Nuevas aproximaciones en el diagnostico molecular de la tuberculosis

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María José Gutiérrez Carrizo
hace 5 años
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identificación de mutaciones de resistencia a isoniacida y rifampicina

1 Nuevas aproximaciones en el diagnostico molecular de la tuberculosis Optimización de la metodología HRM (High Resolution Melting) para la identificación de mutaciones de resistencia a isoniacida y rifampicina en cepas de MTB Heinner Guio MD, PhD Instituto Nacional de Salud Noviembre 7, 2013

2 Sub clinica Clinica Complejidad en DX Inmunologicos Severidad BK Cultivo Moleculares Que tanto conocemos de la Infeccion por MTB? Tuberculosis Activa 8 millones/ año Tuberculosis Latente 2 billones

3 Estudios de sensibilidad Medio solido Löwenstein-Jensen (Middlebrook) 3-4 semanas Medio liquido BACTEC 460 TB MGIT 7-10 dias Metodos moleculares InnoLipa GenoTypeMTBDR Xpert MTB HRM Hours 1day

4 Fluorescencia Principio del HRM Por ejemplo, para TB-MDR H37Rv: cepa control pansensible Gen rpoβ: 81pb resistente a RIF sensible a RIF H37Rv Temperatura Gráfico de Gráfico de diferenciación diferenciación resistente a RIF

5 Antecedentes n = 87 cepas Sensibilidad katg /inha 95.7% Sensibilidad rpob 94.4% Especificidad katg /inha 97.8% Especificidad rpob 98.6% n = 40 esputos Sensibilidad katg /inha y rpob 100% Especificidad katg /inha y rpob 100%

6 Estrategia de evaluacion LBM - Diresa Callao Optimizacion de HRM en muestras de cutlivo LBM- Lab de Micobacterias INS Validacion de la metodologia HRM en muestras de esputo Blgo. Marco Galarza, INS Blgo. David Tarazona, INS Blgo. Manuel Fasabi, INS Dra. Mitzi Rodríguez Farfán, DIRESA Callao Blga. Edith Castillo, DIRESA Callao Blgo. Marco Galarza, INS Blgo. David Tarazona, INS Blgo. Manuel Fasabi, INS Blga. Neyda Quispe, INS

7 Regiones genómicas asociadas con susceptibilidad a agentes antituberculosos Estreptomicina Antibiótico Gen Producto Frecuencia de mutación (%) rpsl rrs Prot. Ribosomal S12 RNAr 16S Rifampicina rpoβ Subunidad β RNApol > < 10 Isoniacida katg ahpc inha kasa ndh Catalasa-peroxidasa Alkilhidroxireductasa Enoyl ACP reductasa β ketoacil ACP sintetasa NADH deshidrogenasa < 10 < 10 NA Etambutol embcab Arabinosiltransferasas 70 Pyrazinamida pnca Amidasa Etionamida inha etha Enoyl ACP reductasa Flavoprot. monooxigenasa Kanamicina rrs RNAr 16S 65 Fluoroquinolonas Capreomicina gyra gyrb tlya rrs Subunidad α DNA girasa Subunidad β DNA girasa RNAr metiltransferasa RNAr 16S Acido para-aminosalicilico thya Timidilato sintetasa NA < 10 NA > 90 NA NA NA

8 Antecedentes

9 Estandarización de la metodología HRM para la detección de TB-MDR en cepas de Mycobacterium tuberculosis

10 Materiales y métodos 1) Material biológico: ADN a partir de cepas de MTB del laboratorio de micobacterias de la DIRESA Callao. 2) Tamaño de la muestra: n = cepas sensibles a RIF e INH por APP - 86 cepas resistentes a RIF e INH (MDR) por APP 3) Método de extracción: - Extracción de ADN por kit

11 Flujograma de trabajo Tiempo 10 minutos cepa MTB Inactivación por calor (80C) Laboratorio de Micobacterias de la DIRESA. Callao 45 minutos Extracción de ADN 120 minutos PCR en tiempo real y análisis HRM Aprox. 2 horas para resultado Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular. INS Verificación por secuenciamiento de las mutaciones

12 Resultados

13 Fluorescence Curvas de dilución de ADN ng 1 ng 100 fg 10 fg 1 fg Cycle - Las muestras se corrieron por duplicado para cada gen. - Las concentraciones de ADN entre 10ng y 10fg discriminan adecuadamente - Se

14 Resultados de Sn y Sp 96 aislados sensibles n muestral 182 aislados = + 86 aislados MDR Isoniacida (katg) Sensibilidad: 94.1% Especificidad: 96.8% VPP: 96.4% VPN: 94.8% Isoniacida (mab-inha) Sensibilidad: 96.5% Especificidad: 85.4% VPP: 85.5% VPN: 96.4% Rifampicina ( Sensibilidad: 96.5% Especificidad: 96.8% VPP: 96.5% VPN: 96.8% MDR Sensibilidad: 96.5% Especificidad: 97.9% VPP: 97.6% VPN: 96.9%

15 Resultados de Sn y Sp 96 aislados sensibles n muestral 182 aislados = + 86 aislados MDR Isoniacida (katg) Sensibilidad: 94.1% Especificidad: 96.8% VPP: 96.4% VPN: 94.8% Isoniacida (mab-inha) Sensibilidad: 96.5% Especificidad: 85.4% VPP: 85.5% VPN: 96.4% Rifampicina ( Sensibilidad: 96.5% Especificidad: 96.8% VPP: 96.5% VPN: 96.8% MDR Sensibilidad: 96.5% Especificidad: 97.9% VPP: 97.6% VPN: 96.9%

16 Resultados de Sn y Sp 96 aislados sensibles n muestral 182 aislados = + 86 aislados MDR Isoniacida (katg) Sensibilidad: 94.1% Especificidad: 96.8% VPP: 96.4% VPN: 94.8% Isoniacida (mab-inha) Sensibilidad: 96.5% Especificidad: 85.4% VPP: 85.5% VPN: 96.4% Rifampicina ( Sensibilidad: 96.5% Especificidad: 96.8% VPP: 96.5% VPN: 96.8% MDR Sensibilidad: 96.5% Especificidad: 97.9% VPP: 97.6% VPN: 96.9%

Avance de secuenciamiento en 76/86 aislados de la región core (81pb) del gen rpob (95%) H37rv GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG GCG

17 Avance de secuenciamiento en 76/86 aislados de la región core (81pb) del gen rpob (95%) H37rv GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG 1 aislado GGC ACC AGC CAG CTG AGC CTA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG 1 aislado GGC ACC AGC CAG CTG AGC CCA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG 1 aislado GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATA GGC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG 1 aislado GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATA GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TTG GCG CTG 1 aislado GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG TAC CAG CAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG 13 aislados GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GTC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG 1 aislado GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC TAC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG 1 aislado GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CGC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG 1 aislado GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC GAC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG 1 aislado GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CTC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG 51 aislados GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TTG GCG CTG 1 aislado GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TGG GCG CTG 2 aislados sin mutaciones GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG

18 Conclusiones preliminares La metodología HRM ofrece una adecuada sensibilidad y especificidad para identificar TB-MDR. Es una metodología rápida (3 horas). Plan futuro Procesar muestras de esputo con baciloscopias positivas y negativas Realizar un análisis de costo frente a otras metodologías moleculares que se realizan en nuestro país. Extracción de ADN utilizando Chelex y mediante hervido (boiling)

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