Mª Teresa Tórtola Fernández Compromís,expertesa i integració

Transcripción

1 Avenços en el diagnòstic ràpid r de la Mª Teresa Tórtola Fernández

2 Microscopía Técnicas moleculares Detección de antígeno Nanotecnología

3 Microscopía Ventajas -Sencilla -Económica -Rápida Sensibilidad 30-80% -Tipo de muestra y cantidad de muestra procesada - Tinción realizada -Ziehl-Neelsen -Tinción con fluorocromos -Especie micobateriana -La experiencia del observador Especificidad 99% -Otros microorganismos -Contaminación

4 Microscopía con lámpara LED -consume menos energía -vida media larga oscuro -no necesita cuarto Nwofor y col. 150 esputos, microscopio de fluorescencia (FM), LED CysCope (CY) y Primo Star iled (Piled), y con la tinción de Ziehl-Neelsen (ZN) comparación con el cultivo en medio líquido. Resultados: 44 (29%), 60 (40%), 49 (33%) y 64 (43%) fueron positivas ZN, FM, CY y microscopía LED, CY iled respectivamente. En los paises con recursos limitados la tinción fluorescente es mejor que la tinción de ZN convencional.

5 Whitelaw y col. 647 esputos (88 pacientes VIH+), microscopio de fluorescencia (FM), microscopio LED y la tinción de de Ziehl- Neelsen (ZN) comparación con el cultivo. Resultados: La sensibilidad de las tres técnicas fue similar pero la técnica LED fue superior a ZN en pacientes VIH+. El tiempo promedio de lectura fue apenas un 25 por ciento más bajo (1,8 versus 2,5 minutos) con microscopía LED que con tinción de ZN. El coste fue más bajo con microscopía LED (1,63 dólares) que con tinción de ZN (2,10 dólares). "La ventaja principal del uso de LED fue haber podido realizar más lecturas que con la microscopía convencional con tinción de ZN y reducir la carga de trabajo del laboratorio La microscopía LED es más rápida y más barata

6 Microscopia digital automática

7 Microscopia digital automática Numero de bacilos /FOV Campos digitalizados

8 Microscopia digital automática Ismail y col esputos decontaminados y del sedimento realizan -tinción de auramina leida por 2 técnicos experimentados y por el sistema automático TBDx (positividad elevada 10 bacilos/300 FOV y positividad baja 1-9 bacilos /300 FOV) -cultivo BACTEC MGIT 960 -Si TBDx positivo ( 1 Bacilo /300 FOV) se hacia Xpert -TBDx sin confirmación por el Xpert obtuvo una S 62% y E 99,7% similar a la lectura realizada por los 2 técnicos. TBDx se puede utilizar en el diagnóstico de la

9 Microscopia digital automática Ismail y col Algoritmo diagnóstico de Sistema automático TBDx Xpert cuando TBDx positivo bajo (1-9 bacilos/300fov) S 78% y E 98,8% (xpert 207 (2-9 bacilos/300fov) S 73% y E 99,3% (Xpert 49)

10 Microscopia digital automática Ismail y col Limitaciones No se sabría la sensibilidad genética a rifampicina. Regiones con multirresistencia 2,5% en los nuevos casos de TBC esta limitación no es preocupante. Se debería realizar el Xpert en pacientes con factores de riesgo de multirresistencia o en aquellos en los que el tratamiento de primera línea fallase. Muestras decontaminadas No se han incluido en el estudio las muestras contaminadas Ventajas del TBDx automático -coste -Objetivo

11 Técnicas moleculares

12 Técnicas moleculares Ventajas -Rápidas -Sensibles y Específicas -Detectar resistencias genéticas Desventajas -Coste -Aparatos -Muestras bacilíferas Alta Sensibilidad y Especificidad -Muestras paucibacilares Baja Sensibilidad

13 Xpert MTB/RIF -Muestras de esputo -Detecta M. complex y rifampicina -Multiplex heminested PCR semicuantitativa a tiempo real -Multiples dianas (5 sondas y 3 primers) -Dos controles internos -Control del procesamiento de la muestra. Controla que se ha realizado la extracción correctamente y detecta la presencia de inhibidores -Control de sondas (verificación de reactivos) Cepheid -Tiempo < 2 horas

14 Xpert MTB/RIF Cepheid

15 Xpert MTB/RIF Xpert MTB/RIF utiliza 3 primers y 5 sondas que aseguran una alto grado de especificidad Diana del gen rpob. Detecta las mutaciones de la región determinante de resistencia a la rifampicina (RRDR) que es de 81 bp. Del 95 al 98% de todas las cepas de M. resistentes a la rifampicina presentan mutaciones en esta región y las cepas de M. sensibles no presentan ninguna mutación en esta región.

16 Xpert MTB/RIF Interpretación de los resultados Cepheid

17 Xpert MTB/RIF Ventajas -Rápida -Detecta M. complex y rifampicina -Muestras bacilíferas con cultivo positivo S 98% E 100% Desventajas -Coste -Muestras microscopia negativa cultivo positivo S 40-60% Cepheid

18 Xpert MTB/RIF ultra -Muestras de esputo -Detecta M. complex y rifampicina detecta la inhibidores -Cartucho (para el mismo volumen de muestra utiliza mayor volumen de muestra extraida ) -Multiples dianas -Curva de melting de alta resolución -Dos controles internos -Control del procesamiento de la muestra. Controla que se ha realizado la extracción correctamente y presencia de -Control de sondas (verificación de reactivos) -Sensibilidad es equivalente al cultivo -Tiempo < 2 horas Cepheid

19 Genexpert Omni Pequeño y portátil Cartuchos Bajo consumo de energía Conectividad automática Batería recargable integrada Que permite trabajar hasta cuatro (4) horas Batería suplementaria recargable (hasta 12 horas de autonomía) Cepheid

20 Genotype MTBDRplus -Multiplex PCR con hibridación reversa -M. complex -Gen rpob -Gen KatG -Gen inha Hain

21 Genotype MTBDRplus Hain

22 Genotype MTBDRsl Hain

23 -Muestra clínica (baciloscopia positiva) y cultivo -GenoType MTBDRplus Sensibilidad Rifampicina 98,3% Isonizida 79% -Genotype MTBDRsl Sensibilidad 77-92% Fluoroquinolonas, etambutol, amikacina y capreomicina y 42,7% para kanamicina Hain

24 Genotype MTBDRplus y MTBDRsl Ventajas Detecta varios genes de resistencia Desventajas Coste 1-2 días Aparatos Hain

25 Fluorotype MTB Detecta M. complex en muestras respiratorias y no respiratorias Es una técnica semiautomática basada en una PCR asimétrica que utiliza sondas HyBeacon la amplificación y detección se realiza en el fluorocycler Hain

26 Fluorotype MTB 3 µl amplification mix A 7 µl amplification mix B 6 µl isolated DNA 2 horas 10 min 3 horas (extracción) Hain

27 Fluorotype MTB Hain

28 Fluorotype MTB Sensibilidad y especificidad 95.1% y 96.4% Baciloscopias positivas Sensibilidad 100% Baciloscopias negativas 84.6% Ventajas -Semiautomático -Sensibilidad Desventajas -Coste -No detecta resistencias Hain

29 Fluorotype MTBDR Es una técnica semiautomática basada en una PCR multiplex asimétrica que utiliza sondas HyBeacon la amplificación y detección se realiza en el fluorocycler. -Detecta M. complex, rifampicina e isoniazida

30 Fluorotype MTBDR Ventajas -Detecta M. complex, rifampicina e isoniazida -Se genera un fluorotipo, con que se puede detectar cualquier mutación presente en los genes que codifican para rifampicina e isoniazida Desventajas -Semiautomático -Coste

31 Amplificación isotérmica. Loop isothermal amplification LAMP Muestra directa de esputo sin amplificación previa. Recomendable extracción de ADN de la muestra (eliminar inhibidores y S y E) Reaccion isotérmica 60-65ºC 1 hora Detección visual -Turbidez -fluorescencia Gel electroforesis Los reactivos se pueden mantener a temperatura ambiente Coste 1 USD/reaccion Eiken Chemical, Tokyo, Japan

32 Amplificación isotérmica. Loop isothermal amplification LAMP Sensibilidad Baciloscopias positivas cultivo positivo 98,2% Baciloscopia negativa cultivo positivo 55,6% Ventajas -Coste (1 USD/por reacción) -Isotérmica Desventajas -Baja S en baciloscopias negativas -Riesgo de Contaminaciones -Falsos positivos Eiken Chemical, Tokyo, Japan

33 Secuenciación de todo el genoma Ventajas -Microevolución: transmisión y brotes -Filogenia y evolución -Resistencia a los fármacos y el fitness compensatorio de las mutaciones Desventajas -Coste (500 USD) -Complejidad análisis resultados -No explica las diferencias en la transmisibilidad de las cepas -Porque algunas cepas son más virulentas que otras -Propensión a desarrollar multirresistencias

34 Detección de antígeno

35 Alere Determine TB LAM Ag Es una prueba de detección de antígeno en orina. Detecta el antígeno LAM, es un lipoarabinomanano que se libera de la pared celular de micobacterias y es indicativo de una infección activa TB. Resultado en 25 minutos. Detección de infección activa por (TB) en pacientes VIH positivos

36 Alere Determine TB LAM Ag Detección de infección activa por (TB) en pacientes VIH positivos Sensibilidad VIH+ CD4 <50 cells/µl 66,7% VIH+ CD4 <100 cells/µl 51,7% VIH+ CD4 <200 cells/µl 39% Ventajas Rapidez Muestra (orina) Desventajas Baja sensibilidad VIH+ con CD4 bajos OMS Sólo está recomendado en pacientes VIH+ con nivel bajo de CD4 o pacientes con enfermedad grave

37 Nanotecnología

38 Nanotecnología Técnica basada en la utilización de nanopartículas magnéticas (MNP) Las nanopartículas magnéticas se recubren de anticuerpos, ej. anticuerpos anti-bcg y se mide en unidades de resonancia magnética nuclear (NMR) Esta técnica MNP-NMR escapaz de detectar 20 bacterias/ml en muestras de esputo no procesadas en 1 hora. Kim y col utilizaron micropartículas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti CF-10 (MMPs) y nanopartículas de oro (AuNPs) recubiertas con anticuerpos anti CF-10 para realizar un sandwich inmunoensayo magnetoforético colorimétrico.ambas partículas se unen al antígeno CF-10 que se expresa en el crecimiento inicial de M..

39 Nanotecnología

40 Nanotecnología Ventajas Alta sensibilidad Desventajas Alta sensibilidad Coste Aparatos Anticuerpos son caros se utilizan aptameros Diseñando nuevas plataformas -elevada sensibilidad -muestras clínicas -bajo coste -comercializar