Métodos moleculares para el diagnóstico de las bacterias de importancia médica y su drogo-resistencia

Transcripción

1 Métodos moleculares para el diagnóstico de las bacterias de importancia médica y su drogo-resistencia Dra. Elvira Garza González Profesor del Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina UANL

2 Métodos moleculares para el diagnóstico de las bacterias de importancia médica y su drogo-resistencia Neumonía asociada a ventilador Tuberculosis Multi-drogo resistencia

3 Desarrollo y estandarización de un método para la detección y cuantificación de bacterias causantes de neumonía asociada a ventilador Presentado por: Merab Magaly Rios Licea Como requisito parcial para obtener el grado de Maestro en Ciencias con Orientación en Microbiología Médica Director: Codirectores: Dra. Elvira Garza González Dr. Francisco Javier Bosques Padilla Dr. Juan Galindo Galindo

4 Neumonía Normal Es un proceso inflamatorio que se caracteriza por la presencia de un infiltrado exudativo y celular en el parénquima pulmonar. Neumonía Churchill Livingstone; 2000,

5 Neumonía asociada a ventilador La neumonía asociada a ventilador (NAV) se define como la neumonía que se desarrolla después de 48 h o más de ventilación mecánica. Es la infección más frecuente en pacientes de UCI Tiene una mortalidad tan alta como del 78% Ann Intern Med 1998; 129: 440. Crit Care Med 1999, 27: Am J Respir Crit Care Med 2005; 17: ; 139: 1058

6 NAV Neumonía de inicio temprano < 4 días de VM Enterobacterias Haemophilus spp Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus sensible a meticilina (SASM) Neumonía de inicio tardío > 4 días de VM Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii Stenotrophomonas maltophilia Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) Am J Respir Crit Care Med Chest 1995; 108: J Trauma 2004; 56:

7 Diagnóstico Criterios: Clínico Radiológico Microbiológico Am J Respir Crit Care Med 2005; 171:

8 Diagnóstico Clínico-Radiológico SIGNOS DE INFECCIÓN SISTÉMICA: Hipertermia (>38.2ºC) Secreciones purulentas Leucocitosis (> cel/cm 3) + INFILTRADO PULMONAR RADIOLÓGICO NUEVO Y PERSISTENTE Thorax 1999; 54: Am J Respir Crit Care Med 2005; 171:

9 Diagnóstico Clínico-Radiológico Utilidad diagnóstica: % son resultados falsos negativos % son resultados falsos positivos Muchas otras condiciones infecciosas y no infecciosas son similares clínicamente a la NAV. Chest 1993; 103: Crit Care Med 2002; 165:

10 Diagnóstico microbiológico: cultivo cuantitativo Cuenta de bacterias en una muestra de vías respiratorias inferiores mediante el método de dilución seriada. Muestra Cultivo cuantitativo Sensibilidad Especificidad Especimen obtenido con cepillo protegido 10 3 UFC/ml % % Lavado broncoalveolar 10 4 UFC/ml 42-93% % Aspirado traqueal 10 5 UFC/ml 38-82% 72-85% Critical Care Med 2004; 8: ; 28:

11 Diagnóstico microbiológico: Un resultado negativo no descarta la NAV, ya que la mayoría de los pacientes reciben antibióticos antes de la toma de la muestra. Se requieren de 4 a 7 días para la obtención de resultados. Am J Respir Dis 1993; 148: Chest 1998; 114:

12 PCR-Tiempo Real Ventajas: Es rápida. No requiere procesos adicionales de detección. Utiliza sistemas cerrados. Aplicaciones: Permite la identificación y cuantificación de agentes infecciosos de interés clínico. Caracterización genética de agentes infecciosos. Enferm Infecc Microbiol Clin 2004; 22:

13 Continuación... Detección de productos marcados en tiempo real Curva de calibración

14 Objetivo General Desarrollar y estandarizar un método para detectar y cuantificar simultáneamente bacterias causantes de neumonía asociada a ventilador Metas Incrementar la sensibilidad y especificidad de detección de los agentes causales de NAV. Reducir el tiempo necesario para la generación de resultados. (De días a horas) Reducir los costos de análisis.

15 Estrategia General Muestra Pacientes con NAV Pacientes sin NAV Objetivo 1 Selección de bacterias asociadas a NAV Diseño teórico de la prueba Diseño experimental de la prueba Objetivo 2 Cultivo Cuantitativo Extracción de DNA Objetivo 3 congelación Estandarización del método

16 Objetivo 1. Seleccionar las 4 bacterias más frecuentemente asociadas a NAV. Cultivo Cuantitativo Cultivo Tinción de Gram Pruebas bioquímicas primarias Perfil bioquímico + Siembra de diluciones Cuenta de UFC / ml

17 Objetivo 2. Diseñar una PCR de tiempo real para la detección y cuantificación de las bacterias seleccionadas en un mismo ensayo. Diseño teórico

18 Objetivo 2. Diseñar una PCR de tiempo real para la detección y cuantificación de las bacterias seleccionadas en un mismo ensayo. Diseño experimental Extracción del DNA de las cepas obtenidas en el objetivo 1 Cultivo puro Lisozima 37 C / 1 h Proteinasa K 55 C / 1 h Extracción con fenol-sevag φ Secado Precipitación con etanol Disolver el DNA Lavado

19 Objetivo 2. Diseñar una PCR de tiempo real para la detección y cuantificación de las bacterias seleccionadas en un mismo ensayo. Diseño experimental Estandarización de la PCR componentes concentración MgCl 2? amortiguador? Sondas diseñadas? Iniciadores diseñados? Taq DNA polimerasa Se ajustarán las condiciones de PCR para tener la máxima eficiencia de la PCR múltiple.

20 Objetivo 2. Diseñar una PCR de tiempo real para la detección y cuantificación de las bacterias seleccionadas en un mismo ensayo. Diseño experimental Elaboración de curvas de calibración Curva de calibración Aplicar la prueba desarrollada Añadir diluciones seriadas de suspensiones de las 4 bacterias a muestras de pacientes sin sospecha clínica de NAV Número de ciclos

21 Objetivo 3. Determinar de la utilidad diagnóstica de la prueba desarrollada. Aplicación del método desarrollado Muestras que se mantuvieron en congelación Extracción de DNA Detección y cuantificación de bacterias en la muestra Aplicación de la metodología desarrollada

22 Análisis Estadístico Cultivo cuantitativo Positivo Negativo Prueba desarrollada Positiva Negativa Verdadero positivo Falso negativo Falso positivo Verdadero negativo Parámetros a calcular: Sensibilidad Especificidad Precisión Reproducibilidad Valor predictivo positivo Valor predictivo negativo

23 Cultivo cualitativo-cuantitativo Resultados Características demográficas de la población Pacientes (n) 23 Masculino (%) 83 Rango de edad (años) Antibiótico terapia previa (%) 83 Infección previa (%) 17 Resultados de los cultivos Cultivos Positivos (cuenta 10 4 UFC/mL) n (%) Cultivos Negativos (cuenta < 10 4 UFC/mL) n (%) Cultivo indeterminado Muestras con al menos 1 de las bacterias seleccionadas n (%) Muestras con al menos 2 de las bacterias seleccionadas n (%) Muestras con al menos 3 de las bacterias seleccionadas n (%) 20 (86.95) 2 (8.7) 1 (4.35) 19 (95) 12 (60) 3 (15) Aislamientos de la población de estudio Staphylococcus aureus (n=13) 26% Acinetobacter baumannii (n=12) 24% Pseudomonas aeruginosa (n=6) 12% Stenotrophomonas maltophilia (n=3) 6% Pseudomonas putida (n=2) 4.9% Pantoea spp (n=2) 4.9% Enterobacter cloacae (n=1) 2.4% Klebsiella pneumoniae (n=1) 2.4% Klebsiella terrigena (n=1) 2.4% Burkholderia cepacia (n=1) 2.4% Proteus mirabilis (n=1) 2.4% Proteus vulgaris (n=1) 2.4% Proteus penneri (n=1) 2.4% Staphylococcus sciuri (n=1) 2.4% Citrobacter freundii (n=1) 2.4% Escherichia coli (n=1) 2.4% Langer y Liang, Bekele Afessa, Coombes, 2000.

24 Diseño teórico-experimental Resultados Diseño teórico S. maltophilia S. aureus A. baumannii P. aeruginosa Mezclas de reacción de 25 µl por cada muestra

25 Curvas de calibración. Análisis estadístico: LD Resultados Curvas de calibración LD: 1x10 4 LD: 1x10 3 Standard 0.5 McFarland: 1x10 8 UFC/mL y=-0.332x , r 2 = 0.99 Pseudomonas aeruginosa Standard 0.5 McFarland: 1x10 7 UFC/mL Staphylococcus aureus y=-0.331x , r 2 = 0.97 LD: 1x10 2 LD: 1x10 3 Standard 0.5 McFarland: 1x10 6 UFC/mL y=-0.253x , r 2 = 0.99 Acinetobacter baumannii Standard 0.5 McFarland: 1x10 7 UFC/mL y=-0.327x , r 2 = 0.98 Stenotrophomonas maltophilia *LD: copias del gen/ml

26 Aplicación de la RT-qPCR múltiple Comparación de resultados de ambos métodos Resultados Paciente 1 Cultivo Bacteria (s) A. baumannii, S. aureus, Escherichia coli Cuenta UFC/mL RT-qPCR múltiple Bacteria (s) Cuenta Copias del gen/ml 1.4x10 6 A. baumannii 1x A. baumannii, S. aureus 1.13x10 5 A. baumannii S. aureus 1.1x x A. baumannii, S. aureus, Pantoea spp, Proteus penneri NC* A. baumannii 2.5x P. aeruginosa, S. aureus, S. maltophilia 8.65x10 6 < LD < LD 5 P. aeruginosa 5x10 5 S. maltophilia >1x P. putida, E. cloacae 4.3x10 3 Negativo A. baumannii 5.7x10 4 * NC: No cuantificable por abundante crecimiento de Proteus penneri * Las cuentas del cultivo corresponden a las UFC de bacterias viables cultivables y este número puede ser inferior a las células vivas en un proceso infeccioso que incluye tanto a células vivas no viables, células viables cultivables y células viables no cultivables.

27 Conclusiones La RT-qPCR: Detecta y cuantifica a los 4 agentes causales mas frecuentes de NAV tardía. Discrimina entre las bacterias que podrían encontrarse en una muestra como verdaderos agentes causales o como contaminantes de vías respiratorias superiores. Fue posible realizar la cuenta de bacterias sin el inconveniente del efecto swarming por la contaminación por especies de Proteus. Se obtuvieron resultados en 6 h. La detección oportuna de NAV facilitará la toma de medidas específicas en el control de la enfermedad.

28 Patente Método para detectar y cuantificar múltiple y simultáneamente bacterias causantes de neumonía asociada a ventilador. Fecha de presentación: 14 de sept 2007 Sometida ante el Instituto Mexicano de la Propiedad Industrial MX/A/2007/

29 Diseño o de un método m de pirosecuenciación n para el monitoreo molecular de las regiones asociadas a resistencia a isoniazida y/o rifampicina en Mycobacterium tuberculosis Presentado por: Q.F.B. Adrián Rentería Sánchez Como requisito parcial para obtener el grado de Maestro en Ciencias con Orientación en Microbiología Médica Directora: Co-directores: Dra. Elvira Garza González Dra. Gloria Ma. González González Dr. Virgilio Bocanegra García

30 Mycobacterium tuberculosis Bacilo inmóvil Mide 0.3 a 0.6 x 1 a 4 µm Pared celular con alto contenido de lípidos Ácido-alcohol resistente Aerobio estricto De crecimiento lento Murray, P. R. 7 Ed. Manual of Clinical Microbiology

31 Activo Antifímicos Crecimiento continuo (Extracelular) Isoniazida (INH) Rifampicina (RIF) Estreptomicina Etambutol Metabolism o bacteriano Pirazinamida Ambientes ácidos (Intracelular) INH y RIF Períodos cortos de crecimiento activo Inactivo Bacilos en estado latente Antimicrob Chemother. 2004; 54: Public Health Mycobacteriology: a guide for the level III laboratory; 1985

32 Cepas multidrogorresistentes (MDR) Resistentes al menos a INH y RIF Factores que han favorecido su aparición: Uso incorrecto de fármacos Tratamientos incompletos Mutaciones espontáneas en las cepas Antimicrob Chemother. 2004; 54:

33 Isoniazida Estructura Hidracida del ácido isonicotínico Actividad antibacteriana Bactericida Bacteriostático Mecanismo de acción Profármaco activado por una catalasa-peroxidasa codificada por katg Inhibe la síntesis de ácidos micólicos Nature. 1992; 358: Microb Drug Resist. 2004; 10:

34 Frecuencia de mutaciones asociadas a resistencia a isoniazida Gen kasa n(%) ndh n(%) katg n(%) inha n(%) ahpc n(%) INH resistente n = (11) 14 (3) 238 (59) 48 (12) 54 (13) INH sensible n = (16) 16 (3) 3 (0.5) 3 (0.5) 19 (3.1) Total Antimicrob Agents Chemother. 2006; 50: J Med Microbiol. 2004; , Tuber Lung Dis. 1998; 79: 3-29, 1999; 79:

35 Rifampicina Estructura Derivado semisintético de la rifamicina B Actividad antibacteriana Bacteriostático Mecanismo de acción Se une a la subunidad β de la ARN polimerasa de M. tuberculosis, inhibiendo la síntesis de ARN Lancet ; 341: J Clin Microbiol. 2006; 44:

36 Frecuencia de mutaciones en el gen rpob en aislamientos resistentes a RIF Frecuencia de mutación n (%) Posición de la mutación Telenti (1993) n= 66 Williams (1994) n= 110 Suzuky (1998) n= 46 Takahashi (1999) n= 90 Zaha (2000) n= 81 Lee (2005) n= (3) 1 (1.1) 1 ( 1.2) (3) 1 (0.9) 5 (5.6) 1 (1.2) 1 (2.0) (0.9) 2 (2.2) 1 (2.0) (2.1) (9.1) 8 (7.3) 4 (8.5) 13 (14.4) 7 (7.4) 5 (9.8) (1.5) 1 (0.9) 1 (2.0) (0.9) (1.5) 2 (1.9) 1 (2.1) 1 (1.1) 1 (2.0) (27.3) 37 (33.6) 13 (27.6) 15 (16.7) 17 (20.6) 12 (23.6) (50.0) 46 (41.7) 23 (48.9) 48 (53.3) 46 (52.4) 28 (54.9) No 533 Mutación en 531, 526, (1.5) 7 (10) 3 (2.7) 9 (8.0) 2 (4.4) 9 (10) 1 (1.2) 2 (2.5) 4 (8.0) Sin mutación 2 (3.0) 8 ( 7.3) 3 (6.4) 5 (5.6) 2 (3.7)

37 J Clin Microbiol. 2006; , Eur Respir 2005; Pruebas para la detección de resistencia a INH y RIF en M. tuberculosis Métodos microbiológicos Método de proporciones BACTEC 460 MGIT Métodos moleculares INNO-LiPA Rif.TB, Innogenetics codones 516, 526, 531 en rpob Genotype MTBDR, Hain Lifescience codones 516, 526, 531 en rpob codón 315 en katg

38 Pirosecuenciación Producto de PCR biotinilado Inmobilización en perlas recubiertas de estreptavidina Preparación de la muestra 3 GACGCGAGGACCAGCGG 5 CTGCGCTCC Pirograma C C C Apirasa C C C PPi ATP Sulfurilasa Luciferasa Pirosecuenciación

39 Ventajas de la pirosecuenciación Determina la secuencia exacta No usa nucleótidos radioactivos Es rápida y automatizada El costo por reacción es aceptable Recientemente se desarrollaron reactivos para secuenciar hasta 100 pb Clin Microbiol Infect. 2005; 2:122-30

40 Antecedentes Zhao JR Development of a pyrosequencing approach for rapid screening of rifampin, isoniazid and etambutol-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin Microbiol Infect. 2005; 2: Isola et al A Pyrosequencing assay for rapid recognition of SNPs 2005 in Mycobacterium tuberculosis embb306 region. J Microbiol Methods. 2005; 62: Pontus J Rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis by pyrosequencing technology. J Clin Microbiol. 2006; 6:1925-9

41 Objetivo General Desarrollar un método m rápido r para el monitoreo molecular de las regiones asociadas a resistencia a isoniazida y/o rifampicina de Mycobacterium tuberculosis mediante pirosecuenciación

42 Estrategia General Objetivo 1 Objetivo 2 Diseño o teórico Pruebas de sensibilidad para isoniazida y rifampicina Diseño o experimental con ADN de cepas control Selección n de cepas sensibles y resistentes Determinación n de la utilidad de las mutaciones en katg, inha, ahpc y rpob como marcadores de resistencia Objetivo 3

43 Objetivo 1. Diseñar y estandarizar un método m de pirosecuenciación n de las regiones asociadas a resistencia de M. tuberculosis a INH y RIF Diseño o teórico Se diseñaron iniciadores para obtener productos entre pb que incluyeran las regiones de interés. rpob 57 pb CAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGC CTGTCGGCGCTGGGGC Iniciador de secuenciaci ón

44 Objetivo 1. Diseñar y estandarizar un método m de pirosecuenciación n de las regiones asociadas a resistencia de M. tuberculosis a INH y RIF Diseño o teórico katg 21 pb inha 20 pb pb ahpc -39-4

45 Objetivo 1. Diseñar y estandarizar un método m de pirosecuenciación n de las regiones asociadas a resistencia de M. tuberculosis a INH y RIF Diseño o experimental Cepas control M. tuberculosis H37Rv M. tuberculosis H37Ra Inactivación 80 C 1 h Lisozima 37 C / 2 h Proteinasa K 55 C / 1 h Extracción con fenol-sevag

46 Objetivo 1. Diseñar y estandarizar un método m de pirosecuenciación n de las regiones asociadas a resistencia de M. tuberculosis a INH y RIF Diseño o experimental: Estandarización de la PCR Componentes Concentración Amortiguador? MgCl 2? dntp s? Iniciadores diseñados Mínimo necesario Taq DNA polimerasa?

47 Objetivo 1. Diseñar y estandarizar un método m de pirosecuenciación n de las regiones asociadas a resistencia de M. tuberculosis a INH y RIF Diseño o experimental Producto de PCR biotinilado Inmobilización en perlas recubiertas con estreptavidina Desnaturalización del ADN con NaOH 0.2 M Lavado/neutralización Análisis del pirograma Pirosecuenciación

48 Objetivo 2. Confirmar el fenotipo de resistencia de las cepas de M. tuberculosis mediante pruebas de susceptibilidad. Pruebas de sensibilidad por el método m de proporciones Preparación del inóculo Diluciones 10-2 y colonias Tubo 1 de McFarland Interpretación Sensible: < 1% Resistente: 1% Selección de: 25 resistentes a INH 25 resistentes a RIF 25 sensibles a INH y RIF Control sin antifímic o Inoculación e incubación RIF 1 μg/ml Control INH sin antifímic 0.2 μg/ml o 3 g 37 C / 21 d Public Health Mycobacteriology: a guide for the level III laboratory, 1985

49 Objetivo 3. Determinar la utilidad como marcadores de resistencia de las mutaciones en katg, inha, ahpc para INH y rpob para RIF. Cepas seleccionadas Inactivación 25 resistentes a INH 25 resistentes a RIF 25 sensibles a INH y RIF 80 C 1 h Lisozima 37 C / 2 h Proteinasa K 55 C / 1 h Pirosecuenciación PCR Extracción con fenol-sevag

50 Objetivo 3. Determinar la utilidad como marcadores de resistencia de las mutaciones en katg, inha, ahpc para INH y rpob para RIF. Fenotipo de resistencia Resistente Sensible Mutació n Positiva Negativa Verdadero resistente Falso sensible Falso resistente Verdadero sensible Se determinó la utilidad de las mutaciones como marcadores de resistencia: Sensibilidad Especificidad Valor predictivo positivo (VPP) Valor predictivo negativo (VPN) Exactitud diagnóstica

51 RESULTADOS

52 Objetivo 1. Diseñar y estandarizar un método m para pirosecuenciación n de las regiones asociadas a resistencia de M. tuberculosis a INH y RIF katg Diseño o experimental: ISONIAZIDA Componentes Concentración ADN 100 ng Amortiguador MgCl 2 1X 3 mm dntp s 0.2 mm Iniciadores s diseñados F B-ATGGGCTTGGGCTGGAAGAG R CGTCCTTGGCGGTGTATTGC 0.1 µm M de c/u Taq DNA polimerasa 1.25 U/ µl M pb Etapa Condiciones Ciclos Desnaturalización inicial Desnaturalización Alineamiento Extensión 94 C 3 min 1 94 C 50 C 72 C 30 s 30 s 30 s 45 Extensión n final 72 C 5 min 1

53 Objetivo 1. Diseñar y estandarizar un método m para pirosecuenciación n de las regiones asociadas a resistencia de M. tuberculosis a INH y RIF katg Diseño o experimental Primer secuenciación - GTCGGGGTGTTCGT M. tuberculosis H37Rv (Sensible a INH) CCA GCT 315 Cepa resistente a INH CCA 321 GCT GCT 315 GGT GCT 315 GTT GCT 315 TGT

54 Objetivo 1. Diseñar y estandarizar un método m para pirosecuenciación n de las regiones asociadas a resistencia de M. tuberculosis a INH y RIF inha Diseño o experimental: ISONIAZIDA Componentes Concentració 100 n ng ADN 100 Amortiguador MgCl 2 1X 3 mm dntp s 0.2 mm Iniciadores s diseñados F B-GAGCGTAACCCCAGTGCGAAAG R CCAGGACTGAACGGGATACGAATG Taq DNA polimerasa 0.15 µm M de c/u 1.25 U M pb Etapa Condiciones Ciclos Desnaturalización inicial Desnaturalización Alineamiento Extensión 94 C 3 min 1 94 C 50 C 72 C 30 s 30 s 30 s 45 Extensión n final 72 C 5 min 1

55 Objetivo 1. Diseñar y estandarizar un método m para pirosecuenciación n de las regiones asociadas a resistencia de M. tuberculosis a INH y RIF inha Diseño o experimental Primer secuenciación - TGGCAGTCACCCC M. tuberculosis H37Rv (Sensible a INH) G -4 4 A -8 8 G -15 C -17 C - 22 C -24

56 Objetivo 1. Diseñar y estandarizar un método m para pirosecuenciación n de las regiones asociadas a resistencia de M. tuberculosis a INH y RIF ahpc Diseño o experimental: ISONIAZIDA Componentes Concentración ADN 100 ng Amortiguador MgCl 2 1X 3 mm dntp s 0.2 mm Iniciadores s diseñados F B-CGGCACTGCTGAACCACTG R CCTCATCATCAAAGCGGACAATG Taq DNA polimerasa 0.15 µm M de c/u 1.25 U M pb Etapa Condiciones Ciclos Desnaturalización inicial Desnaturalización Alineamiento Extensión 94 C 3 min 1 94 C 50 C 72 C 30 s 30 s 30 s 45 Extensión n final 72 C 5 min 1

57 Objetivo 1. Diseñar y estandarizar un método m para pirosecuenciación n de las regiones asociadas a resistencia de M. tuberculosis a INH y RIF ahpc Diseño o experimental Primer secuenciación - CATTTGGTTGCGACAT M. tuberculosis H37Rv (Sensible a INH) T -4 G -15 G - 30 G -39 Cepa resistente a INH T -4 C G -32 T -39 G -15 G - 30

58 Objetivo 1. Diseñar y estandarizar un método m para pirosecuenciación n de las regiones asociadas a resistencia de M. tuberculosis a INH y RIF rpob Diseño o experimental: RIFAMPICINA Componentes Concentración ADN 100 ng Amortiguador MgCl 2 1X 3 mm dntp s 0.2 mm Iniciadores s diseñados F GCGATCAAGGAGTTCTTC R B-CGATCAGACCGATGTTGG Taq DNA polimerasa 0.15 µm M de c/u 1.25 U M pb Etapa Desnaturalización inicial Desnaturalización Alineamiento Extensión Condiciones 94 C 3 min 94 C 50 C 72 C Ciclo s min 1 30 s 30 s 30 s 45 Extensión n final 72 C 5 min 1

59 Objetivo 1. Diseñar y estandarizar un método m para pirosecuenciación n de las regiones asociadas a resistencia de M. tuberculosis a INH y RIF rpob Primer secuenciación TGTCGGGGTTGACC Diseño o experimental Primer secuenciación CCACAAGCGCCGA M. tuberculosis H37Rv Primer secuenciación CCAGCTGAGCCAATTC (Sensible a RIF) GAC 516 CAC TCG 531 Cepa resistente a RIF GAC 516 CAC CAC 526 CGC CAC 526 GAC CAC 526 TGC TCG TTG TCG 531 TTG TCG 531 TGG TCG 531 CAG

60 Objetivo 3. Determinar la utilidad como marcadores de resistencia de las mutaciones en katg, inha, ahpc para INH y rpob para RIF. Mutaciones en cepas de M. tuberculosis sensibles a INH y RIF n(%) rpob (57 pb) 25(100) ATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTG n(%) inha (22pb) ahpc (36 pb) katg (21 pb) 24 (96) GACAACCTATCGTCTCGCCGCG 1 (4) GACAACCTATCGTCTCGCCGCG TCCATCGTGCCGTGAAGTCGCTGTCAGGCAAGGTGA TCCATCGTGCCGTGAAGTCGCTGTCAGGC/T C/TAAGGTGA -32 CCATACGACCTCGATGCCGCT CCATACGACCTCGATGCCGCT

61 Objetivo 3. Determinar la utilidad como marcadores de resistencia de las mutaciones en katg, inha, ahpc para INH y rpob para RIF. Mutaciones en cepas resistentes a RIF n(%) rpob (57 pb) 10(40) ATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTG 11 (44) ATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTC/T C/TGGCGCTG 2 (8) ATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTC/G C/GGGCGCTGGGCGCTG 1 (4) ATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCA/G A/GCAAGCGCCGACTGTCGGCGCTG 1 (4) ATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCT/C T/CG 533

62 Objetivo 3. Determinar la utilidad como marcadores de resistencia de las mutaciones en katg, inha, ahpc para INH y rpob para RIF. Utilidad de las mutaciones en rpob como marcadores de resistencia a RIF Especificidad de 100% Exactitud diagnóstica de 80% VPP de 100% La presencia de al menos una mutación en rpob se asoció al fenotipo de resistencia a RIF (p= 0.001).

63 Objetivo 3. Determinar la utilidad como marcadores de resistencia de las mutaciones en katg, inha, ahpc para INH y rpob para RIF. Mutaciones en cepas de M. tuberculosis resistentes a INH n(%) inha (22pb) ahpc (36 pb) katg (21 pb) 14 (56) GACAACCTATCGTCTCGCCGCG TCCATCGTGCCGTGAAGTCGCTGTCAGGCAAGGTGA CCATACGACCTCGATGCCGCT 7 (28) GACAACCTATCGTCTCGCCGCG TCCATCGTGCCGTGAAGTCGCTGTCAGGCAAGGTGA CCATACGACCTCGATGCCGC/G C/GT (12) GACAACCTATCGTCTCGCCGCG TCCATCGTGCCGTGAAGTCGCTGTCAGG TGCCGTGAAGTCGCTGTCAGGC/TAAGGTGA -32 CCATACGACCTCGATGCCGCT 1 (4) GACAACCTATCGTCTCGCCGCG TCCATCG/T G/TTGCCGTGAAGTCGCTGTCAGGCAAGGTGATGCCGTGAAGTCGCTGTCAGGCAAGGTGA -10 CCATACGACCTCGATGCCGCT

64 Objetivo 3. Determinar la utilidad como marcadores de resistencia de las mutaciones en katg, inha, ahpc para INH y rpob para RIF. Utilidad de las mutaciones en katg y/o ahpc como marcadores de resistencia a INH Especificidad de 96% Exactitud diagnóstica de 70% VPP de 92% La presencia de al menos una mutación en katg y/o ahpc se asoció al fenotipo de resistencia (p= 0.002).

65 Conclusiones El método de pirosecuenciación desarrollado en este trabajo: Es rápido y simple para la detección de mutaciones en las regiones asociadas a resistencia a isoniazida y rifampicina en M. tuberculosis. Permite no solamente estudiar polimorfismos de una sola base específicos, sino estudiar regiones, definir los loci mutados, y conocer cuales son las transiciones de bases.

66 Determinación de β-lactamasas de espectro extendido en cepas de Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii y Enterobacter cloacae Claudia Dinorah Díaz Amador Adriana Karina Estrada Mendoza María Gloria Saavedra Pérez Nallely Selene López Rodríguez Director: Dra. Elvira Garza González Co- director: Dra. Gloria Ma. González González Co- director: M.S.P Jorge M. Llaca Díaz

67 Surgimiento de resistencia a los antimicrobianos Bacteria sensible Bacteria resistente Mutaciones Transferencia de genes de resistencia Nueva bacteria resistente

68 Selección de cepas resistentes a los antimicrobianos Cepas resistentes raras xx Exposición a antimicrobianos xx xx xx xx xx Cepas resistentes predominantes

69 Klebsiella pneumoniae y Esherichia coli Enfermedades Agente causal de: Neumonía Infecciones en vías urinarias Clin Microbiol Rev,1998;11:

70 Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii Enfermedades Murray P. Manual of Clinical Microbiology 9th Edition. 2007; 1

71 Antibióticos β-lactámicos Inhibición de la última etapa de la síntesis del peptidoglucano. Cefalosporina Monobactams Carbapenems Penicilina Enferm Infecc Microbiol Clin 2003; 21: 42-55

72 Clasificación de β-lactámicos Penicilinas: penicilina, amoxicilina, ticarcilina, piperacilina, carbencilina. Cefalosporinas: 1a generación: cefalotina, cefazolina, cefalexina 2a generación: cefaclor, cefamandol, cefuroxima 3a generación: cefoperazona, ceftibuteno, cefatoxima,. ceftazidima 4ª generación: cefepina Monobactams: Carbapenems: aztreonam imipenem, meropenem J.Antimicro Chemoter 1998; 41D:24-41

73 Betalactámicos y betalactamasas Antibiótico activo H 2 N H H 2 N H N S OH O O N S OH O O N OH N H COOH - COOH - Beta-lactamasa Antibiótico inactivo Farm Hosp 1996; 20:

74 Beta-Lactamasas de Espectro Extendido (BLEE) Producidas por algunas bacterias y hongos Cromosomales o plasmídicas Hidrolizan cefalosporinas de 3ª generación Se derivan de enzimas TEM y SHV: TEM Temoniera (primer persona en quien se describió) Existen más de 40 tipos Gen bla TEM-1 codifica para TEM SHV Sulfidril variable Existen más de 10 tipos de SHV Gen bla SHV-1 codifica para SHV *SHV 5 es el tipo predominante en México Existen otras BLEE: CTX-M; OXA J Antimicrob Chemother 1998; 42: 49-54

75 Betalactámicos y betalactamasas Antibiótico activo H 2 N H H 2 N H N S OH O O N S OH O O N OH N H COOH - COOH - Beta-lactamasa Antibiótico inactivo ácido clavulánico sulbactam tazobactam Farm Hosp 1996; 20:

76 Objetivo General Determinar la prevalencia de β-lactamasas de espectro extendido en cepas de Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii y Enterobacter cloacae aisladas en el Hospital Universitario Dr. José Eleuterio González.

77 Estrategia general Selección de las cepas Preparación del inóculo Método de sinergia Método de doble disco Detección de cepas productoras de BLEE

78 Método de doble disco Inoculación Colocación de discos Adición de ácido clavulánico 37 por 24h CAZ+AC CAZ Positivo: Halo > 5 mm CTX+AC CTX CTX: Cefotaxima; CAZ: Ceftazidima; AC. Acido clavulánico J Antimicrob Chemother 1998; 42: 49-54

79 Método sinergia de disco AM: Ampicilina CTX: Cefotaxima CAZ: Ceftazidima AC. Acido clavulánico PIP: Piperacilina CB Carbencilina Tubo 0.5 MacFarland 37 por 24h AM PIP AM PIP CTX CB CTX MH CAZ CB MH-AC CAZ CB Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)

80 Conclusiones Se detectó la producción de BLEE en: El 54% de las cepas de K. pneumoniae El 2% e las cepas de P. aeruginosa El 8% de las cepas de E. coli El 37% de las cepas de A. baumannii El 25 % de las cepas de E. cloacae

81