Utilidad de la Biología Molecular en el Diagnóstico y Vigilancia del Dengue

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1 Utilidad de la Biología Molecular en el Diagnóstico y Vigilancia del Dengue José Usme Ciro Unidad de Secuenciación y Análisis Genómico Grupo de Virología Instituto Nacional de Salud

2 Virus dengue (DENV) Flaviviridae Flavivirus Virus envuelto, citoplasmático Icosaédrico, nm DENV-1, -2, -3, -4 Zhang et al., Nat. Struct. Biol. 10: Fuente: Eddie Holmes

3 DENV Organización Genómica RNA de cadena sencilla Polaridad positiva Lineal ~ 11 Kb 10 genes: C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5 5 and 3 UTRs Elementos importantes en replicación y traducción Caperuza 7 metil Guanosina en el extremo 5 SLA SLB chp PK2 PK1 3 SL 5 UTR C / C prm/m E Estructural 1 2A 2B 3 4A 4B 5 No Estructural 3 UTR (Usme-Ciro et al Virol J 10:185)

4 Diagnóstico: Especificidad vs. Oportunidad (Peeling et al Nat Rev Microbiol 8(12 Suppl):S30-8)

5 Diagnóstico Molecular: Fase Aguda RT y PCR PCR anidada RT-PCR RT-LAMP RT-qPCR Sondas SYBR Green (Simmons et al N Engl J Med 366: )

6 Diagnóstico Molecular: Variabilidad Genética Tasas de sustitución nucleotídica (sustituciones/sitio/año) DENV-1: 4,55 x 10-4 a 9,08 x 10-4 DENV-3: 9,01 x 10-4 a 10,4 x 10-4 DENV-2: 6,07 x 10-4 a 9,84 x 10-4 DENV-4: 6,02 x 10-4 a 10,63 x 10-4 (Twiddy et al Mol Biol Evol 20:122-9; Allicock et al Mol Biol Evol 29: ) (Gago et al Science 323:1308)

7 Diagnóstico Molecular: al Ritmo de la Evolución Viral 7

8 Diagnóstico Molecular: Oligonucleótidos Degenerados Re-diseño de oligonucleótidos empleados en la detección de DENV Serotipo Oligo Longitud(nt) Tm (ºC) Secuencia (5-3 ) 1 Posición de Codón 2 DENV D1_Modif D ,9 62,9 TC AAT ATG CTG AAA CGC GHG AGA AAC CG TC AAT ATG CTG AAA CGC GCG AGA AAC CG 2 2 DENV D2_Modif D ,2 60,9 -- GCA CCA RCA RTC WAY RTC WTC WGG --- TT GCA CCA ACA GTC AAT GTC TTC AGG TTC Según código de ambigüedad nucleotídica IUPAC ( 2 Posición de codón respecto al marco de lectura de la poliproteína del DENV. (Lanciotti et al J Clin Microbiol 30:545-51; Usme-Ciro et al Revista Salud Uninorte 28:16-30) RNA Viral D1_Modif D2_Modif

9 Diagnóstico Molecular: Riesgo de Contaminación Piscina olímpica: 50 m x 20 m x 2 m = m 3 = ml Muestra positiva (1 copia del genoma/ul): PCR Ciclo 40 = 2 40 = copias / = 550 copias / ml Preparación de mezclas Pre-PCR Extracción de Ácidos Nucleicos Adición de muestra PCR, qpcr PCR Anidada, Reacciones de Secuencia Electroforesis, purificación de amplicones Post-PCR Secuenciación

10 Diagnóstico Molecular: Construcción de Plásmidos Control RNA DENV DNA EXÓGENO RT PCR PCR 200 pb Clonación pgem-ns5 PCR 300 pb 300 pb 200 pb

11 Diagnóstico Molecular: Uso de dutp y Uracil-DNA-Glicosilasa

12 Vigilancia Virológica Serotipificación: Aislamiento viral e Inmunofluorescencia RT-PCR Genotipificación: RSS-PCR RT-PCR y Secuenciación Análisis filogenético: RT-PCR y Secuenciación Muestras de humanos: Suero Plasma Tejidos post-mortem Mosquitos: Adultos Huevos

13 La importancia de la posición de codón en el extremo 3 de los oligos Alineamiento DENV-4

14 La importancia de la posición de codón en el extremo 3 de los oligos Re-diseño de oligonucleótidos empleados en la serotipificación de DENV Serotipo DENV-1 DENV-2 DENV-3 DENV-4 Oligo TS1_Modi f TS1 TS2_Modi f TS2 TS3_Modi f TS3 TS4_Modi f TS4 Longitud(nt) Tm (ºC) 64,2 60,0 64,3 61,5 60,0 52,1 54,2 50,1 Secuencia (5-3 ) 1 GG TTC CGY CTC AGT GAT YCG RG CGT CTC AGT GAT CCG GGG G GAA YGC CAC MAR GGC CAT GAA CA- --- CGC CAC AAG GGC CAT GAA CAG TGY TGC TGG YAA YAT CAT CAT GAG TAA CAT CAT CAT GAG ACA GAG C -TC TGT YGT YTT RAA CAA GAG AG CTC TGT TGT CTT AAA CAA GAG A- Posición de Codón Según código de ambigüedad nucleotídica IUPAC ( 2 Posición de codón respecto al marco de lectura de la poliproteína del DENV. (Lanciotti et al J Clin Microbiol 30:545-51; Usme-Ciro et al Revista Salud Uninorte 28:16-30) Porcentaje de cambios no sinónimos según posición de codón: 3ª posición: 30 % 1ª posición: 96 % 2ª posición: 100 %

15 Serotipificación de DENV mediante RT-PCR RNA Viral Condiciones de Lanciotti et al. Lanciotti et al., 1992 Usme-Ciro et al., 2012 D1_Modif D1_Modif D1_Modif D1_Modif D2_Modif TS1_Modif TS4_Modif TS3_Modif D1_Modif TS2_Modif Condiciones de Usme-Ciro et al. Lanciotti et al., 1992 Usme-Ciro et al., 2012 (Lanciotti et al J Clin Microbiol 30:545-51; Usme-Ciro et al Revista Salud Uninorte 28:16-30)

16 RT-PCR en Tiempo Real DENV-1 DENV-2 RNasa P DENV-3 DENV-4 (Johnson et al J Clin Microbiol 43: ) (CDC DENV-1-4 Real-Time RT-PCR Assay for Detection and Serotype Identification of Dengue Virus)

17 DENV-4 Vigilancia de Genotipos Muestras Secuenciación (Usme-Ciro et al., Tesis de Maestría en Biología. Universidad de Antioquia; Usme-Ciro et al., Hechos Microbiológicos 4(2, Supl.1):67)

18 Determinantes de severidad 18 Infecciones secundarias con serotipos heterólogos Edad Raza Cepa viral Serotipo Genotipo Elementos en 5 y 3 UTRs Proteínas estructurales Proteínas no estructurales (Mukhopadhyay et al Nat Rev Microbiol 3:13-22) SLA SLB chp PK2 PK1 3 SL * * * * * * Secuenciación de Última Generación (NGS) Genomas Virales Completos

19 Cambios que han acompañado la entrada y dispersión del DENV-2 en las Américas y en Colombia 491 (ValAla) En linaje Asiático- Americano Reversión Efecto? 340 (MetThr) Dominio III Adaptativo? 359 (ThrAla) Glicosilación Extinción? Fitness? 462 (IleVal) Cosmopolita (Usme-Ciro et al., Tesis de Maestría en Biología. Universidad de Antioquia)

20 Muchas gracias!!! Dirección: REDES EN SALUD PUBLICA Subdirección: Laboratorio Nacional de Referencia Grupo: Virología Funcionario: José A. Usme Ciro Instituto Nacional de Salud Teléfono (57-1) Extensión 1428 Bogotá, COLOMBIA Línea gratuita nacional:

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