La biología Molecular en diagnóstico de MICOBACTERIAS. Olga lucia ALZATE biomérieux Colombia

Transcripción

1 La biología Molecular en diagnóstico de MICOBACTERIAS Olga lucia ALZATE biomérieux Colombia

2 TUBERCULOSIS 8.6 millones de nuevos casos en millones de muertes de casos asociados a VIH casos MDR casos XDR Global repport WHO 2013 Lawn SD, Zumla AI. Lancet Jul 2;378(9785):57-72.

3 ACCIONES PRIORITARIAS PARA OMS 1. Llegar a los casos inadvertidos. Ampliación de los servicios en los sistemas de salud, Notificación obligatoria en más países, y mejor recopilación de datos. 2. Abordar la TB-MR como una crisis de salud pública. 3. Acelerar la respuesta a la TB/VIH. Aumentar la cobertura TAR en pacientes con TB VIH-positivos 4. Aumentar la financiación para eliminar todo déficit de recursos. Se estima que en 2014 y 2015 serán necesarios US$ millones anuales. 5. Garantizar la adopción rápida de innovaciones. La adopción rápida de nuevas herramientas y estrategias para un mejor diagnóstico, tratamiento y prevención de todas las formas de TB.

4 Plan Colombia libre de Tuberculosis

5 ACCIONES PRIORITARIAS PARA Llegar a los casos inadvertidos. Ampliación de los servicios en los sistemas de salud, Notificación obligatoria en más países, y mejor recopilación de datos.

6 ACCIONES PRIORITARIAS: AMPLIACIÓN DE SERVICIOS New Laboratory Diagnostic Tools for Tuberculosis Control

7 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Complejo Mycobacterium tuberculosis : (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum) Bacilos Ácido alcohol resistentes (BAAR). El M. tuberculosis es un bacilo aerobio estricto de 0.2 a 0.6 de ancho por 1 a 10 μ de largo, que se caracteriza por Tener una pared celular gruesa, de alta complejidad y con abundante cantidad de lípidos, lo que le da su principal característica de ácido alcohol resistencia. El M. tuberculosis es muy resistente al frío, a la congelación y a la desecación, siendo además muy sensible al calor, la luz solar y la luz ultravioleta. Su velocidad de replicación es muy lenta (20 horas en promedio) por lo que requiere alrededor de 2 a 4 semanas (en medios sólidos, como el de Löwenstein-Jensen) para ser cultivado.

8 Pared celular Velayati AA, y col. Chemotherapy. 2009;55(5):303-7

9 TUBERCULOSIS

10 BACILOSCOPIA VENTAJAS: Técnica sencilla Bajo costo Variaciones en: La muestra La técnica Al profesional Rápidos resultados No requiere equipo especial Amplia cobertura JAMG-2006-INDRE/SSA5

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12 COLORACION BAAR (Bacilos ácido alcohol resistentes) Sencillo- Confiable - Seguro /en/

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14 TBC RIESGO OCUPACIONAL

15 TINCIONES DE ALTO RIESGO Ser verde Manejo de desechos

16 CULTIVOS En caso de que las dos baciloscopias iniciales sean negativas, se deberá cultivar la segunda muestra de esputo. Todas las muestras de origen extrapulmonar. Para diagnóstico de TB infantil. Poblaciones de alto riesgo (personal de salud, población indígena, personas privadas de la libertad, personas que viven en la calle, pacientes inmunosuprimidos, entre otros).

17 CULTIVO SÓLIDO Y LIQUIDO El cultivo complementa a la baciloscopia ya que permite poner en evidencia bacilos viables presentes en escasa cantidad en una muestra de lesión. METODO GOLD ESTANDAR: primedio 3 a 4 semanas

18 Cultivo liquido BTA Colorimetrico MIGT_ Fluorescencia Cultivo de muestras pulmonares y extrapulmonares: Promedio de 9 a 14 días Permitir identificar y realizar perfil de susceptibilidad

19 ACCIONES PRIORITARIAS PARA Abordar la TB-MR como una crisis de salud pública. Tuberculosis multirresistente MDR-TB Tuberculosis extensivamenteresistente XDR-TB Tuberculosis causada por cepas de Mycobacterium tuberculosis que son resistentes al menos a isoniazida y rifampicina. Tuberculosis multirresistente, con resistencia a fluoroquinolonas y al menos un inyectable de segunda línea (kanamicina, amikacina y/o capreomicina) Lawn SD, Zumla AI. Lancet Jul 2;378(9785):57-72.

20 TUBERCULOSIS Lawn SD, Zumla AI. Lancet Jul 2;378(9785):57-72.

21 Estudios nacionales de vigilancia de la resistencia de M. tuberculosis a fármacos antituberculosos Casos nuevos n Resistencia total MDR-TB Primer estudio ,1% 1,8% Segundo estudio ,6% 1,5% Tercer estudio ,8% 2,4 Casos previamente tratados n Resistencia total MDR-TB Tercer estudio ,3% 31,4% Fracaso 60 50% Abandono % Recaída 72 19% Archivo: LNR - INS

22 Georeferenciación de casos de tuberculosis Multirresistente y Extensivamente resistente según frecuencia. Colombia, Fuente: Consolidado de casos MDR LNR INS

23 RESISTENCIA FENOTÍPICA VS RESISTENCIA GENOTÍPICA Fármaco Gen Sensibilidad Especificidad RIF rpob 97,1 93,6 INH katg inha katg e inha 85,4 16,5 90, EMB embb 78,6 93,1 MDR (RIF+INH) rpob y katg o inha 90,8 94,7 Campbell PJ, y col. Antimicrob Agents Chemother May;55(5):

24 Pobreza B Alcoholismo A C Tabaquismo MDR Tratamientos inadecuados E D Cavidades pulmonares Barroso, E. C., y col J Pneumol : Barroso, E. C., y col J Pneumol

25 Smith PA, Romesberg FE. Nat Chem Biol Sep;3(9): Resistencia

26 Resistencia Smith PA, Romesberg FE. Nat Chem Biol Sep;3(9): Smith PA, Romesberg FE. Nat Chem Biol Sep;3(9):

27 Sociomicrobiología Parsek MR, Greenberg EP. Trends Microbiol Jan;13(1):27-33.

28 Mutaciones Fármaco Actividad Genes involucrados en la resistencia Isoniazida Rifampicina Bactericida frente a los bacilos metabólicamente activos. Bacteriostática en las demás poblaciones Bactericida; bacilos metabólicamente activos. Actividad en los latentes y con crecimiento intermitente katg (42 58%). Promotor maba-inha (21 34%) rpob (96 98%) Pirazinamida Bactericida, bacilos en estado de latencia en el interior de los macrófagos pnca (72 97%) Estreptomicina Bactericida, bacilos metabólicamente activos rpsl (52 89%); rrs (8 21%) Etambutol Bacteriostático, bacilos metabólicamente activos embcab (47 65%) Zhang Y, Yew WW. Int J Tuberc Lung Dis Nov;13(11):

29 Hormesis Davies J, Spiegelman GB, Yim G. Curr Opin Microbiol Oct;9(5): Drlica K, Zhao X. Clin Infect Dis.2007 Mar 1;44(5):681-8

30 Definiciones PK/PD La farmacocinética estudia el curso temporal de las concentraciones de los fármacos en el organismo y construye modelos para interpretar estos datos y por tanto para valorar o predecir la acción terapéutica o tóxica de un fármaco. La farmacodinamia estudia los mecanismos de acción de los fármacos y los efectos bioquímicos/fisiológicos que estos producen en el organismo. Dosis- Concentración Concentración-Efecto

31 ACCIONES PRIORITARIAS PARA OMS. Aumentar la financiación para eliminar todo déficit de recursos. Se estima que en 2014 y 2015 serán necesarios US$ millones anuales. 5. Garantizar la adopción rápida de innovaciones. La adopción rápida de nuevas herramientas y estrategias para un mejor diagnóstico, tratamiento y prevención de todas las formas de TB.

32 PERSPECTIVAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES Moore DA, Shah NS. J Infect Dis Nov;204 Suppl 4:S

33 ACCIONES PRIORITARIAS PARA Garantizar la adopción rápida de innovaciones. La adopción rápida de nuevas herramientas y estrategias para un mejor diagnóstico, tratamiento y prevención de todas las formas de TB.

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37 Avances en el diagnóstico rápido de tuberculosis y de la resistencia a los fármacos antituberculosos RED NACIONAL DE LABORATORIOS LNR PSF -EED BK ZN O K ADA Proporciones L J Bactec MGIT 960 MGIT TBc Nitrato Reductasa GeneXpert Genotype L S P D x PSF - EED BK ZN O K ADA Proporciones L J MGIT TBc Nitrato Reductasa GeneXpert Genotype Laboratorios Nivel III -IV BK ZN O K ADA Bactec MGIT 960 MGIT TBc Nitrato Reductasa GeneXpert Genotype Laboratorios Nivel Il Laboratorios Nivel l BK ZN O K

38 ACCIONES PRIORITARIAS PARA Garantizar la adopción rápida de innovaciones. La adopción rápida de nuevas herramientas y estrategias para un mejor diagnóstico, tratamiento y prevención de todas las formas de TB.

39 DETECCION Y VIGILANCIA DE LA RESISTENCIA DNA STRIP TECHNOLOGY POLIMORFISMOS GENÉTICOS GenoType polimorfismo de la estructura genética de la micobacteria. Un factor importante es el uso de PCR para alcanzar el máximo de sensibilidad.

40 DNA Strip technology Punto de inicio: Aislamiento del ácido Nucleico Principio El método DNA STRIP requiere amplificación selectiva del acido nucleico aislado

41 Hibridación: El DNA/RNA es amplificado en la matriz DNA STRIP donde se localizan sondas específicas de DNA DNA Strip technology Principio La reacción de Hibridación permite el desarrollo de bandas visibles sobre la tira (DNA STRIP matrix)

42 DNA Strip technology Interpetación de resultados Se realiza comparando el perfil de bandas desarrolladas en la tira DNA Strip con una evaluación del amplificado.

43 DNA Strip technology Interpretación de resultados Los resultados son validados por 3 controles: Control del conjugado: para asegurar la eficiencia en la reacción de color Control amplificación: para asegurar la implementación del método Control de sensibilidad: Verificar una sensibilidad optima en la reacción de hibiridación

44 RIFAMPICINA REGIÓN DE RESISTENCIA RPOB GENE rpob WT2 rpob WT4 rpob WT6 rpob WT1 rpob WT3 rpob WT5 rpob WT7 rpob WT rpob MUT1 (D516V) rpob MUT2B (H526D) rpob MUT3 (S531L) rpob-wildtype-probes: WT 1 to WT 8 rpob-mutation-probes: MUT D516V, H526Y, H526D, S531L Detección demutaciones por la perdida de la señal del wildtype Detección demutaciones porla presencia de laseñal de la mutación Gen que codifica sub unidad B de la RNA polimerasa

45 Cada tira tiene 27 sitios de reacción Conjugate Control (CC) Amplification Control (AC) M. tuberculosis complex (TUB) rpob Locus Control rpob wild type probe 1 ( rpob WT1) rpob wild type probe 2 ( rpob WT2) rpob wild type probe 3 ( rpob WT3) rpob wild type probe 4 ( rpob WT4) rpob wild type probe 5 ( rpob WT5) rpob wild type probe 6 ( rpob WT6) rpob wild type probe 7 ( rpob WT7) rpob wild type probe 8 ( rpob WT8) rpob mutation probe 1 ( rpob MUT1) rpob mutation probe 2A ( rpob MUT2A) rpob mutation probe 2B ( rpob MUT2B) rpob mutation probe 3 ( rpob MUT3) katg Locus Control katg wild type probe ( katg WT) katg mutation probe 1 ( katg MUT1) katg mutation probe 2 ( katg MUT2) inha Locus Control inha wild type probe 1 ( inha WT1) inha wild type probe 2 ( inha WT2) inha mutation probe 1 ( inha MUT1) inha mutation probe 2 ( inha MUT2) inha mutation probe 3A ( inha MUT3A) inha mutation probe 3B ( inha MUT3B) colored marker Controles Identificaciónn banda para M.tb complex Resistencia a Rifampicina Resistenica a isoniazida

46 GENOTYPE MTBDR PLUS GenoType MTBDRplus MTBC y su resistencia a Rifampicina y/o Isoniazida

47 PERSPECTIVAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES FLQ: 90.6% AMK: 84.8% CAM: 86.7% EMB: 69.2% Hillemann D, Rusch-Gerdes S, Richter E. J Clin Microbiol Jun;47(6):

48 PERSPECTIVAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES

49 PERSPECTIVAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES

50 PERSPECTIVAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES Falkinham JO, 3rd. Clin Chest Med Sep;23(3):

51 PERSPECTIVAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES Pitombo MB, Lupi O, Duarte RS. Rev Bras Ginecol Obstet Nov;31(11):

52 PERSPECTIVAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES Lee AS, Jelfs P, Sintchenko V, Gilbert GL. J Med Microbiol Jul;58(Pt 7):900-4.

53 GenoType Mycobacterium CM Differentiation between 14 common atypical mycobacterial species and MTBC AB

54 GenoType Mycobacterium AS Differentiation between 16 additional atypical mycobacterial species

55 Gracias