BÚSQUED TESIS EL TÍTULO DE PRESENTA REYNOSA, TAMPS.

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1 INSTITUTO POLITÉCN NICO NACIONAL CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA BÚSQUED DA DE MUTACIONES EN LOS GENES katg, inha y ahpc Y SU RELACIÓN CON RESISTEN NCIA A ISONIACIDAA EN EL COMPLEJO Mycobacterium tuberculosis. TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA PRESENTA BIÓL. BRAULIO MANUEL SOTO IBARRA REYNOSA, TAMPS. DICIEMBRE 2014

2 INSTITUTO POLITÉCN NICO NACIONAL CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA BÚSQUED DA DE MUTACIONES EN LOS GENES katg, inhaa y ahpc Y SU RELACIÓN CON RESISTEN NCIA A ISONIACIDAA EN EL COMPLEJO Mycobacterium tuberculosis. TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA PRESENTA BIÓL. BRAULIO MANUEL SOTO IBARRA REYNOSA, TAMPS. DICIEMBRE 2014

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5 ÍNDICE LISTA DE CUADROS... I LISTA DE FIGURAS... II LISTA DE SÍMBOLOS Y NOMENCLATURA... IV AGRADECIMIENTO... V DEDICATORIA... VI RESUMEN... VII ABSTRACT... VIII I. INTRODUCCIÓN Microbiología Diagnóstico Panorama epidemiológico Prevalencia en México Prevalencia en Tamaulipas Farmacorresistencia Clasificación de la farmacorresistencia: Mecanismos de Resistencia a Isoniacida Detección de farmacorresistencia Métodos Moleculares GenoType MTBDRplus Secuenciación... 21

6 II. JUSTIFICACIÓN III. OBJETIVOS Objetivo general Objetivos específicos IV. MATERIALES Y MÉTODOS Aislados Criterios de selección Obtención de ADN genómico Extracción Cuantificación de ADN genómico Identificación de pertenencia al complejo MTC Amplificación de los genes blanco katg, inha y ahpc Amplificación mediante PCR Visualización de los productos de PCR Secuenciación Análisis de secuencias V. RESULTADOS Características clínicas de los aislados Antigüedad de los aislamientos Procedencia de los aislamientos Drogorresistencia Mutaciones identificadas Cambio de aminoácidos VI. DISCUSIÓN... 40

7 VII. CONCLUSIÓNES VIII. RECOMENDACIONES IX. REFERENCIAS X. APÉNDICE... 53

8 LISTA DE CUADROS Cuadro 1: Mutaciones reportadas hasta 2013 Cuadro 2: Secuencias de los iniciadores utilizados para la amplificación de los genes katg, inha y ahpc Cuadro 3: Origen de los aislamientos y resistencia determinada en Laboratorio Estatal de Salud Pública de Tamaulipas y Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. Cuadro 4: Análisis de secuencia de los diversos genes blanco Cuadro 5: Codones y cambios identificados para el gen katg Cuadro 6: Codones y cambios identificados para el gen inha I

9 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Tinción Ziehl-Neelsen de bacilos de M. tuberculosis obtenidos de esputo Figura 2: Distribución de las mutaciones en el gen katg reportadas actualmente Figura 3: Distribución de las mutaciones en el gen inha reportadas actualmente Figura 4: Distribución de las mutaciones en el gen ahpc reportadas actualmente Figura 5: Frecuencia de los alelos mutantes katg315 e inha-15 en contraste alelos silvestres en aislados resistentes a isoniacida Figura 6: Frecuencia de mutaciones al secuenciar el promotor de inha y el gen katg de aislamientos resistentes de M. tuberculosis Figura 7: Presencia-ausencia de mutaciones en el promotor de inha y el gen katg en aislamientos de M. tuberculosis drogorresistentes. Figura 8: Mutaciones asociadas con resistencia a isoniacida y rifampicina obtenidas mediante el análisis con GenoType MTBDRplus. Figura 9: Diagrama de Flujo del Trabajo Figura 10: Preparación de Medio Middlebrook 7h9 Figura 11: Preparación de Medio Lowestein-Jensen Figura 12: Identificación de los complejos CMA o CMTB mediante PCR II

10 Figura 13: Amplificación del gen inha. Figura 14: Análisis de secuencias en Geneious (Biomatters Ltd) Figura 15: Distribución de los aislamientos por año y porcentaje Figura 16: Procedencia de los aislamientos en relación al número. Figura 17: Distribución de la resistencia a fármacos entre el número de aislamientos III

11 LISTA DE SÍMBOLOS Y NOMENCLATURA BAAR CDC CENAVECE CMA CMTB E H M MGIT MIRU OMS PCR Z R RIF RT - PCR S SIDA SNP SSCP TB TB-DR TB-MDR TB-XDR VNTR Bacilo Ácido Alcohol Resistentes Centro de Prevención y Control de Enfermedades Centro Nacional de Vigilancia Epidemiológica Complejo Mycobacterium avium-intracellulare Complejo Mycobacterium tuberculosis Etambutol Isoniacida Molar Tubo Indicador de Crecimiento Bacteriano Unidad Repetida Interespaciada de Mycobacterium Organización Mundial de la Salud Reacción en Cadena de la Polimerasa Pirazinamida Rifampicina Rifampicina Reacción en Cadena de la Polimerasa con transcriptasa Estreptomicina Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida Polimorfismo de Nucleótido Simple Polimorfismo Conformacional de Cadena Sencilla Tuberculosis Tuberculosis drogorresistente Tuberculosis multidrogoresistente Tuberculosis de drogorresistencia extendida Repetición en Tándem de Número Variable IV

12 AGRADECIMIENTO A mi amigo y redentor Cristo, por cambiar mi perspectiva durante este viaje. A mi amada esposa Andrea, por alentarme a concretarlo y darme paz con su amor. A mis padres, Rogelio y Griselda por enseñarme confiar en Dios y brindarme su amor incondicional y mis hermanos Rogelio y Daiana, mi cordón de cuatro dobleces. Al Centro de Biotecnología Genómica del IPN, por abrirme las puertas al saber y formarme académicamente. Al comité de tesis por su oportuna opinión, aportes y consejos brindados: M.C Cristian Lizarazo Ortega, Dr. Aldo Segura, Dr. Virgilio Bocanegra García, Dr. Víctor Moreno Medina y particularmente a mis directores de tesis el Dr. Miguel Ángel Reyes López y la Dr. Julieta Luna Herrera, por guiarme durante la realización de este trabajo y apoyarme para llevarlo a cabo en las diferentes sedes. A mis compañeros y amigos, larga vida, en particular a Mario Sánchez Sánchez, por su apoyo incondicional y su siempre asertiva opinión. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) y al Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI-IPN), por el apoyo durante el posgrado. Al Ing. Martín Santamaría y el Dr. Pedro Ollervides por extender su mano amiga. A Don Luis por esos casi dos años de velar por nosotros. GRACIAS V

13 DEDICATORIA Al dueño de mi postrera vida, Dios, por manifestarte a través de aquellos que me rodean y de maneras extraordinarias mostrarme tu amor. A mi amada esposa, por creer en este músico, poeta y loco; amándome en los momentos más trascendentales de mi vida. A Benjamín, lazo en mi corazón, luz de mis ojos; me has cambiado el mundo por completo. A mis padres, puesto que han perseverado para marcar una diferencia en mi vida, por su legado en mí, por las largas horas que dedicaron amándome y enseñándome. A mis hermanos por invertir en obras no de hombres en mi vida y abrir sus corazones a mi familia. A quienes creyeron en mí de una manera u otra, aquellos que apoyaron mi familia y ésta causa, aquellos que nos aman, a nuestros amigos y hermanos en Cristo, les amamos. A todos quienes han participado de este logro de manera directa o indirecta. VI

14 RESUMEN En la actualidad la tuberculosis afecta a más de 8 millones de personas y se ha estimado que 1.1 millones de personas mueren cada año debido a esta enfermedad, sumado a esto la selección de cepas drogorresistentes debido a la mala implementación de los esquemas de tratamiento, deterioran el panorama de años próximos. En México de acuerdo con la secretaria de salud se presentaron 18,848 casos nuevos hasta el 2011 con un total de 2,220 defunciones, donde Tamaulipas es cuarto a nivel nacional con 595 casos y 88 defunciones. A nivel nacional nuestro conocimiento y comprensión de los marcadores moleculares de resistencia y su diversidad es limitado. El presente trabajo tuvo como objetivo detectar e identificar mutaciones en los genes katg, inha y ahpc y la posible correlación de estas con resistencia a Isoniacida mediante secuenciación; se analizaron 50 Cepas, 40 Isoniacida (H) resistentes y 10 sensibles, del banco de ADN del Laboratorio de Medicina de Conservación CBG (31) y al Laboratorio de Inmunoquímica ENCB (19). Las secuencias obtenidas de las cepas resistentes a H fueron analizadas en el programa Geneious 7.1.5, donde se observó que 9/40 (22.5%) portaban mutación en el gen katg y en 11/40 (27.5%) del gen inha, donde la mutación Ser315Thr se observó solo en 2/40 (5%) aislamientos y solo 1/10 (10%) de los aislamientos sensibles portó mutación en katg. Los perfiles de resistencia más amplios podrían relacionarse con mutaciones identificadas en el gen katg lográndose identificar patrones fenotípicos pero no genotípicos de resistencia similares entre cepas de la misma procedencia. De las mutaciones identificadas en el gen inha se observó una relación con perfiles de resistencia baja o monorresistencia en la mayoría de los casos. La incidencia de las mutaciones mayormente reportadas para los genes en cuestión fue baja 5% VII

15 ABSTRACT TB currently affects more than 8 million people also has been estimated that 1.1 million people die each year from this disease, in addition to this the selection of strains resistant due to the poor implementation of treatment schemes, impair the landscape of next years. 18,848 new cases were presented in Mexico according to the Department of health until 2011 with a total of 2,220 deaths, where Tamaulipas is fourth nationally with 595 cases and 88 deaths. At national level our knowledge and understanding of molecular markers of resistance and their diversity is limited. The present work aimed to detect and identify mutations in the katg, inha and ahpc and the possible correlation with resistance to isoniazid by sequencing; 50 strains, 40 H resistant and sensitive 10, Bank of DNA of the CBG Conservation Medicine Laboratory were analyzed (31) and the laboratory of immunochemistry ENCB (19). Obtained sequences were analyzed in the Geneious program, 40 strains resistant to tested in 9/40 H (22.5%) identified mutation in the katg gene and 11/40 (27.5%) gene inha, where the Ser315Thr mutation was observed only in 2/40 (5%) isolates and only 1/10 (10%) of the isolates sensitive ported katg mutation. Broader resistance profiles may be linked to mutations identified in the gene katg achieving identify phenotypic but not genotypic patterns of similar resistance among strains of the same origin. Of the mutations identified in the gene inha a relationship with profiles of low resistance or monorresistencia in the majority of cases was observed. The incidence of mutations reported mostly for the genes in question was low 5% VIII

16 I. INTRODUCCIÓN La tuberculosis es una enfermedad infecciosa provocada en sujetos sanos por bacterias que pertenecen al Complejo Mycobacterium tuberculosis (CMTB) y por miembros del Complejo Mycobacterium avium-intracellulare (CMA) en sujetos inmunodeprimidos (Oms 2012), la forma más común de tuberculosis es la pulmonar (Braselli 2009), sin embargo es capaz de afectar otros órganos y tejidos; la transmisión se produce por medio de bacilos suspendidos en pequeñas gotas que son expulsadas con la expectoración de las personas infectadas con tuberculosis pulmonar, estas pueden permanecer infectivas en el aire, si las condiciones climáticas lo permiten, pudiendo ser inhaladas por otras personas; de todas las personas infectadas enferma solo una de cada diez aproximadamente, que resultan ser las más susceptibles; cada segundo que pasa una persona más es infectada por el bacilo; se estima que una tercera parte de la población mundial está infectada (desarrollando un 90% tuberculosis pulmonar latente) siendo importante señalar que el surgimiento del binomio entre el VIH/SIDA y la tuberculosis, ha dificultado aún más el combate a esta enfermedad (Gonzáles 2007) destacando que la mayoría de los casos se presentan en edades que van desde los 15 hasta los 54 años (Cárdenas 1999), (Gonzáles 2007) De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud, la tuberculosis continúa siendo un problema de salud importante a nivel mundial, hasta el año 2012 se estimó que alrededor de 9 millones de personas desarrollaron tuberculosis y 1.5 millones falleció debido a esta enfermedad (WHO 2014). Aunado a presencia de la enfermedad a nivel mundial, el desarrollo de resistencia a antibióticos de las micobacterias constituye una situación alarmante, esta resistencia se clasifica en: 1.Multidrogoresistente (TB-MDR); causada por un bacilo resistente por lo menos a la isoniazida y la rifampicina y 2.Drogoresistencia extendida (TB-XDR); resistente al menos a isoniazida y rifampicina, alguna fluoroquinolona y al menos un fármaco inyectable (amikacina, capreomicina, 1

17 kanamicina). La resistencia es adquirida resultado de mutaciones en genes que codifican para diversos blancos de los fármacos o bien modifican ciertas vías metabólicas (por ejemplo: Síntesis de ácidos micólicos, síntesis de ARNm) los cuales limitan la penetración del fármaco o desarrollan mecanismos eficientes de degradación de los mismos (detoxificación mediada por AhpC Alquil hidroperóxido reductasa de intermediarios activos de isoniacida) (Borrero 2011) Las principales mutaciones que confieren resistencia para el antibiótico Isoniacida se encuentran en los genes katg, inha, ahpc, (cuadro 1) otros son Rifampicina el rpob; Pirazinamida el pnca; Etambutol el embb; Estreptomicina el rpsl y rrs; y Fluoroquinolonas el gyra (Silva 2003). Cuadro 1: Mutaciones reportadas (Cuevas-Córdoba 2010) Porcentaje Gen Cambios Reportados a la Fecha 40 60% KatG 315(Ser-Thr, Asn, Arg),300(Trp-Gly), 321(Trp-Gly), 418(Arg-Gln), 463(Arg-Leu), 501(Pro-Arg), 525(Glu-Pro), 587(Leu-Pro) y700(ser-pro) 15 43% inha 94(Ser-Ala), 21(Ile-Thr,V), 258(Ile-Thr) 10% ahpc G(6) A; G(9) A; C(30)T; C(39)T De las anteriores mutaciones, la mutación en katg que codifica para la enzima catalasa-peroxidasa, capaz de transformar la isoniacida en el principio activo que inhibe la síntesis de los ácidos micólicos, ha sido la más reportada en diversas investigaciones, pues al ser mutante su capacidad de reducir el profármaco disminuye y así confiere resistencia a la micobacteria (Cade 2010). Existen diversos métodos de identificación de resistencia donde destacan: Método de las proporciones múltiples, MGIT, BACTEC960, SSCP; sin embargo, las técnicas más socorridas para el análisis de mutaciones son la RT-PCR, Secuenciación y Pirosecuenciación, esto en gran parte debido a la precisión y velocidad de estas técnicas, aunque algunas de ellas no son baratas, cuando la finalidad es analizar una gran cantidad de muestras o se quiere hacer de rutina el análisis (Cuevas-Córdoba 2010) 2

18 1.1 Microbiología. Es un bacilo de 3 a 5µm de longitud o curvos en forma de maza, inmóviles, no esporulados, con abundantes gránulos citoplasmáticos la célula joven de M. tuberculosis consiste en una membrana que presenta áreas engrosadas, esta membrana rodea un muy denso citoplasma profundamente permeado por un sistema vacuolar y que encierra gránulos densos hipercromáticos. La membrana y los gránulos parecen estar compuestos de sustancias similares, en las células viejas, la membrana aumenta de grosor (Knaysi 1950). Posee una pared celular de tipo cérea, con lípidos complejos llamados ácidos micólicos, este elevado contenido lipídico de su pared le permite resistir la desecación, facilitando su transmisión ya que pueden permanecer viables por al menos ocho meses si la luz no incide directamente sobre ellos, algunos de estos lípidos también contribuyen a su potencial patógeno al proporcionarle cierta protección frente a los agentes oxidantes y enzimas de los lisosomas presentes en los fagocitos en los que penetran. (Ingraham 1998). La pared celular se constituye por tres capas. Con tinciones convencionales su apariencia es: Capa interna moderadamente electrón-densa, compuesta por peptidoglicano cuya estructura es similar a la de otras bacterias; Capa media, más ancha que la anterior y electrón-transparente, compuesta por polisacárido, el arabinogalactano, cuyos extremos distales están esterificados con ácidos grasos de alto peso molecular, los ácidos micólicos, de tamaño y estructura única para las micobacterias (70-90 átomos de carbono). Capa externa de grosor variable, electrón-opaca, de la cual no puede conocerse con las técnicas actuales, su exacta composición, aunque se le atribuye una estructura glucolípida. 3

19 Además de los componentes anteriores existen proteínas asociadas a la pared, algunas con función enzimática (necesarias para la construcción y reconstrucción de los polímeros de la pared durante el proceso de división celular y crecimiento), otras, recientemente descubiertas, con función de porina. Estas últimas, encontradas en bajo número, lo que está de acuerdo con la baja permeabilidad de las micobacterias a las moléculas hidrofílicas. El metabolismo de las micobacterias es muy variable, encontrándose las micobacterias de crecimiento rápido, que crecen en menos de tres días en medios simples, así como micobacterias que crecen lentamente y necesitan medios más ricos, hasta Mycobacterium leprae que aún no ha podido ser cultivada en medios sin células. Los medios de cultivo pueden ser sólidos o líquidos, dependiendo de su uso. Los medios sólidos pueden ser en base de agar o en base de huevo (Lowenstein-Jensen), siendo este último el más usado. En tres a cinco semanas se observa el desarrollo de colonias para las micobacterias de crecimiento lento (por ej.: M. tuberculosis) (Rodríguez 2008) Desde el punto de vista de los requerimientos atmosféricos la mayoría de las micobacterias, son aerobios estrictos, excepto M. bovis que es microaerófilo. El crecimiento es favorecido con una atmósfera de 5-10% de CO2. La temperatura óptima de crecimiento es variable; M. tuberculosis lo hace a 37 º C con un rango entre 30 y 42 º C. La ácido-alcohol resistencia se describe como la propiedad que tienen las micobacterias de captar en su pared fuscina fenicada o auramina (amarillo fluorescente) y retenerla aun después de haber sido tratadas con decolorantes, cómo la mezcla de ácido y alcohol; debido al alto contenido en lípidos (ácidos micólicos) que poseen en su pared celular (Rodríguez 2008). 4

20 1.2 Diagnóstico Los métodos de diagnóstico más utilizados actualmente son los de baciloscopía de esputo y cultivo. Sin embargo, la baciloscopía no puede diferenciar de forma confiable entre las diferentes micobacterias patógenas y no patógenas, y todas las ácido-alcohol resistentes de morfología similar, por lo cual se discute su eficacia diagnóstica, aunque presenta varias ventajas técnicas sobre el cultivo, este último resulta tener una mejor sensibilidad y especificidad; en Tamaulipas ambos métodos encabezan las estadísticas de los utilizados para el diagnóstico, aplicándose en el Laboratorio Estatal de Salud (Toman 2006). Tinciones. La ácido-alcohol resistencia se describe como la propiedad que tienen las micobacterias de captar en su pared fuscina fenicada o auramina (amarillo fluorescente) y retenerla aun después de haber sido tratadas con decolorantes, cómo la mezcla de ácido y alcohol; debido al alto contenido en lípidos (ácidos micólicos) que poseen en su pared celular. Es importante destacar que esta propiedad no es exclusiva de M. tuberculosis, si no que la comparte con todas la micobacterias ambientales y con otros pocos microrganismos; aun así su valor diagnóstico es alto al considerar en conjunto, el cuadro clínico, el historial médico y las zonas de prevalencia de la enfermedad. La coloración Ziehl-Neelsen (Figura 1) es la técnica recomendada para América Latina por la Unión Internacional Contra la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias, pues asegura resultados reproducibles con un entrenamiento sencillo y una ejecución económica. 5

21 Figura 1: Tinción Ziehl-Neelse en de bacilos de M. tuberculosis obtenidos de esputo, tomado de Romo et al En laboratorios con mejor equipamiento (microscopio de fluorescencia), puede ser apropiada la utilización de la técnica de fluorescencia, pues cuando el número de muestras examinadas es superior a cincuenta, esta técnica agilizaa el trabajo; sin embargo para poder realizarla con una calidad aceptable, debe de contarse con personal muy entrenado y un microscopio dee fluorescencia en buen estado (OMS 2008). Aunado a estoss métodos existen otros basados en cultivo: de cultivo en capa, Sistema MGIT (Mycobacte erial Growth Indicatorr Tube, Becton Dickinson and Company, Sparks MA, USA (Gomathi 2014, Robledo 2001) 1.3 Panorama epidemiológico. De acuerdo con el informe globall del control de la tuberculosis, que presentó la Organización n Mundial de la Salud (OMS) enn 2013, esta infección continúa siendo una importante causa de muerte en todo ell mundo. En términos generales, los resultados de este reporte (el cual se basó en la información de 1999 países) son los siguientes: 6

22 En el año 2005, solo 26 países alcanzaron las metas globales para el control de la tuberculosis. Se presentaron 8.8 millones de nuevos casos de tuberculosis en ese mismo año. Entre 1995 y 2005, se registraron 26.5 millones de pacientes con tuberculosis, tratados con la terapia de observación directa. En 2005, 1.6 millones de personas murieron a causa de la tuberculosis, cerca de 200,000 personas que estaban infectadas con VIH, murieron de tuberculosis en ese mismo año. De todos los países que presentan casos son solo 22 los que agrupan el 80% de los casos, distribuyéndose en el Sur de África; República de Kazajstán, Mongolia, India y el sureste Asiático; Groenlandia, Perú y Bolivia. En 2007 se registraron 14 millones de casos prevalentes, 9.4 millones de casos nuevos de este porcentaje el 85% correspondió a las regiones de África, Asia suroriental y el Pacífico Occidental, de estos 510,545 casos corresponden a tuberculosis multifármacoresistentes, y hubo un total de 1,77 millones de defunciones. (Oms 2012) Para el 2010 se detectaron 8.8 millones de casos nuevos, 1.1 millones de defunciones en casos VIH-Negativos y aproximadamente 35 millones de muertes en tuberculosis asociada a VIH, nuevos e importantes descubrimientos en las tendencias de esta epidemia han demostrado que el número absoluto de casos de TB ha descendido desde el 2006 (contrario a aumentar, cómo lo indicado en proyectos globales anteriores), así mismo las tazas de incidencia han disminuido desde el 2002 (dos años antes de lo pronosticado previamente). Estas actualizaciones de las estimaciones de la carga de enfermedad son el resultado de la finalización de una serie de consultas con 96 países entre 2009 y 2011, entre ellos China, India y 17 países africanos en el último año, y la disponibilidad y el uso de medidas directas de la mortalidad por tuberculosis. Los esfuerzos en curso para mejorar aún más la medición de los casos de tuberculosis y de muertes en el marco del Grupo de Trabajo Mundial de la OMS sobre la 7

23 Medición de Impacto TB, incluyendo el progreso en los estudios de prevalencia de tuberculosis y el trabajo innovador para fortalecer la vigilancia continúan. La carga de tuberculosis para las Américas fue de 309,481 de casos nuevos, 40,116 defunciones en casos VIH-Negativos y aproximadamente 7,892 muertes por tuberculosis asociada a VIH; del total de casos el 89% se presentó en 10 países: Brasil, Perú, Haití, México, Colombia, Bolivia, Ecuador, Guatemala, Estados Unidos y Venezuela, cabe destacar que el número de casos nuevos disminuyo entre 1990 y 2007 un total de 120,987 casos (OPS 2013). 1.4 Prevalencia en México En México se cuenta con una serie de indicadores clave para estimar la carga de tuberculosis, la cual sigue siendo relativamente elevada en términos de incidencia. Es importante comentar que en el distrito federal suelen reportarse un mayor número de casos, pero hay que considerar que esto se debe a que muchos de estos pacientes vienen de otros estados de la república para ser tratados en los centros hospitalarios de la Ciudad de México; es importante destacar que el diagnostico por tuberculosis se obtiene por medio de la baciloscopía en 71.5% de los casos. En nuestro país se presentaron 18,848 casos nuevos de TB en todas sus formas: 81.6% pulmonar (15,384 casos), 1.6% meníngea, 5.7% ganglionar y 11.1% de otras formas. De este total se relacionaron 20% como nuevos asociados a Diabetes, 4.9% casos en pediatría y 5.8% a sida (Castellanos 2010, OPS 2013) se registran aproximadamente 1000 casos nuevos por año de los cuales el 40 % corresponden a migrantes. De acuerdo con la Secretaria de Salud durante el último año se lograron importantes avances en materia de tratamiento y diagnóstico de TB, disminuyendo la mortalidad en un 11%, lográndose la cura en los últimos años del 84% de los casos (SSA 2012). 8

24 1.5 Prevalencia en Tamaulipas En el año 2014 la Secretaria de Salud del estado detectó hasta la semana 47 del seguimiento epidemiológico un total de 595 casos nuevos de TB en todas sus formas de los cuales 521(87.5%) casos fueron de TB pulmonar y 71(12.5%) extrapulmonar (SSA 2014), y de acuerdo anuario estadístico y geográfico de Tamaulipas en su edición 2013 se registraron 88 defunciones debido a esta enfermedad con una tasa por cada 100,000 habitantes de 2.7 (Disponible en: Farmacorresistencia La aparición de la resistencia es un fenómeno complejo que de acuerdo al Proyecto Global de Resistencia a Fármacos Antituberculosos y consta de al menos tres factores que se involucran: Los íntimamente relacionados con el paciente, los propios del contexto y aquellos del sistema de salud (Iseman 1994). Entre aquellos relacionados con el paciente se muestran como los más importantes el grado de pobreza (intrínsecamente el poder adquisitivo) y la preferencia por el sector privado; en los factores de contexto destacan la incidencia de infección por tuberculosis, la incidencia de coinfección con VIH, el producto interno bruto (por su relación con los gastos en el sector salud, así también por lo invertido en investigación y desarrollo) y niveles de equidad (Huhes 2012). Los factores relacionados con el sistema de salud, son preponderantes sin duda, pues representan aquellos que son modificables con mayor facilidad, en estos se incluye el desempeño de los programas de control, la presencia de programas de tratamiento acortado estrictamente supervisados, su categoría, la tasa de detección y su tasa de efectividad (García-García 2007) Clasificación de la farmacorresistencia: 1. Tuberculosis resistente. (TB-DR) 9

25 Es una clase de tuberculosis causada por la presencia confirmada de un bacilo del cual se ha detectado la resistencia a un fármaco antituberculoso de la primera línea. (Castellanos 2010) 2. Tuberculosis multidrogoresistente. (TB-MDR) La tuberculosis multirresistente es una forma específica de tuberculosis farmacorresistente, causada por un bacilo que es resistente por lo menos a la isoniazida y la rifampicina, considerados actualmente como los dos medicamentos más poderosos disponibles para combatirla (Streicher 2012, Velasco-Rodríguez 2004). 3. Tuberculosis de drogoresistencia extendida. (TB-XDR) El término fue primeramente aplicado por el Centro de Control y Prevención de Enfermedades CDC, por sus siglas en ingles en Originalmente se refería a una cepa con resistencia al menos a isoniazida y rifampicina sumada a la resistencia de al menos tres clases de las seis existentes de fármacos de la segunda línea (aminoglucósidos, polipéptidos, fluoroquinolonas, tioamidas, cicloserinas y ácidos amino salicílicos). (Jassal 2009), esta definición fue posteriormente revisada y redefinida, a una cepa resistente al menos a isoniazida y rifampicina, alguna fluoroquinolona y al menos una de las tres drogas inyectables de la segunda línea (amikacina, capreomicina, kanamicina) Mecanismos de Resistencia a Isoniacida. El hidrácido del ácido isonicotínico es un compuesto altamente efectivo en contra del complejo de MTB que incluye a Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, M. africanum y M. microti, tiene una concentración mínima inhibitoria baja, que oscila entre los 0.02µg/ml a 0.06µg/ml (Ashok 1998). Estudios de Middlebrook demostraron que la resistencia al isoniacida (H) está asociada con la perdida de la actividad de la catalasa; los estudios genéticos han demostrado la transformación de líneas resistentes a H de Mycobacterium 10

26 smegmatis y miembros del complejo MTB a quienes se restauró la funcionalidad de KatG, adquirieron al mismo tiempo una vez más la susceptibilidad al INH, dando fuerza a la hipótesis de que la perdida de KatG puede causar la resistencia a INH. En la ausencia de una respuesta genética inducida por peróxidos, que en la mayoría de las bacterias esta mediada por OxyR, KatG es la única proteína peróxido inducible en M. tuberculosis, por lo cual para que adquiera resistencia tiene que sacrificar la función de KatG. (Laurenzo 2011) Aunque la habilidad de M. tuberculosis para adaptarse a su perdida y para combatir los peróxidos orgánicos es destacable. Estudios recientes han demostrado que las cepas katg mutantes sobreexpresan una proteína de 22-kD a niveles más altos que las cepas sensibles a INH, análisis de secuenciación posteriores permitieron confirmar que es similar a una proteína reportada anteriormente, AhpC, esta proteína es capaz de detoxificar peróxidos orgánicos y es homóloga a otras proteínas que se pueden encontrar en otras especies de bacterias y proteínas eucariotas. Las regiones 5 (aproximadamente 39 a 81 pares de bases antes del codón de iniciación de ahpc) de ambas clases de micobacterias aquellas con AhpC sobreexpresada y el KatG mutante, contiene mutaciones que se consideran pueden aumentar la actividad del promotor, proponiéndose así que estas mutaciones son un mecanismo que compensa la falta de katg con el fin de auxiliar a combatir el estrés oxidativo. Sin embargo la sobreexpresión de ahpc no se observa en aislados de M. tuberculosis que presentan mutaciones en el codón katg315, que reportan un decremento fuerte en la actividad de KatG, confiriendo alta resistencia a H, concentraciones arriba de 90 µg/ml. Estudios clínicos para validar el paradigma de las deleciones en KatG y resistencia a H demostró que la completa pérdida del gen raramente ocurre. Por hibridación con la técnica llamada Southern blot se ha demostrado la presencia de katg en los 11

27 aislados de micobacterias resistentes a H excluyendo la idea que la perdida completa de katg es un mecanismo dominante para la resistencia a INH. Estudios previos utilizando la reacción en cadena de la polimerasa permitieron el análisis de la secuencia de katg de cepas resistentes a Inh mostrando mutaciones distribuidas aleatoriamente, incluyendo mutaciones puntuales, deleciones e inserciones de una a tres bases, estas mutaciones pueden alterar el producto del katg, conllevando a la síntesis de un producto defectuoso inactivo o con una actividad comprometida. La amplificación por PCR seguido por un polimorfismo conformacional de cadena sencilla (SSCP por sus siglas en inglés), detectaron desplazamientos y movilidad, respaldando la idea que la presencia de estas mutaciones son inherentes de la resistencia a INH (Calderón 2003) Análisis de katg por PCR-SSCP que resultaron en un fragmento de 237 pares de bases han demostrado una correlación de 68% entre la las mutaciones en katg y la resistencia a H. Análisis de secuenciación de cepas resistentes a H mostraron patrones de SSCP alterados, observándose que la mutación más común fueron los cambios de Guanina por Timina en el codón 463, en este cambio de G-T, Leucina es sustituida por Arginina, perdiéndose el sitio de restricción de Ncil y Mspl, lo que permite encontrar este polimorfismo por medio de análisis de restricción (Ravibalan 2014) Mutaciones en el regulador oxyr, del cual ahpc es divergentemente transcrito, podría explicar la adquisición de resistencia a H en los aislados con actividad de catalasa comprometida, en M. tuberculosis este regulón es mucho más pequeño que en Mycobacterium leprae a razón de dos deleciones importantes de 29 y 372 pares de bases, aunado a estas deleciones, el regulon oxyr, cuenta con muchas mutaciones de cambio de marco disponible de lectura resultan en una baja expresión de ahpc, un miembro relacionado de los géneros resistentes a INH, M. leprae, cuenta con una región oxyr-ahpc que es completamente activa y transcripcional, y puede jugar un papel importante en la destoxicación de 12

28 intermediarios activos de INH. Sin embargo los polimorfismos en oxyr no presentan un patrón de presencia preferencial para cepas susceptibles o no susceptibles a INH, pues se presentan alrededor de la misma frecuencia (Rattan 1998, Shenoi 2011) La relación entre la sobreexpresión de AhpC y la resistencia a H es más compleja, observaciones actuales basadas en la transformación de cepas de Mycobacterium smegmatis han sugerido el papel de la sobreexpresión de ahpc en la adquisición de resistencia a INH, la transformación de M. smegmatis con fracciones multicopia de ahpc, conducen a al incremento de al menos cinco veces la resistencia a INH. Los esfuerzos que se han ejecutado para determinar los factores relacionados con la resistencia a INH, condujeron al descubrimiento del locus inha, que ha sido propuesto como el principal blanco de la corresistencia a INH y Etionamida. Este locus está compuesto por dos marcos abiertos de lectura, ORF s por sus siglas en inglés, que han sido designados como orfl e inha, ambos están separados por una porción de 21 pares de bases que no es codificante. InhA y la enoyl-acp reductasa, presentan más de un 40% de homología a las proteínas EnvM, que son catalítica en los pasos tempranos de la síntesis de ácidos grasos en la membrana de enterobacterias. Al igual que EnvM, la actividad de InhA está relacionada con el uso del cofactor NAD(H) (Müller 2011). Una transversión de T>G se ha observado en algunas cepas resistentes, está ubicada en la posición 280 de inha, resultando en el cambio de serina94 a alanina94, se cree que este remplazo altera la afinidad de unión del InhA al NAD(H), resultando en última instancia en resistencia al H, alternativamente mutaciones en la considerada región promotora, puede desencadenar la sobreexpresión de inha, resultando en resistencia al H. La subsecuente caracterización bioquímica de la función de InhA demostró que este cataliza la reducción del acarreador 2-trans-octanoil-acilo así mismo de la proteína enoil CoA esteres, actuando así en los pasos finales de la elongación de las cadenas de ácidos 13

29 grasos, esta evidencia contradijo los trabajos de bioquímica más recientes, que sugerían que la enzima que se veía involucrada en la síntesis de un ácido graso no saturado de 24 carbonos era el blanco del H en su forma activa. (Hazbón 2006) Trabajos con lípidos marcados, demostraron que la biosíntesis de lípidos entre M. tuberculosis y M. smegmatis después de la exposición a INH era diferente, la transformación de M. smegmatis con alelos mutantes del loci inha con una sola copia, no resultaron significativamente resistentes a INH, indicando la presencia de un promotor diferente en M. smegmatis. Adicionalmente la inhabilidad de un vector multicopia que llevaban el gene inha incrementaron significativamente la resistencia de las micobacterias al INH, proveyendo información sobre el limitado papel del locus en mediar la resistencia a INH en los aislados, estos datos aunados a la evidencia clínica, permiten elucidar que inha es el principal blanco de la forma activada de INH. (Rattan 1998) La caracterización funcional de mutaciones en inha, que suceden al mismo tiempo con mutaciones en katg principalmente observadas en aislados con alta resistencia a INH en relación al metabolismo de lípidos puede ayudar a resolver discrepancias y delimitar los roles del loci respectivo en el mecanismo de acción del INH y subsecuentemente la adquisición de resistencia a fármacos. Dado que para llevar acabo su función activa como fármaco, necesita de la activación por medio de la enzima catalasa-peroxidasa (KatG), la cual es codificada por el gen katg, las mutaciones que se sucedan en ese gen, inevitablemente afectaran la resistencia o susceptibilidad a esta droga (Somoskovi 2001); estudios recientes han demostrado que la resistencia a isoniazida está relacionada con la pérdida de la actividad de la catalasa, la transformación de M. smegmatis resistente a la isoniazida con cepas de KatG funcional restaura la susceptibilidad al fármaco; sin embargo para que la bacteria adquiera la resistencia tiene que sacrificar la funcionalidad de KatG, por otro lado la capacidad de combatir peróxidos orgánicos de M. tuberculosis es de destacar, pues las cepas 14

30 resistentes sobreexpresan una proteína de 22-kD a niveles significativamente más altos que las cepas susceptibles, cuya secuencia es similar a la proteína AhpC, con la particularidad de ayudar a la detoxificación de peróxidos orgánicos (Drlica 2003). Estudios utilizando la reacción en cadena de la polimerasa mediando el análisis por secuenciación de katg de cepas resistentes, ha permitido encontrar mutaciones distribuidas aleatoriamente (Figura 2), incluyendo mutaciones puntuales, deleciones e inserciones, contribuyendo a la producción de proteínas con una actividad comprometida (Cho 2009). Figura 2: Distribución de las mutaciones en el gen katg reportadas actualmente, donde el eje x muestra la distribución en los codones y el eje y el número de mutaciones. Tomado de: La segunda causa de resistencia a isoniacida puede explicarse por mutaciones que afectan al gen inha (figura 3) y con mayor frecuencia a su regulador, el que codifica la proteína inha, responsable de la producción de ácidos grasos; recientemente, se ha propuesto a este gen como el responsable de resistencia cruzada a isoniacida y etionamida. Las mutaciones en los genes katg e inha están asociadas al 70 80% de los aislados resistentes a isoniacida; pero alrededor del 15 25% de cepas de M. tuberculosis resistentes a este fármaco poseen el genotipo silvestre tanto en el gen katg como inha, por lo cual se piensa debe existir otro mecanismo de resistencia (Cuevas-Córdoba 2010, Yakrus 2014). 15

31 Figura 3: Distribución de las mutaciones en el gen inha reportadas actualmente, donde el eje x muestra la distribución en los codones y el eje y el número de mutaciones. Tomado de: También se han reportado de manera menos frecuente otras mutaciones involucradas en la adquisición de resistencia, estas se han encontrado en el gen ahpc (figura 4) que codifica para una proteína con la capacidad de detoxificar el medio interno de la micobacteria de peróxidos orgánicos (Palomino 2011) Figura 4: Distribución de las mutaciones en el gen ahpc reportadas actualmente, donde el eje x muestra la distribución en los codones y el eje y el número de mutaciones. Tomado de: 16

32 La frecuencia de mutación inha-15 fue mayor en MDR-MTB que en cualquiera de los aislados de MTB mono-o poli-resistente a los medicamentos (9% frente a 6%). En la figura 5 se muestra la frecuencia de alelos mutantes katg315 e inha-15 en contraste de las cepas nativas. Figura 5: Frecuencia de los alelos mutantes katg315 e inha-15 en contraste alelos silvestres en aislados resistentes a isoniacida, tomado de Zhou (2011) La presencia o ausencia de mutaciones en el promotor inha y gen katg en las diferentes clases de resistencia a fármacos fue analizada utilizando muestras de 459 pacientes; las mutaciones identificadas para inha se ubicaron en la posición del nucleótido -15 del promotor, constituyendo la mayoría de estas (58.2%). En figura 6 encontramos la frecuencia de mutaciones identificadas por secuenciación del promotor del inha de cepas resistentes a INH. 17

33 Figura 6: Frecuencia de mutaciones al secuenciar el promotor de inha y el gen katg de aislamientos resistentes de M. tuberculosis En la figura 7 se muestra la presencia o ausencia de mutaciones en el promotor inha de acuerdo a la clase de resistencia mostrada por el aislado. Así también la relación que existe con las mutaciones con katg.(streicher 2012) Figura 7: Presencia ausencia de mutaciones en el promotor de inha y el gen katg en aislamientos de M. tuberculosis drogorresistentes. 1.7 Detección de farmacorresistencia Métodos Convencionales 1.- Método de proporción en agar. La muestra clínica (método directo) o un subcultivo (método indirecto) se utiliza para inocular placas de agar conteniendo un fármaco antituberculoso o no (usado para control) (Sequeira 2008). 2. Métodos en Caldo. 18

34 Una suspensión de células de M. tuberculosis es inoculada en viales o tubos de caldo conteniendo cada cual la concentración de fármacos antituberculosos (exceptuando el control) (Sequeira 2008). 3. Método Bactec 460. Utiliza un sistema de crecimiento con ácido palmítico marcado con carbono 14 para el crecimiento de la micobacteria, si el organismo crece en el medio, el carbono es liberado en el vial, lo que permite al aparato detectar el crecimiento del organismo. Para detectar resistencia en los viales que contienen los fármacos se inocula la muestra en una proporción cien veces mayor que en el control, esto con el fin de tener una correspondencia del 1% de resistencia considerada clínicamente significativa (Mishra 2012). 4. Bactec MGIT 960 Es un método no radiométrico para la determinación de susceptibilidad del complejo M. tuberculosis en caldo de cultivo. Ha sido validado para dar resultados de los fármacos estreptomicina, isoniazida, rifampicina y etambutol, en un tiempo cercano al brindado por el sistema BACTEC 460.(Loeffler 2011, Sharma 2010) Métodos Moleculares Sistemas de detección de fluorescencia mediante PCR en tiempo real. Esta técnica permite la detección de mutaciones con ayuda de sondas de ADN marcadas con diferentes tipos de fluorescencia, consiste en amplificar la región en donde se puede ubicar la mutación que confiere la resistencia al fármaco, y se analiza la fluorescencia del producto generado. De esta forma ha sido posible identificar mutaciones en los genes rpob, katg, inha y embb (Laurenzo 2011) Polimorfismo conformacional de hebra sencilla por PCR (SSCP, Polymerase Chain Reaction single stranded conformational polymorphism). 19

35 Esta técnica ha sido utilizada en investigaciones con la finalidad de identificar mutaciones relacionadas a enfermedades genéticas, extendiéndose recientemente su empleo a estudio de mutaciones asociadas con la resistencia a antibióticos en tuberculosis (Calderón 2003). El fundamento de esta técnica se basa en que bajo condiciones no desnaturalizantes, un fragmento de una hebra sencilla de ADN adopta una conformación espacial, en función de la secuencia de aminoácidos que presenta, por lo cual ante la presencia de una mutación la secuencia nucleotídica y la conformación y el plegamiento serán distintos, lo que desembocará en un patrón de migración electroforético diferente, y detectable en una matriz de poliacrilamida GenoType MTBDRplus. Es una técnica que actualmente se encuentra disponible comercialmente y permite la detección rápida de cepas del complejo M. tuberculosis resistentes a rifampicina e isoniacida, detectando mediante hibridación con sondas específicas, una variedad de mutaciones en el fragmento de 81 pares de bases del gen rpob, así como la mutación del codón 315 de katg y mutaciones en la región promotora de inha. Entre las ventajas que presenta, se encuentran el poder de llevar a cabo su aplicación tanto en cultivo como directamente en esputo; además su validez ofrece una sensibilidad para detectar resistencia a rifampicina de 98.1%, y para isoniacida de 90.2% con una especificidad de 97.8 y 100% para cada uno respectivamente (Asencios 2012, Dorman 2012) En la figura 8 se muestra la frecuencia de mutaciones en los diferentes genes, obtenidas para isoniacida por el método GenoType MTBDRplus. 20

36 Figura 8: Mutaciones asociadas con resistencia a isoniacida y rifampicina obtenidas mediante el análisis con GenoType MTBDRplus. 1.8 Secuenciación Es la técnica más exacta y también es considerada como el estándar en biología molecular para definir genotípicamente a una cepa drogorresistente; pues permite identificar la ubicación concreta de la o las mutaciones y esencialmente consiste en identificar y analizar la secuencia nucleotídica de un fragmento específico de ADN Se requiere obtener el ADN de la cepa a estudiar, amplificar por PCR la región de interés, donde el fragmento resultante es analizado por un secuenciador automático, el cual finalmente presenta la sucesión de ácidos nucleicos (Mardis 2011) Con el fin de diagnosticar la resistencia a fármacos en micobacterias, es posible secuenciar el gen involucrado en dicho mecanismo e identificar la mutación o mutaciones específicas mediante la comparación del gen secuenciado con el de una cepa sensible, aunque entre las principales limitaciones de esta técnica son los altos costos del equipo, de los materiales y reactivos que se requieren, y la necesidad de contar con personal con práctica y altamente especializados, aun y 21

37 con estas desventajas los estudios realizados mediante esta técnica son abundantes y la ubican como la técnica de elección para la detección genotípica de resistencias en cepas de M. tuberculosis (Cole 1998). Las epidemias de bacterias resistentes a drogas surgen en todo el mundo, generalmente las mutaciones que confieren drogorresistencia, conllevan una perdida en la actividad de las proteínas mutantes, sin embargo existen pruebas limitadas de que la evolución compensatoria tiene algún papel importante en el éxito de bacterias farmacorresistente Comas (2011) ha descrito una serie de mutaciones compensatorias en los genes de ARN polimerasa de M. tuberculosis resistente a rifampicina, siendo de destacar en los países con mayor incidencia del mundo de tuberculosis (TB) resistente (MDR), más del 30% de los aislados clínicos MDR presentó este tipo de mutación, que fue identificable gracias a la secuenciación de la totalidad del gen. La identificación y caracterización mediante secuenciación de los loci (etha, inha, katg, ahpc) relacionados con resistencia a isoniacida representa un avance significativo para el entendimiento de las relaciones que puedan existir entre los productos de estos genes y su interacción con los fármacos antituberculosos (Morlock 2003). La idea de pruebas rápidas para el diagnóstico de drogorresistencia en los patógenos causantes de la tuberculosis ha conducido a investigaciones que incluyen el análisis de mayores extensiones de los genes que se han relacionado a perfiles fenotípicos resistentes como inha, katg, entre otros, demostrando que al ampliar la búsqueda más allá de los marcadores más comunes, es posible encontrar mutaciones diferentes (Tekwu 2014). La genotipificación de aislamientos del Complejo Mycobacterium tuberculosis se ha convertido en un estándar para conocer las cepas que estructuran una población, tanto de manera local como global, siendo especialmente importante el análisis e 22

38 identificación de cepas MDR y XDR, donde los métodos clásicos y más recientemente la secuenciación del genoma han revelado que la diversidad poblacional y de las mutaciones encontradas ha sido mayor a la esperada y en suma, han permitido discernir diferentes niveles de resistencia y virulencia directamente relacionados con linajes y sublinajes (Niemann 2014). 23

39 II. JUSTIFICACIÓN México es un país donde la tuberculosis continua siendo un problema grave, particularmente el estado de Tamaulipas que se ubica por arriba de la media nacional estando entre los primeros estados en casos nuevos, donde cada año se registran alrededor de 1000, de los cuales la mayor incidencia se registra en los municipios fronterizos. Estos índices crecen principalmente a razón de que el estado es muy transitado por personas de todo el país y así mismo por personas de otros países de centro y Sudamérica, donde se registran altas tasas de incidencia de tuberculosis, estos migran con el propósito de llegar a los Estados Unidos de América sin embargo al no concretar este objetivo, quedan varados en las ciudades fronterizas aportando involuntariamente nuevos casos y nuevos focos de posible infección. Aunado a esto, durante los últimos años ha existido una tendencia a la alza en los casos de una variedad resistente a fármacos de esta enfermedad, donde la resistencia a Isoniacida y Rifampicina son las principales reportadas y algunos casos multidrogorresistencia, esto en conjunto a el binomio TB/VIH, abandono de los tratamientos o complicaciones y reinfecciones, hacen vislumbrar una ardua lucha contra esta pandemia que requiere el esfuerzo de todos niveles organizacionales de gobierno. Ante esto la rápida detección de cepas que presentan resistencia para aplicar el tratamiento adecuado, el conocimiento de las poblaciones del microorganismo y las características de su resistencia a nivel genético son herramientas que preponderan en el frente a esta enfermedad, las cuales ayudarán a la generación de información epidemiológica actual y la búsqueda de nuevos fármacos antituberculosos. 24

40 III. OBJETIVOS 3.1 Objetivo general Detectar e identificar mutaciones en los genes katg, inha y ahpc y la posible correlación de estas con resistencia a Isoniacida. 3.2 Objetivos específicos Detectar la prevalencia de las mutaciones de los genes inha, ahpc, katg mediante secuenciación. Contrastar las secuencias obtenidas con las mutaciones reportadas previamente en la literatura. Determinar la correlación entre los resultados obtenidos por secuenciación y los patrones de resistencia fenotípicos. 25

41 IV. MATERIALES Y MÉTODOS Figura 9: Diagrama de Flujo del Trabajo 4.1 Aislados Se analizaron 49 aislamientos pertenecientes al Complejo Mycobacterium tuberculosis, más un control (H37rv) del total, 31 fueron proporcionadas por el laboratorio de Medicina de Conservación del Centro de Biotecnología Genómica del Instituto Politécnico Nacional provenientes del banco de ADN, el restante (19) a través del laboratorio de Inmunoquímica del Departamento de Inmunología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional provenientes del cepario. 4.2 Criterios de selección Se seleccionaron aislamientos resistentes por lo menos a isoniacida (38, 76%) y un porcentaje susceptible a todos los fármacos probados (10, 20%). 26

42 4.3 Obtención de ADN genómico Extracción La extracción se realizó mediante el método Fenol-Cloroformo, de acuerdo al protocolo estandarizado en la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas (Apéndice A), de muestras sembradas previamente en medio Middlebrook 7h9 (Figura 10) y Lowestein-Jensen (figura 11) respectivamente. Figura 10: Preparación de Medio Middlebrook 7h9 Figura 11: Preparación de Medio Lowestein-Jensen Cuantificación de ADN genómico Para la cuantificación y pureza del ADN se tomaron 2 μl de ADN stock diluido en 48μL de agua ultrapura y utilizando el espectrofotómetro Biophotometer Eppendorf, se realizaron las mediciones correspondientes con una relación de absorbancia de 1.6 a 2.1 A 280/260 Diluyendo se obtuvo una concentración final de 0.5μg/μL, por último las muestras se mantuvieron a -20ᴼC Identificación de pertenencia al complejo MTC 27

43 Mediante el uso de PCR Multiplex (Mokaddas 2007) basada en la amplificación de una región variable de los genes oxyr y rpob (Apéndice B), permitiendo amplificar diferencialmente, 1banda para CMA (136pb) y 2 bandas para CMTB (235 y 473pb) (Figura 12) PB Figura 12: Identificación de los complejos CMA o CMTB mediante PCR Multiplex. Carril 1: Marcador de Peso Molecular. Carriles 2 10: Experimentales. Carril 11 y 12: Control Negativo y Positivo respectivamente. 4.4 Amplificación de los genes blanco katg, inha y ahpc Amplificación mediante PCR Se estandarizaron las reacciones en base a los protocolos de Lin (2007), Machado (2012), Ando (2011), para los genes katg, inha y ahpc respectivamente; se utilizaron 2 pares de iniciadores para amplificar katg y un par para las reacciones restantes (Cuadro 2). Las condiciones de amplificación fueron diferentes para cada reacción (Apéndice C); utilizando el termociclador Multigene Optimax marca Labnet variando el programa de amplificación para cada reacción (Apéndice D). Cuadro 2: Secuencias de los iniciadores utilizados para la amplificación de los genes katg, inha y ahpc Gen Nombre Secuencia 5-3 Posición Cobertura katg1 - F GTGCCCGAGCAACACCCACC 1 20 KatG katg1- R CAATTCCTCGGGGTGTTCCAGC pb katg2 - F CGGCTACGAGTGGGAGCTGACG katg2 - R TCAGCGCACGTCGAACCTGTC pb 28

44 inha ahpc inha3 - F AGGTCGCCGGGGTGGTCAGC (-)116 (-) pb GEN inha5 - R TTCCGGTCCGCCGAACGACAG (+)29 (+) ahpc - F AGAATGCTTGCGGCACTGCT (-)200 (-) pb GEN ahpc - R CTCATTGATTCCCGGCCAAC (+)10 (+) Visualización de los productos de PCR Se utilizó el intercalante SYBER Green, mezclando 2 μl de este con 5 μl de producto, así como el testigo positivo y negativo separándose mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% durante 90 minutos a 100 V; en la cámara de electroforesis Bio-Rad Sub-Cell, utilizando el marcador molecular de 100 pb Promega. Los productos separados se visualizaron y se cuantificaron mediante el espectrofotómetro Kodak Molecular Imaging Figura 13: Amplificación del gen inha. Carril 1: Marcador de Peso molecular 1500pb. Carriles 2 5: Cambios de temperatura, 60, 62, 64, 66 C respectivamente. 4.5 Secuenciación El protocolo de secuenciación incluyendo las condiciones y el programa de amplificación fueron realizadas por el Laboratorio de Especialidades Inmunológicas S.A. de C.V., D.F., México. (Apéndice E). 29

45 4.6 Análisis de secuencias Las secuencias obtenidas fueron valoradas con Sequence Scanner (Applied Biosystems) y procesadas mediante el software Geneious (Biomatters Ltd); procurando identificar si existían mutaciones contrastando las secuencias obtenidas con la cepa silvestre H37rv (NC_ ). Figura 14: Análisis de secuencias en Geneious (Biomatters Ltd), se observa en contraste verde un cambio en la secuencia de la muestra experimental ENCB2, gen inha en comparación con la secuencia de referencia H37rv (NC_ ). 30

46 V. RESULTADOS 5.1 Características clínicas de los aislados Antigüedad de los aislamientos De las muestras estudiadas 2% fue del 2007, 28% del 2008, 14% del 2009, 5% del 2010, 5% del 2011y un 46% sin información disponible (Figura 15) ). PORCENTAJE 50% 45% 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% 27% 14% 2% 5% AÑO 47% 5% 2011 SD FIGURA 15: Distribución de los aislamientos por año y porcentaje (SD: Sin datos) Procedencia de los aislamientos Relativo a la Jurisdicción Sanitaria el 23% es proveniente de la J. Sanitaria I que incluye los municipios de Cd. Victoria, Casas, Güemez, Llera, Hidalgo, Villagran y Mainero; el 19% proviene de la J. Sanitariaa II, comprendiendo los municipios de Tampico y Cd Madero; un 20% a la J. Sanitaria IV que comprende solo al municipio de Reynosa; el resto 38% pertenecen a muestras obtenidas de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas (Figura 16). 31

47 20 19 No. AISLAMIENTOS I II IV ENCB PROCEDENCIA Figura 16: Procedencia de los aislamientos en relación al número. De acuerdo con una investigación previa realizada con estos aislamientos mediante el análisis de los marcadores MIRU-VNTR se agruparon de acuerdo a la procedencia de los aislamientos (Apéndice F) ) Drogorresistencia La drogorresistencia de los aislamientos fue determinada previamente en pruebas por el Laboratorio Estatal de Salud Pública y por el Laboratorio de Inmunoquímica de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. La información sobre la procedencia y resistencia de los aislamientos se puede observar en el Cuadro 3. Cuadro 3: Origen de los aislamientos y resistencia identificada por Laboratorio Estatal de Biológicas. Salud Pública de Tamaulipas y Escuela Nacional de Ciencias ID Procedencia/ Jurisdicción Sanitaria Especie Clave LEI S H E R Z ENCB 1 ENCB CMTB S R S S S ENCB 2 ENCB CMTB S R S S S ENCB 3 ENCB CMTB S R R S S ENCB 4 ENCB CMTB S R S R S 32

48 ENCB 5 ENCB CMTB S R S S S ENCB 6 ENCB CMTB S R S S S ENCB 7 ENCB CMTB S R R R S ENCB 8 ENCB CMTB S R S S S ENCB 9 ENCB CMTB S R R S S ENCB 10 ENCB CMTB S R R S S ENCB 11 ENCB CMTB S R ENCB 12 ENCB CMTB S R R S S ENCB 13 ENCB CMTB S R S R S ENCB 14 ENCB CMTB S R S S S ENCB 15 ENCB CMTB S R S S S ENCB 16 ENCB CMTB S R S S S ENCB 17 ENCB CMTB S R S S S ENCB 18 ENCB CMTB S R S S S ENCB 19 ENCB CMTB S R S R S M1 IV M. tuberculosis S R S S S 3v IV M. tuberculosis S R S S S H4 IV M. tuberculosis S R S S S H8 IV M. tuberculosis S R S S S H11 IV M. tuberculosis S R S S S 11 IV M. tuberculosis S R S S S M13 IV M. tuberculosis S R S S S H19 IV M. tuberculosis S R S S S M28 IV M. tuberculosis S R S S S H31 IV M. tuberculosis S R S S S 31A I M. tuberculosis S R R S R 31B I M. tuberculosis S R R S R 191A I M. tuberculosis S R S S S 518B I M. tuberculosis S R S S R 773A II M. tuberculosis S R S R S 1223A II M. tuberculosis R R R R R 1325B I M. tuberculosis R R S R S 1829A II M. tuberculosis S R S R S 2040A I M. tuberculosis S R R S R 3572A II M. tuberculosis R R R S R 26A I M. tuberculosis S S S R S 2835A I M. tuberculosis R S R S S 2467A I M. tuberculosis R S R S S 24A II M. tuberculosis S S S S R 33

49 24B II M. tuberculosis S S S S R 680A II M. tuberculosis S S R S R 1798A I M. tuberculosis R S S S S 2455A I M. tuberculosis R S R S S 2467B I M. tuberculosis R S R S S H37RV M. tuberculosis S S S S S De los análisis previos, 8 aislamientos fueron resistentes a estreptomicina (S), 38 isoniacida (H), 15 a etambutol (E), 9 a rifampicina (R) y 9 a pirazinamida (Z); Del total 21 fueron monorresistentes a isoniacida, 1 a rifampicina y 2 a pirazinamida. Del resto de las cepas se identificaron resistentes a 2 o más fármacos. Cepas resistentes a 2 fármacos: 4 H+E (48142, 48148, 48149, 48151); 4 H+R (48143, 48152, 48158, 48176), 1 H+Z (48172), 4 S+E (48180, 48189, 48186, 48187), 1 E+Z (48184). Cepas resistentes a 3 fármacos: 1 S+H+R (48175); 1 H+E+R (48146); 3 H+E+Z (48169, 48170, 48177). Cepas resistentes a 4 o más fármacos: 1 S+H+E+Z (48178), Todos los probados (Figura 17). 5.2 Mutaciones identificadas Las secuencias obtenidas posterior a su revisión en Sequence Scanner fueron analizadas para la identificación de posibles mutaciones de los genes katg, e inha discriminando con la secuencia de la cepa silvestre H37rv, los resultados generales se pueden encontrar en el cuadro 4 para cada uno de los experimentos de secuenciación exitosos. Por razones ajenas a la investigación las reacciones para la obtención de las secuencias del gen ahpc no fueron exitosas. 34

50 Relación aislamiento resistencia Resistentes a 4 o más Fármacos TODOS S+H+E+Z 1 1 Monorresistentes Resistentes a 2 Fármacos Resistentes a 3 Fármacos H+E+Z H+E+R S+H+R E+Z H+Z H+R (MDR) H+E Z R H Figura 17: Distribución de la resistencia a fármacos entre el número de aislamientos 35

51 Cuadro 4: Resultados de la secuenciación de los diversos genes blanco, donde N: No encontrado, SIN: Sinónima Registro katg inha ahpc N N N N N N N N N N SIN SECUENCIA N N INSERCION C/800 N N INSERCION C/734 N N N N (335 T/C VXG) N N (1227 C/T GXD) (42 G/A RXW) (1280 G/C TXS) N (748 G/C VXL) (766 T/G YXD) N N N N 17 A/G NXD) N N N N N N N N SIN SECUENCIA N N N N N SIN SECUENCIA N N N N N N N N N N (758 A/C RXL) (818 T/G SIN) N (183 A/C SIN) N N N N N N N N N N N N N N INSERCION 9 A N N 443 T/C SIN N N N N SIN SECUENCIA (1170 C/G EXQ) (1117 N (488 A/G KXR) (501 C/A SIN) (526 A/T SIN) (21 T/C RXW) (228 T/G LXV) N N N N N 36

52 48171 C/G SIN) (2173 G/T HXN) (1478 T/C HXR) (1280 G/C TXS) (270T/G VXL) N N N N N N (723 A/G SXP) (112 C/A FXL) (466 T/C SIN) (488 T/G NXT) (515 T/C DXG) (546 T/C SXG) N SIN SECUENCIA N N N N N N (1049 G/C PXR) (1117 C/G SIN) (2067 G/C PXA) (1165 G/C HXD) ( 1067 G/A AXV) (1112 T/A IXF) N N N N N (1020 T/C KXE) (1021 C/G SIN) (1025 G/T PXH) (1027 G/T 1029 T/C NXE) (1662 T/C IXV) (1694 T/C GXD) (1712 T/C YXC) N 785 A/G SXG N N 639 T/C SIN N N N N (1501 T/G SIN) N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 5.3 Cambio de aminoácidos. De las mutaciones identificadas, se registraron los cambios en los codones mediante la paquetería Geneious (Biomatters Ltd), se determinaron los cambios de aminoácidos así como la clasificación de cada uno de ellos, enlistándose en los cuadros 4 y 5, para cada gen respectivamente. 37

53 Cuadro 5: Codones y cambios identificados para el gen katg MUESTRA CODÓN CAMBIO AMINOÁCIDOS CLASIFICACIÓN Glicina Valina Hidrófobo / Hidrófobo /727 Serina Treonina Hidrófilo / Hidrófilo Triptófano Arginina Básico / Hidrófobo Glicina Treonina Hidrófilo / Hidrófilo 488 Leucina Arginina Hidrófobo / Básico Glutamina Ácido Glutámico Ácido / Hidrófilo Serina Arginina Treonina Treonina Histidina Glicina Hidrófilo / Hidrófilo Básico / Básico Hidrófilo / Hidrófilo Glicina Glicina Treonina Cisteína Leucina Serina Ácido aspártico Asparagina Treonina Fenilalanina Hidrófilo / Hidrófilo Hidrófilo /Ácido Hidrófilo / Hidrófilo Hidrófilo / Hidrófilo Hidrófobo / Hidrófobo 385 Valina Alanina Hidrófobo / Hidrófobo Ácido aspártico Histidina Ácido /Básico 52 Alanina Prolina Hidrófobo / Hidrófobo 391 Arginina Prolina Básico / Hidrófobo Alanina Treonina Hidrófilo / Hidrófobo Ácido glutámico Histidina Ácido glutámico Cisteína Ácido aspártico Valina Asparagina Prolina Lisina Tirosina Glicina Isoleucina Ácido / Hidrófilo Básico / Hidrófobo Ácido / Básico Hidrófilo / Hidrófilo Ácido /Hidrófilo Hidrófobo / Hidrófobo Cuadro 6: Codones y cambios identificados para el gen inha MUESTRA CODÓN CAMBIO AMINOÁCIDOS CLASIFICACIÓN Inserción C Inserción C Ácido aspártico Tirosina Ácido /Hidrófilo 250 Leucina Valina Hidrófobo / Hidrófobo Ácido aspártico Asparagina Ácido /Hidrófilo Promotor Inserción A-(-9) Arginina Lisina - Básico / Básico Leucina Valina Valina Leucina Hidrófobo / Hidrófobo Hidrófobo / Hidrófobo 38

54 7 Triptófano Arginina Hidrófobo/ Básico Glicina Serina Hidrófilo / Hidrófilo 39

55 VI. DISCUSIÓN A nivel mundial la tuberculosis aun plantea un reto, tanto en el aspecto epidemiológico cómo en los aspectos de diagnóstico, terapéutico y asimismo la alta incidencia en los países en vías de desarrollo y la coinfección con el VIH/SIDA, develan un panorama urgente sobre la evolución de la enfermedad en los años venideros, si bien se han alcanzado algunas de las metas presentadas por la Organización Mundial de la Salud, la necesidad de un diagnóstico y tratamiento oportunos continúan siendo una primera necesidad para el control y posterior erradicación de esta enfermedad (Lugones-Botell 2012). De acuerdo a Shakya (2012); Los niveles de drogorresistencia continúan en aumento y lentamente la concentración de los fármacos actuales se debe incrementar, o la aplicación de nuevos fármacos se vuelve una necesidad, sopesando las consecuencias citotóxicas de los diversos compuestos de las probables causas del surgimiento de cepas MDR o XDR, Mitnick (2008) ha señalado que la selección de cepas mutantes mediante tratamientos fallidos o recaídas de los pacientes es una de las principales causas. Palomino (2011) describe que diversas mutaciones se han encontrado a través de los años, mutaciones plenamente relacionadas con los perfiles fenotípicos de resistencia de las micobacterias, de donde destacan cambió plenamente estudiados como Ser315Thr en katg o Ile194Thr en inha; si bien pueden ayudar a explicar la mayoría de los casos, existen mutaciones que aún no se han detectado, e inclusive podrían estar determinadas por las diferentes zonas geográficas donde circulan las cepas de micobacterias Feuerrigel (2012) Del total de mutantes en lo relativo a la distribución geográfica de los aislamientos, las cepas provenientes de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas en 4/11, 36% se identificaron mutaciones en inha y en 3/12, 25% se identificaron mutaciones en katg, el resto 7/11, 64% inha y 9/12, 75% katg fueron 40

56 identificadas en cepas obtenidas a través del laboratorio de Medicina de Conservación. De esta organización de los aislamientos se observó que las muestras correspondientes a las jurisdicciones sanitarias I y II, mostraban mayor cantidad de mutaciones; 54% del total pertenecientes a la jurisdicción sanitaria I y 62% del total pertenecientes a la jurisdicción sanitaria II, mientras que del total de las pertenecientes a la jurisdicción sanitaria IV solo un 20% se identificó cómo mutantes las pertenecientes a la ENCB mostraron solo un 21% de mutaciones. Varghese (2012), encontró que las mutaciones asociadas con la resistencia a INH fueron más diversas. 67,2% tenían la mutación en el gen katg y 31,3% de las cepas afectadas en el gen inha. Entre las cepas mutadas en el gen inha, 36 fueron mutados en posición (-15) y 6 en la posición (-8). En este estudio si fue posible detectar mutaciones en 12 cepas (40%) en katg y 11 cepas (27%) para inha. De acuerdo con Bolado-Martínez E. (2011) en la región promotora del gen inha, la mutación más frecuente (-15C> T), con prevalencia de 23.7%, en Brasil 66% y en EUA se detectó en cinco (38.46%) de las cepas resistentes a H y en dos de las cepas con resistencia fenotípica a H no se demostraron mutaciones, en contraste en este proyecto encontramos una inserción, A-(-9); en la región promotora que hasta el momento no se han encontrado reportes de esta mutación y el aislamiento es resistente únicamente a isoniacida. En estudios de caracterización de cepas resistentes a H con una concentración mínima inhibitoria mayor a 1.0 µg/m, fue encontrada una mutación en las bases 581 de inha, causante de la substitución de aminoácidos de Isoleucina 194 por Treonina (ATC-ACC), afectando la capacidad de InhA de unirse a NAD(H) disminuyendo la taza de reacción, aun y cuando una alta concentración de NAD(H) la reacción no puede ser llevada a los niveles normales de las cepas silvestres, esto indica que la isoleucina 194 participa en la formación de puentes 41

57 hidrogeno con NAD(H); estudios recientes de dinámica molecular (Schroeder 2005) han mostrado que Ile194 como uno de los diez más importantes residuos de aminoácidos que hacen puentes hidrogeno conservados con el cofactor NAD(H) en la proteína InhA de las cepas silvestres, esto podría explicar la resistencia en cepas mutantes de este codón en particular en inha, sin embargo nuestros hallazgos muestran diversas mutaciones tanto en la región promotora(a -9) cómo en la región codificante siendo todos los aislamientos resistentes (48144, 48145, 48149, 48151, 48166, 48169, 48170, 48172), que puede conllevar a una variación en la acidez y/o afinidad por el agua entre los aminoácidos sustituidos y así mismo generando pequeñas variantes en la pk a, (Rozwarski 1998 ) lo que podría ayudar a explicar la influencia de estas mutaciones sobre los perfiles de resistencia. InhA en su forma reactiva con NAD(H) resulta más susceptible de reacción a INH activado que en su forma libre, por lo tanto una menor afinidad a NAD(H) protege a la mayor parte de InhA. Alternativamente si Ile194Thr InhA tiene una afinidad disminuida con NAD(H), su afinidad con NAD(H)-isonicotínico también se verá reducida, pues el INH activado puede unirse al NAD(H) libre formando una molécula que es capaz de bloquear la reacción enzimática de InhA aun si es una forma no afín (Cho 2009) La baja afinidad con el NAD(H)-isonicotínico, promueve su liberación por parte de la enzima y permite que el sustrato normal de catálisis se una. Cualquiera de estos escenarios puede resultar en la resistencia a INH, en cepas con una secuencia nativa de katg (Leung 2006). Estudios de Zhou (2011) en 2010 por MAS-PCR demostraron que 58 (58/89, 65%) de los aislamientos INH resistentes tenían mutación en el katg 315 y 7 (7/89, 8%) tenían la mutación en inha-15 en la región promotora. Ninguno de los 65 aislados portan mutaciones dobles de la katg 315 e inha 15-. De los 55 aislamientos MDR-MTB, 34 aislamientos presentaron la mutación katg 315, mientras que 5 aislados tenían inha-15 mutación. La mutación en katg 315 se identificó en el 62% de los aislamientos de MTB-MDR; sin embargo durante nuestra investigación únicamente dos aislamientos (48149, 48171) de cuarenta resistentes (2/40, 5%) presentaron la mutación Ser315Thr, esto puede indicar que 42

58 la resistencia a H de las muestras en la presente investigación se debe a las diferentes mutaciones presentes en las cepas, las cuales resultaron ser diferentes a los marcadores moleculares más comunes. Considerando lo anterior en este trabajo encontramos únicamente un aislamiento portador de mutaciones en ambos genes (48170), resistente a H, E y Z, con mutaciones katg Glu351Glu e inha Leu90Val, Val76Leu, Tri7Arg; destacando que no se han encontrado reportes de tales mutaciones en bases de datos actualizadas Broad Institute (Murray 2014) y TB Drug Resistance Mutation Database (Sandgren 2010). Rahim (2012), reportó que de cepas aisladas resistentes a isoniacida que mostraron mutaciones en la región regulatoria de inha (218) el 16.5% de ellas mostraron una mutación de C a T en le región regulatoria -15. Entre estas cepas, 21 presentaron una mutación adicional en katg315. Uno de cada uno tenía mutaciones adicionales concurrentes en katg Ser315Thr/inhA T -8 A, katg Ser315Thr/inhA T -8 C y katg Ser315Thr/inhA C34 T. Doce (5,5%) tuvieron una G a A en la posición -47 de la región reguladora inha en asociación con la sustitución Ser315Thr de katg. Y doce (5,5%) de las cepas resistentes a múltiples fármacos fenotípicamente no presentaron mutaciones en ambos genes katg y regiones reguladoras inha, en contraste durante nuestro trabajo no se encontraron cepas sin mutaciones que tuviesen un perfil resistente, pero sí dos cepas sensibles a isoniacida pero resistentes a pirazinamida, y de ellas solo una portadora de mutaciones en inha Gli262Ser De acuerdo a Tessema (2012) en el estudio sobre aislados de Etiopia, no encontraron aislados que mostraran mutaciones en ambos genes katg an inha simultáneamente, las mutaciones asociadas con la resistencia a isoniacida fueron encontradas más abundantemente que aquellas relacionadas con la resistencia a rifampicina y etambutol. De 35 cepas H resistentes, 94% presentaron mutación en katg315 con un cambio de aminoácido de Ser315Thr, reflejando un alto nivel de 43

59 resistencia, mientras que el 6% de las cepas presentaban mutación en inha, C15T, mostrando bajos niveles de resistencia. Silaigwana (2012), reportó no haber encontrado mutaciones en el gen katg en las muestras utilizadas en su estudio. Explican que el ensayo Genotype MTBDRplus, solo detecta mutaciones en el codón 315 de katg, por lo tanto otras mutaciones además de las que suceden en el codón 315 no pudieron ser detectadas, siendo consistente en esto con Miotto (2008) y Dorman (2012); Todas las muestras resistentes a H, presentaron mutaciones en inha, la sustitución T8A fue la más frecuentemente registrada, también realizaron una interesante observación en seis de las diez muestras que contaban con la mutación T8A, esas muestras resultaron positivas para los tipos nativos de inha y la prueba respectiva de mutación, indicando la posibilidad de resistencia a H; que es el resultado de la coexistencia de cepas susceptibles y resistentes de M. tuberculosis., entre los aislamientos que analizamos no se identificó la mutación T8A pero sí una inserción en la región promotora A-9 en una cepa (48166) monorresistente a isoniacida que no presentó mutaciones en el gen katg, analizando la tiras reactivas del MTBDRplus en el manual de interpretación (Hain 2012), de todas las mutaciones identificadas en nuestro trabajo (37) únicamente 2, 5% (Ser315Thr), tendrían la posibilidad de ser identificadas por este método, observando una baja sensibilidad para la determinación de drogorresistencia en los aislamientos analizados, debido a que principalmente a que las incidencias observadas en las secuencias aún no se han encontrado en literatura; y recapitulando el procedimiento del MTBDRplus, incluye únicamente las mutaciones más comunes relacionadas con resistencia a H y R. En la investigación de Khosravi (2012), se realizó la secuenciación de una porción de 250 pares de bases del codón katg315, revelando mutaciones puntuales en cinco diferentes codones en 13.7% de los aislados de M. tuberculosis, la secuenciación de 270 pares de bases de la región central de rpob reveló mutaciones puntuales en 77 diferentes codones en 12 de los aislados de M. 44

60 tuberculosis, donde los resultados obtenidos con MAS-PCR son concordantes con los resultados de secuenciación con una alta sensibilidad y especificidad para katg315. inha15 y rpob (531, 516, 526). Si bien en nuestro estudio no se realizaron técnicas adicionales para la comprobación de las mutaciones, se aplicó la técnica de secuenciación previa a la amplificación de los genes blancos por PCR de alta fidelidad. 45

61 VII. CONCLUSIONES Se lograron identificar mutaciones en los genes katg e inha de los aislamientos resistentes a H, así mismo en 2 asilamientos sensibles a H mutaciones en el gen inha. De las 40 cepas resistentes a H analizadas en 9 (22.5%) se identificaron mutación en el gen katg y en 11 (27.5%) del gen inha. Se observó que los perfiles de resistencia más amplios podían relacionarse con mutaciones identificadas en el gen katg y también se lograron identificar patrones de resistencia similares entre cepas de la misma procedencia. De las mutaciones identificadas en el gen inha se observó una relación con perfiles de resistencia baja o monorresistencia en la mayoría de los casos. La incidencia de las mutaciones mayormente reportadas para los genes en cuestión fue baja 5% 46

62 VIII. RECOMENDACIONES Para la continuación y complementación de este estudio se recomienda: 1. Ampliar la búsqueda a otros genes que se encuentren relacionados con resistencia a isoniacida. 2. Ampliar la búsqueda a otros genes relacionados con resistencia a los fármacos probados. 3. Ampliar la muestra de trabajo. 4. Concretar un análisis completo de genotipificación de las muestras. 47

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68 X. APÉNDICE Apéndice A: Metodología de extracción de ADN. La extracción se realiza centrifugando 5 ml del cultivo a 4500g por 15min. Se resuspende la pastilla en 400 µl de TE (1x), se transfiere a un microtubo y se calienta a ebullición por 10 min, dejándose enfriar a temperatura ambiente. Posterior a esto se adicionan 50 µl de lizosima (100mg/ml, suspensión acuosa), se agita en vórtex por 30 seg y se incuba a 37 C toda la noche. El día siguiente se adicionan 70 µl de SDS al 10% y 6µ de proteínasa K (10mg/ml, suspensión acuosa). Se agita en vórtex y se incuba a 65 C durante 10 min; se adicionan 100 µl de NaCL 5M y 100 µl de solución de CTAB/NaCl (precalentada a 65 C), se homogeniza en vórtex hasta que el líquido se torna lechoso y se incuba a 65 C 10 min. Durante los siguientes pasos se conserva en frío. Se añaden 750 µl de cloroformo: Alcohol isoamílico (24:1). Se agita en vórtex 10 seg y se centrifuga a temperatura ambiente a 8000g durante 10 min. El sobrenadante se transfiere a un tubo limpio sin tomar la interfase; posteriormente se adicionan 0.6 volúmenes de isopropanol y se coloca durante 30 min a -20 C. La muestra se centrifuga a temperatura ambiente a 8100g por 15 min y el sobrenadante se desecha. La pastilla se resuspende en 500 µl de etanol al 70% frío, se agita suavemente y se centrifuga nuevamente a 100g por 10 min; el sobrenadante se desecha. Finalmente la pastilla se resuspende en 20 µl de amortiguador TE 1x (Tris 10mM, EDTA 1mM). Apéndice B: Protocolo de PCR Multiplex para identificación de complejos. La amplificación para la identificación de los complejos de se utilizó la premezcla Ampliqon III con iniciadores MTC, NTC e IGR, IDT Technologies Ciclos para la amplificación. 53

69 95 C, 3 ; 97 C, 1 (95 C, 1 ; 64 C, 30, 72 C, 1 )x2; (95 C,1 ; 62 C, 30, 72 C, 1 )x2; (95 C,1 ; 60 C, 30, 72 C, 1 )x2; (95 C,1 ; 58 C, 30, 72 C, 1 )x2, (95 C,1 ; 56 C, 30, 72 C, 1 )x22 y 72 C, 10. Apéndice C: Condiciones de amplificación para katg, inha y ahpc. Componente/Volumen 25 µl Amortiguador 1x katg 1.5mM MgCl 2 inha 2.5 mm ahpc 2 mm Iniciador Sentido 10 µm Iniciador Contrasentido 10 µm DNTP s 10 µm ADN 20 ng Polimerasa 1.25 U Agua Ultrapura Ajustado Apéndice D: Programa para PCR katg Inicial Ciclos x35 Final Tiempo Temperatura ( C) inha Inicial Ciclos x40 Final Tiempo Temperatura ( C) ahpc Inicial Ciclos x30 Final Tiempo Temperatura ( C)

70 Apéndice E: Reporte de Secuenciación Las reacciones de secuenciación fueron enviadas al Laboratorio de Especialidades Inmunológicas, México D.F. donde se procesaron de acuerdo a los protocolos establecidos, dividiéndose en las siguientes etapas: METODOLOGÍA Recepción de muestras: Se enviaron las muestras de la Ciudad de Reynosa, al recibirlas en D.F. les fue asignado un número dentro del laboratorio. Detección de secuencias en ADN La detección de secuencias de ADN correspondientes a Mycobacterium tuberculosis, se realizó por medio de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de punto final con los iniciadores citados anteriormente. Visualización de las secuencias amplificadas Los productos de PCR se separaron por electroforesis en agarosa al 2,0 % con amortiguador TAE 1X, a 100 volts por 40 minutos y las bandas fueron teñidas con MasterSafe. Corte y purificación de bandas de ADN Los productos de PCR se cortaron a partir del gel de agarosa y se purificó el ADN amplificado (Ver tabla 2), se colocaron en tubos eppendorf estériles de 1,5 ml. La purificación del ADN se realizó de acuerdo a las especificaciones del fabricante con el kit illustra GFX PCR ADN and Gel Band Purification (GE Helthcare). Se cuantificó el ADN en el espectrofotómetro Nanovue plus. 55

71 Amplificación y marcaje de productos de PCR con Dideoxiterminadores Se realizó una reacción de PCR secuenciación con el ADN de acuerdo al procedimiento del kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing. Los productos de PCR marcados con fluorescencia se purificaron en columnas de CentriSep (sepharose), se deshidrataron en el concentrador de vacío y se desnaturalizaron con formamida. Secuenciación de productos de PCR marcados con fluorescencia La separación de los productos de PCR marcados con dideoxiterminadores, se realizó por electroforesis capilar en el equipo Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems) con el empleo de polímero POP7, en un arreglo de 8 capilares de 50 cm de longitud. Detección de secuencias de M. tuberculosis en muestras de ADN Las figuras 1, 2, 3 y 4 muestran la detección de secuencias de M. tuberculosis en las muestras de ADN enviadas a análisis. El análisis de las muestras positivas a M. tuberculosis mostró productos de PCR del tamaño esperado para cada par de iniciadores. 56

72 Figura 1. Electroforesis de productos de PCR. Se emplearon 100 ng del ADN amplificado. En el primer carril se colocó marcador de peso molecular en pares de bases (pb). En los siguientes pozos se colocaron las muestras con su respectivo número de orden, en el último pozo (extremo derecho) se muestra el control negativo (NTC) en el cual se colocó agua en lugar de ADN. El tamaño esperado de los productos de PCR fue de 818 pb 57

73 Figura 2. Electroforesis de productos de PCR. Se emplearon 100 ng del ADN amplificado. En el primer carril se colocó marcador de peso molecular en pares de bases (pb). En los siguientes pozos se colocaron las muestras con su respectivo número de orden, en el último pozo (extremo derecho) se muestra el control negativo (NTC) en el cual se colocó agua en lugar de ADN. El tamaño esperado de los productos de PCR fue de 976 pb. 58

74 Figura 3. Electroforesis de productos de PCR. Se emplearon 100 ng del ADN amplificado. En el primer carril se colocó marcador de peso molecular en pares de bases (pb). En los siguientes pozos se colocaron las muestras con su respectivo número de orden, en el último pozo (extremo derecho) se muestra el control negativo (NTC) en el cual se colocó agua en lugar de ADN. El tamaño esperado de los productos de PCR fue de 1211 pb 59

75 Figura 4. Electroforesis de productos de PCR. Se emplearon 100 ng del ADN amplificado. En el primer carril se colocó marcador de peso molecular en pares de bases (pb). En los siguientes pozos se colocaron las muestras con su respectivo número de orden, en el último pozo (extremo derecho) se muestra el control negativo (NTC) en el cual se colocó agua en lugar de ADN. El tamaño esperado de los productos de PCR fue de 1213 pb. Secuencias Reportadas Secuencias obtenidas de los iniciadores ahpc No se obtuvo ninguna secuencia. Secuencias obtenidas de los iniciadores inha >48140-FW INHA CAGCGGCATGTGTATGGGCCACTGACACAACACAAGGACGCACATGACAGG ACTGCTGGACGGCAAACGGATTCTGGTTAGCGGAATCATCACCGACTCGTCG ATCGCGTTTCACATCGCACGGGTAGCCCAGGAGCAGGGCGCCCAGCTGGTGC TCACCGGGTTCGACCGGCTGCGGCTGATTCAGCGCATCACCGACCGGCTGCC GGCAAAGGCCCCGCTGCTCGAACTCGACGTGCAAAACGAGGAGCACCTGGC CAGCTTGGCCGGCCGGGTGACCGAGGCGATCGGGGCGGGCAACAAGCTCGA CGGGGTGGTGCATTCGATTGGGTTCATGCCGCAGACCGGGATGGGCATCAAC CCGTTCTTCGACGCGCCCTACGCGGATGTGTCCAAGGGCATCCACATCTCGGC GTATTCGTATGCTTCGATGGCCAAGGCGCTGCTGCCGATCATGAACCCCGGA 60