Laura Córdoba García Departamento de Estructura de Macromoléculas CNB-CSIC, Madrid Jueves, 4 de Julio de 2013 Sunday, July 17, 2011 Sunday, July 17,

Transcripción

1 Laura Córdoba García Departamento de Estructura de Macromoléculas CNB-CSIC, Madrid Jueves, 4 de Julio de 2013 Sunday, July 17, 2011 Sunday, July 17, 201

2 Parte 1: Adenovirus - Patógeno en animales y humanos - Virus icosaédricos sin envuelta - ADN bicatenario lineal - Fibras o espinas implicadas en la unión celular Dominio globular Dominio fibroso Fibra Base pentona CAR Integrina Waehler R, et al. Nat Rev Gen, 2007

3 Las fibras de los adenovirus Dominio globular Dominio fibroso Estudio estructural de las fibras: - Identificación de receptores celulares - Estabilidad de las fibras virales y descubrimiento de nuevos plegamientos - Uso como vectores en terapia génica Base pentona Determinación de la estructura del dominio cabeza de fibras de nuevos adenovirus PAdV-4 fibre galectin domain bound to tri-n-acetyl-lactosamine (Mastadenovirus) TAdV-3 fibre head (Siadenovirus)

4 Snake adenovirus (SnAd1) - Perteneciente al género Atadenoviridae - Genoma compuesto por 27kbp - Proteína de la fibra compuesta por 415 aminoácidos Farka S.L., et al. Virus Res, 2008

5 Clonaje y mutagénesis dirigida Dominio C-terminal de la fibra de SnAd1 Ligación Quick change site-directed mutagénesis kit (Agilent Technologies, Inc.) Cambio de los aminoácidos leucina 322 y 324 por metionina 234:HISTAGPSPPSKTSLDIAEELQNDKGVSFAFQAREEELGAFT KRTLFAYSGDGLTGPFKAPASAELSSFLTAHPKGRWLIAFPLGTGI VSVDEGILTLEISRSLPEVGSGSSFYLTEK: :HISTAGPSPPSKTSLDIAEELQNDKGVSFAFQAREEELGAFTKRT LFAYSGDGLTGPFKAPASAELSSFLTAHPKGRWLIAFPLGTGIVSVDE GIMTMEISRSLPEVGSGSSFYLTEK:345

6 Expresión, purificación y cristalización - Cepas de expresión: (DE3) y BL834(DE3) - Purificación en dos pasos: columna de níquel Proteína nativa cromatografía de intercambio iónico Proteína mutada (SeMet) 14kDa 14kDa

7 Estructura atómica Vista frontal SnAd1 Vista lateral had2

8 Parte 2: Bacteriófagos Orden Caudovirales - Infectan bacterias - Genoma DNA de doble cadena - Cabeza icosaédrica Podoviridae - Cola especializada en la inyección del DNA en la célula hospedadora Myoviridae Vessler D.,et al. MMBR 2011 Siphoviridae - Placa basal a la que se unen una o más fibras responsables del primer reconocimiento celular

9 Escherichia coli fago T7 - Familia Podoviridae - Lítico - Cápsida icosaédrica, 40 kb DNA - Cola corta no contráctil de 20-nm de longitud - Seis fibras compuestas por la proteína gp17 Bo Hu, et al. Science 2011

10 Las fibras de T7 Dominio de unión al virus Dominio proximal Cápsida Fibra Dominio distal Cola Dominio cabeza Estudios estructurales de las fibras: - Tipado de bacterias - Terapia fágica Dominio pirámide

11 Identificación de aminoácidos implicados en la unión al receptor celular Mutaciones introducidas en gp17 usando el Quick change site-directed mutagénesis kit (Agilent Technologies, Inc) V482A S483A V484A N501A N502A S503A W504A Y515A F516A I517A A518L D520A S541A R542A S543A V544A Todos los mutantes expresaron proteína soluble, lo que sugiere que debe plegarse correctamente

12 Mutación amber (TAG) Introducción de un codón stop prematuro pérdida de la función de la proteína Virus con mutaciones amber infectan solo ciertas cepas bacterianas supresoras de amber Herramienta útil para la generación de fagos con proteínas recombinantes fácil aislamiento en cepas no supresoras

13 Introducción de la mutación amber en gp17 T7 wild-type ATG GCT AAC GTA ATT AAA ACC GTT TTG ACT TAC CAG TTA GAT GGC TCC AAT CGT GAT TTT AAT ATC CCG M A N V I K T V L T Y Q L D G S N R D F N I P T7_gp17 mutante amber ATG GCT AAC GTA ATT AAA ACC GTT TTG ACT TAC TAG TTA GAT GGC TCC AAT CGT GAT TTT AAT ATC CCG M A N V I K T V L T Y L D G S N R D F N I P

14 Construcción del mutante amber gp17 mediante recombinación homóloga Clonaje del gen mutado su + Transformación Infección con wild-type T7 Cultivo de recombinantes MOI= cells/ml Wild-type T7 Stock viral amber (10 10 pfu/ml) su + Secuenciación su Amber T7 Progenie T7 DNA Recombinación homóloga

15 Generación de virus T7 con fibras mutadas mediante complementación 16 fibras mutantes su - IPTG petduet-1 Transformación su - mrna Cultivo de recombinantes Infección Proteína de la fibra mutada 10 8 cells/ml Contaje de placas Progenie gp17am T7 DNA Complementación

16 Infectividad de los mutantes en BLRDE3 and TOP10 BLRDE3 ( B) TOP10 ( K12) Diluciones virus T7 amber Genotipo Wt_exp Null V482A S483A V484A N501A N502A S503A W504A W515A F516A I517A A518L D520A S541A R542A S543A V544A Diluciones virus T7 amber Genotipo Wt_exp Null V482A S483A V484A N501A N502A S503A W504A W515A F516A I517A A518L D520A S541A R542A S543A V544A 0 0 0

17 Construcción de una librería de fagos T7 con mutaciones aleatorias en la fibra PRIMERS DEGENERADOS Mutaciones aleatorias en aminoácidos Secuencia wild-typet7 5 - CTGGCCCCGATGGAATCTACTTCATAGCCTCTGATGGTGGATGGTTACGA- 3 Secuencia degenerada 5 - CTGGCCCCGATGGAATCTACTTCNNGNDNNWNNNRGGTGGATGGTTACGA- 3 Mutaciones aleatorias en aminoácidos Secuencia wild-typet7 5 -TCGGATTCAAGAATATTGCAGACAGTCGTTCAGTACCTAATGCAATCATGG- 3 Secuencia degenerada 5 - TCGGATTCAAGAATATTGCAGACNDNNHNNWNNVNCCTAATGCAATCATGG- 3 R=AG, W=AT, D=AGT, H=ACT, V=ACG, N=ACGT

18 Construcción de una librería del gen gp17 Librería del gen gp17 wt gp17 wt gp17 Transformación Pool Pool Mutante Mutante

19 Producción de virus mutantes mediante recombinación homóloga Infección con el mutante amber gp17 Cultivo de bacterias recombinantes T7 DNA Recombinación homóloga

20 Acknowledgements Mark van Raaij lab (CNB-CSIC) - Abhimanyu Kumar Singh - Marta Sanz - Carmela Garcia-Doval - Meritxell Granell - Thanh Hong Nguyen