcnp en el proceso de la secreción. Además, pro rcnp es escindido por enzimas procesadoras en posiciones específicas (entre las posiciones 73 y 74 de la secuencia primaria de aminoácidos que es mostrada en la Fig. 2 y entre las posiciones 4 y de la misma secuencia) para convertirse en rcnp-3 y rcnp-22. En resumen, los presentes inventores aislaron ADNc codificante de la proteína precursora de los rcnp (rcnp-22 y rcnp-3) los analizaron para identificar la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína precursora de rcnp. Al mismo tiempo, identificaron con éxito las estructuras de los CNP de rata (rcnp- 3 y rcnp-22) correspondientes a los CNP de cerdo (pcnp-3 y pcnp-22). La presente invención ha sido llevada a cabo en estas circunstancias. Los siguientes ejemplos son facilitados con el fin de ilustrar aún más la presente invención, pero en modo alguno han de ser considerados como limitantes. Ejemplo 1 Aislamiento del gen cromosómico codificante de la proteína precursora de CNP de rata 4 0 Se infectó LE 392 derivado de la cepa K12 de E. coli con una librería de ADN de fago del gen cromosómico porcino (producto de Clonetech Co.) guardada a 4 C. Se plaquearon las células en un medio LB ( g, bactotriptona; g, levadura de cerveza; g, NaCl; 1,%, bactoagar; volumen total, 1 L) y se cultivó durante la noche a 37 C. Se enfrió laplacaa4 C durante minutos y se dejó reposar un filtro de nitrocelulosa (producto de Shleicher & Schnell Co.) sobre la placa del fago durante minutos. A continuación, se retiró el filtro de la placa, se secó con aire, se sumergió en una solución alcalina de desnaturalización (NaOH 0, M y NaCl 1, M) durante 1 minuto y se sumergió después en una solución neutralizante (Tris-HCl 0, M; ph 7,0; NaCl 1, M) durante 1 minuto. A continuación, se lavó elfiltro de nitrocelulosa con 3 x solución SSC ( x SSC NaCl, 17,3 g; citrato trisódico, 88,2 g; volumen total, 1 L), se secó con aire y se trató concaloravacíoa80 C durante 1 minutos. Usando el filtro de nitrocelulosa así preparado, se llevó a cabo la hibridaciónde placas en las siguientes condiciones. En primer lugar, se añadió una solución de prehibridación [3 x SSC; x solución de Denhardt (consistente en albúmina, polivinilpirrolidona y Ficoll, cada uno con un peso de 1 mg/ml); ADN de esperma de salmón, 0 µg/ml; % formamida; 0,1% SDS] al filtro de nitrocelulosa y se llevó a cabo la prehibridación a 37 C durante 2 horas. Después, utilizando 6 cpm de la sonda de ADN pdc-3 (el método de su preparación es descrito por los presentes inventores en la Solicitud de Patente Japonesa comúnmente asignada N 18683/1990) y 1 ml de la solución de prehibridación para dos láminas del filtro de nitrocelulosa, se llevó a cabo la hibridación durante la noche a 37 C. A continuación, se lavó el 4

5 filtro tres veces con una solución 3 x SSC que contiene SDS 0,1%, haciendo dos lavados a C durante minutos y un lavado a C durante minutos; se secó el filtro lavado con aire y se sometió aautorradiografía a -80 C durante 24 horas. Estudiando aproximadamente x clones de esta forma, se obtuvieron ocho clones que hibridaban con la sonda de ADN pdc-3. Uno de esos clones fue denominado λrcnpg3 yfuesometidoaanálisis en las etapas posteriores. Ejemplo 2 1 Análisis del fago λrcnp G3 y determinación de su secuencia de bases A. Análisis del ADN del fago λrcnp G3 Se preparó ADN a partir del fago λrcnp G3 de la forma usual. A continuación, se escindióeladndel fago con enzimas de restricción BamHI, EcoRI y PstI y se separaron los fragmentos resultantes de ADN y se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa. Se vio que λrcnp G3 era un fago que contenía un gen cromosómico de rata de aproximadamente 14 kpb. El análisis por Southern blotting usando la sonda de ADN pdc-3 mostró que el fragmento de ADN BamHI de aproximadamente 2,1 kpb, el fragmento de ADN EcoRI de aproximadamente 19 kpb y el fragmento de ADN PstI de aproximadamente 1,6 kpb se hibridaban cada uno con la sonda de ADN pdc-3. Se determinó la secuencia de bases de parte del ADN BamHI (2,1 kpb) que se hibridaba con la sonda de ADN pdc-3 por el método siguiente. B. Determinación de la secuencia de bases del fragmento de ADN BamHI 2 3 Con objeto de determinar la secuencia de bases del fragmento de ADN BamHI, se subclonó el último primeramente en un vector plasmídico puc 118 (Takara Shuzo Co., Ltd.) en el sitio BamHI. A partir del plásmido resultante (puc rcnp G3), se aisló un fragmento de ADN SmaI-XbaI ( pb) que se hibridaba con la sonda de ADN pdc-3 y se subclonó en vectores de fago M13 mp18 y 19. Usando un cebador universal, usando el fragmento de ADN de una sola hebra resultante como plantilla, se determinó la secuencia de bases de ADN del fragmento de ADN BamHI de interés mediante el método didesoxi con SEQUENASE (United States Biochemical Corporation) y un kit secuenciador de Takara Shuzo Co., Ltd. En la Fig. 1b se muestra la secuencia de bases del fragmento de ADN BamHI de interés que fue determinada por el método anteriormente descrito y la secuencia de aminoácidos predecible de esa secuencia de bases. Ejemplo 3 Preparación de la sonda de ADN (rdc-22) 4 Se preparó la sonda de ADN (rdc-22) usada para clonar el ADNc codificante de la proteína precursora rcnp por el método consistente en escindir el plásmido anteriormente mencionado puc rcnp G3 con enzimas de restricción SmaI y MvaI para aislar un fragmento de ADN de 14 pb y luego marcar el ADN con [α- 32 P] dctp usando un kit de marcaje multiceba de Takara Shuzo Co., Ltd. Ejemplo 4 Aislamiento de ADNc CNP de rata 0 A. Preparación de la librería de ADNc λgt Utilizando un método de guanidina-tiocianato, se extrajeron y aislaron 129 µg de ARN total de 2,7 g de cerebro de rata. Después, usando una columna de oligo(dt)-celulosa, se prepararon aproximadamente 84 µg de poli(a) + ARN a partir de 129 µg del ARN total. A continuación, usando 4 µg de poli(a) + ARN, se preparó un ADNc de doble hebra por el método de Gubler y Hoffman (Gubler, U. y col., Gene, 2, 263, 1983). Se ligó un adaptador EcoRI de 13 pb al ADNc resultante y se sometió el producto a fraccionamiento por tamaños por electroforesis en gel de agarosa 1%. Se ligó eladncasíobtenido, compuesto por 0-0 pb, a un brazo de fago λgt y, mediante posterior empaquetamiento in vitro, se preparó una librería de ADNc que consistía en 4,7-11,1 x 6 clones independientes por microgramo de poli(a) + ARN.

6 B. Estudio de la librería de ADNc Se estudiaron aproximadamente 6 x clones de la librería de ADNc obtenida en la etapa A usando la sonda rdc-22 de ADN preparada en el Ejemplo 4. El método de estudio era el mismo que el adoptado en el Ejemplo 2, excepto porque se utilizó c0hfl como células y porque la concentración de formamida en la solución de hibridación era del 0%, con x SSPE ( x SSPE, NaCl 3 M, fosfato primario de sodio 0,2 M y EDTA 0,02 M). Se realizaron dos lavados con 2 x SSC que contenía SDS 0,1% a 6 C durante minutos cada vez. Como resultado del estudio, se obtuvo un clon que se hibridaba con la sonda de ADN rdc-22 y se le designó λrcnp 21. C. Análisis del fago λccnp y determinación de su secuencia de bases Primeramente, se preparó ADN a partir del fago λrcnp 21 del modo usual. La escisión de este ADN con una enzima de restricción EcoRI mostró que λrcnp 21 contenía aproximadamente 1 kpb de ADNc. Para el análisis final del ADNc, se subclonó primeramente el fragmento de ADN de 1 kpb en el fago M 13 y luego se determinó la secuencia de bases del ADN por un método didesoxi. En la Fig. 2 se muestra la secuencia de bases así determinada del ADNc y la secuencia primaria de aminoácidos predecible a partir de ella. Según se ha descrito en las páginas precedentes, los presentes inventores aislaron parte del gen rcnp de una librería de genes cromosómicos de rata usando pdc-3 como sonda. Usando el gen rcnp aislado como sonda, se sintetizó conéxito un ADNc codificante de toda la región del precursor rcnp y se aisló a partir de ARNm derivado del cerebro de rata. Como resultado, se verificó que existía un gen codificantedecnptambién en ratas así como en cerdos. Los presentes inventores determinaron además la estructura completa de la proteína precursora de rcnp. Como en cerdos, la proteína precursora de rcnp en ratas estaba compuesta por 126 residuos de aminoácidos y contenía en el extremo C la secuencia de aminoácidos que correspondía a pcnp-3 y pcnp-22 aislada del cerebro de cerdo. Como las secuencias de aminoácidos de esos péptidos en el sitio de procesamiento estaban en completo acuerdo entre cerdo y rata, se predice que esos péptidos serían también biosintetizados en ratas a través de una ruta similar a la implicada en cerdos y que funcionarían como hormonas o transmisores nerviosos que regulan el equilibrio homeostático del volumen de fluidos corporales y la presión sanguínea in vivo. Si el ADNc codificante del precursor de rcnp es expresado en células animales y si la proteína o péptido segregado fuera de las células es aislado e identificado, las actividades fisiológicas de tres nuevos péptidos que son biosintetizados a partir del precursor de rcnp, pero que no pueden ser sintetizados a partir del precursor de pcnp (es decir, especie modificadas de prepro rcnp que son específicamente escindidas en el extremo C de los residuos de lisina en las posiciones 24 y de la secuencia primaria de aminoácidos y del residuo de arginina en la posición 33) pueden ser investigadas. Lo que merece la pena observar en particular en la presente invención es que las estructuras de rcnp- 3 y rcnp-22 fueron identificadas como enteramente iguales a las de cerdo. Esto confirma el hecho de que las actividades fisiológicas del pcnp que han sido hasta ahora evaluadas con ratas reflejan la correcta medición no influida por diferencias en la especie animal. Además, los sitios de expresión de los CNP en ratas pueden ser examinados correctamente usando el ADNc codificante de los CNP de rata obtenidos en la presente invención. La información obtenida por la presente invención concerniente al ADNc de la proteína precursora de rcnp y su secuencia primaria de aminoácidos hará grandes contribuciones no sólo a los futuros estudios para desvelar el mecanismo que se halla detrás de la biosíntesis y de las acciones fisiológicas de los CNP en mamíferos, sino también a los esfuerzos por establecer aplicaciones farmacéuticas de péptidos asignables a la familia CNP. 6

7 REIVINDICACIONES Un métodoparalapreparación de un polipéptido que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Met His Leu Ser Gln Leu Ile Ala Cys Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Leu Arg Pro Ser Glu Ala Lys Pro Gly Thr Pro Pro Lys Val Pro Arg Thr Pro Pro Gly Glu Glu Leu Ala Glu Pro Gln Ala Ala Gly Gly Asn Gln Lys Lys Gly Asp Lys Thr Pro Gly Gly Gly Gly Ala Asn Leu Lys Gly Asp Arg Ser Arg Leu Leu Arg Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu His Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Gly Asn Lys Lys gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 2. Un método según la Reivindicación 1, en el que el polipéptido es deficiente en el péptido en el extremo N porque se escinde entre cualesquiera dos residuos de aminoácido adyacentes en dicha secuencia de aminoácidos en las posiciones 1-48 del extremo N. 3. Un método para la producción de un ADN codificante de un polipéptido que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Met His Leu Ser Gln Leu Ile Ala Cys Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Leu Arg Pro Ser Glu Ala Lys Pro Gly Thr Pro Pro Lys Val Pro Arg Thr Pro Pro Gly Glu Glu Leu Ala Glu Pro Gln Ala Ala Gly Gly Asn Gln Lys Lys Gly Asp Lys Thr Pro Gly Gly Gly Gly Ala Asn Leu Lys Gly Asp Arg Ser Arg Leu Leu Arg Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu His Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Gly Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 4. Un método según la Reivindicación 3, donde el ADN consiste en la siguiente secuencia de bases: ATG CAC CTC TCC CAG CTG ATC GCC TGT GCC CTG CTG CTC GCG CTA CTC TCA CTC CGG CCC TCC GAA GCC AAG CCC GGG ACA CCA CCG AAG GTC CCG AGA ACC CCG CCA GGG GAG GAG CTG GCA GAG CCC CAG GCA GCT GGT GGC AAT CAG AAA AAG GGT GAC AAG ACT CCA GGC GGC GGG GGA GCC AAT CTC AAG GGA GAC CGA TCG CGA CTG CTT CGG GAC CTG CGT GTG GAC ACC AAG TCC CGG GCG GCG TGG GCT CGC CTT CTG CAC GAG CAC CCC AAC GCG CGC AAA TAC AAA GGC GGC AAC AAG AAG GGC TTG TCC AAA GGC TGC TTT GGC CTC AAG CTG GAC CGG ATC GGC TCC ATG AGC GGT CTG GGA TGT. Un métodoparalaproducción de un ADN codificante de una porción de un polipéptido que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos, siendo dicha porción una que queda después de eliminar el péptido en el extremo N por escisión entre cualesquiera dos residuos de aminoácido adyacentes en dicha secuencia de aminoácidos en las posiciones de 1-48 del extremo N: 7

8 Met His Leu Ser Gln Leu Ile Ala Cys Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Leu Arg Pro Ser Glu Ala Lys Pro Gly Thr Pro Pro Lys Val Pro Arg Thr Pro Pro Gly Glu Glu Leu Ala Glu Pro Gln Ala Ala Gly Gly Asn Gln Lys Lys Gly Asp Lys Thr Pro Gly Gly Gly Gly Ala Asn Leu Lys gly Asp Arg Ser Arg Leu Leu Arg Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu His Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Gly Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 6. Un método para la producción de un ADN que tiene la siguiente secuencia de bases: CC GCA CAG CAG TAG GAC CCG TGC TCG CTT GGC AAT CCT GCT CTG CAA CCG CTT GTC GGA CTG CTC ACC GGC CGT CCC GGC TGC AGA CTG TCT GCA CCC CTC GGT CCC ATC GGC ACC ATG CAC CTC TCC CAG CTG ATC GCC TGT GCC CTG CTG CTC GCG CTA CTC TCA CTC CGG CCC TCC GAA GCC AAG CCC GGG ACA CCA CCG AAG GTC CCG AGA ACC CCG CCA GGG GAG GAG CTG GCA GAG CCC CAG GCA GCT GGT GGC AAT CAG AAA AAG GGT GAC AAG ACT CCA GGC GGC GGG GGA GCC AAT CTC AAG GGA GAC CGA TCG CGA CTG CTT CGG GAC CTG CGT GTG GAC ACC AAG TCC CGG GCG GCG TGG GCT CGC CTT CTG CAC GAG CAC CCC AAC GCG CGC AAA TAC AAA GGC GGC AAC AAG AAG GGC TTG TCC AAA GGC TGC TTT GGC CTC AAG CTG GAC CGG ATC GGC TCC ATG AGC GGT CTG GGA TGT TAG TGC AGC GAC CCC TGG CGG CGG ATT GGG AAC TGC ACT GTG CAC TGA GGT CAT CCT TGG TCA TCA GCC TCC AGC ATC TGG AAA CAC CTC CAA CGC AAT GTG GCT TTT ACA TTT CTT TTT ATT TTT TCC TCC TGG TAC TGG CAA TAC ACA ACA CCA GCT GTT TTA TTA TTA TTT GGG GAG GGG AGG GGA TGA TTT TAT TGT TTG GGG TTT TTT TTT TGA AAA TGA AAA ATA AAA AAT TAT ATA TTA TAT ATA TAT TAT ATA CAT GAG ACA CAC ACT CCC ACA CCG ACT TGA TGA CAA GGG ACG GTT TTT AAA GTG ACT GAC AAA ACC AGC TAG CTG TAA AAA CAT TGC TGT TTG TAA ATT CAC ATC ATG CAT AAA TGT ATT TAT GTT GTA AAG CTA TTT ATA TTG TTT ATA AAG AGA TAT TTA TAA AAA TTT TAT TTA TGT AAC TAA ATG AAA GAA GCC AAC CAT TGT AAT GTT TTT GTC CTA ACT AGT TGA AAA AAA ATG TTA AAA AAA AAA AAG CCA TTC CAT G(Poli A) 0 NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté onoincluída en la mencionada reserva. 8

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