BETALACTAMASAS COMO MECANISMO DE RESISTENCIA EN BACTERIAS GRAM NEGATIVAS Y SU DETECCIÓN POR PCR CONVENCIONAL

Transcripción

1 BETALACTAMASAS COMO MECANISMO DE RESISTENCIA EN BACTERIAS GRAM NEGATIVAS Y SU DETECCIÓN POR PCR CONVENCIONAL SANDRA YAMILE SAAVEDRA ROJAS Bacterióloga UCMC MSc Microbiología UN Laboratorio de Microbiología facultad de Medicina Universidad Nacional de Colombia

2 BETALACTÁMICO Suárez C.(2009). Enferm InfeccMicrobiolClin. 27(2):

3 ETAPAS DE FORMACIÓN DE LA PARED CELULAR Suárez C.(2009). Enferm InfeccMicrobiolClin. 27(2):

4 MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS BETALACTÁMICOS Suárez C.(2009). Enferm InfeccMicrobiolClin. 27(2):

5 MECANISMOS DE RESISTENCIA A BETALACTÁMICOS Betalactamasas Alteración de permeabilidad de la membrana externa (perdida o reducción de porinas). Aumento de bombas de extrusión Modificación de dianas de acción (Mutación en las proteínas de unión a la penicilina). Suárez C.(2009). Enferm InfeccMicrobiolClin. 27(2):

6 BETALACTAMASAS 1. Definición: Enzimas catalíticas que actúan hidrolizando el enlace amídico del anillo betalactámico. 2. Existen dos esquemas de clasificación para las betalactamasas: Clasificación molecular según Ambler Clasificación Funcional según Bush-Jacoby- Medeiros Bush, K. (2010). AAC. 54 (3):

7 ESQUEMAS DE CLASIFICACIÓN DE LAS BETALACTAMASAS AMBLER GRUPO BUSH- JACOBY (2009) SUSTRTO INHIBIDO POR Ac. Clav. EDTA REPRESENTANTE 2a Penicilinas Si No PC-1 2b Penicilinas y cefalosporinas de primera generación Si No TEM-1, TEM-2, SHV-1 2be Cefalosporinas de espectro extendido y monobactámicos Si No TEM-3, SHV-2, CTX-M-15, PER- 2br Penicilinas No No TEM-30, SHV-10 A 2ber Cefalosporinas de espectro extendido y monobactámicos No No TEM-50 2c Carbenicilinas Si No PSE-1, CARB-3 2ce Carbenicilina y cefepime Si No RTG-4 2e Cefalosporinas de espectro extendido (no actúa e sobre monobactámicos) Si No CepA 2f Carbapenemes Variable No KPC, IMI, SME B 3a Carbapenemes No Si IMP, VIM, GIM, SPM, SIM 3b Carbapenemes No Si CAU, GOB, FEZ C 1 Cefalosporinas y cefamicinas No No AmpC, CMY-2, FOX, MIR, ACT, 2d Cloxacilina Variable No OXA-1, OXA-10 D 2de Cefalosporinas de espectro extendido Variable No 0XA-11, OXA-15 2df Carbapenemes Variable No OXA-23, OXA-24, OXA-48 Bush, K. (2010). AAC. 54 (3):

8 BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO Definición: Son enzimas capaces de conferir resistencia a penicilinas, cefalosporinas de primera, segunda y tercera generación y aztreonam (pero no a carbapenémicos y son inhibidas por inhibidores de betalactamasas como acido clavúlanico). Enzimas clase molecular A y D Paterson. (2005). CMR. 18 (4):

9 BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO (BLEE) ENZIMAS CLASE A Enzimas tipo SHV (excepto SHV-1). Enzimas tipo TEM (excepto TEM-1 y TEM-2). Enzimas tipo CTX-M Enzimas BLEE menores tipo PER, GES, VER ENZIMAS CLASE D Enzimas tipo OXA de espectro extendido (OXA-11, OXA-13, OXA-15, OXA-18) Paterson. (2005). CMR. 18 (4): Poirel (2010). AAC. 54: 24-38

10 DETECCIÓN DE BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO 1. Las pruebas fenotípicas solo permiten establecer expresión de enzimas BLEE 2. Detección del tipo especifico de enzima BLEE (evaluar presencia de genes codificantes de estas enzimas como genes: blatem, blashv, blactx-m, blaoxa, blaper). 3. Técnicas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (técnica gold estándar). Paterson. (2005). CMR. 18 (4): Poirel (2010). AAC. 54: 24-38

11 CARBAPENEMASAS 1. Es la familia más versátil de betalactamasas. 2. Carbapenemasas tipo serina de las clases A (KPC, NME, IMI, SME) y D (OXA-23, OXA-24, OXA-58). 3. Carbapenemasas clase B (VIM, IMP, SPM, GIM, SIM). 4. Las carbapenemasas poseen el más amplio perfil de hidrólisis descrito para betalactamasas y puede ser utilizado para la orientación en las pruebas fenotípicas. Poirel (2010). AAC. 54: Nordmann (2009). Lancet Inf Dis. 9:

12 CARBAPENEMASAS Queenan A. (2007). CMR. 20 (3):

13 CARBAPENEMASAS 1. Las pruebas fenotípicas solo permiten establecer expresión de enzimas carbapenemasas tipo A y B y no D. 2. La detección del tipo especifico de enzima carbapenemasa se realiza (evaluando la presencia de genes codificantes de estas enzimas como genes: blakpc, blavim, blaimp,, blaoxa-23, blaoxa-24, blaoxa-58). 3. La reacción en cadena de la polimerasa (técnica gold estándar). Poirel (2010). AAC. 54: Nordmann (2009). Lancet Inf Dis. 9:

14 ENZIMAS AmpC O CEFALOSPORINASAS 1. Se diferencian de las cefalosporinasas clase A por su perfil de inhibición ya que las enzimas AmpC son resistentes a la inhibición por ácido clavulánico y son más activas frente a cefamicinas como cefoxitin. 2. Pueden ser codificadas a nivel de cromosoma o plásmidos. Jacoby (2009). CMR. 22:

15 ENZIMAS AmpC O CEFALOSPORINASAS 1. Codificada cromosomalmente e inducible Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens y Pseudomonas aeruginosa 2. Codificada cromosomalmente no inducible en A. baumannii y E. coli. 3. Adquiridas o plásmidicas (CMY, FOX, ACT, MIR, DHA, MOX) en Klebsiella spp, Salmonella spp y Proteus mirabilis (no poseen AmpC cromosomal). Jacoby (2009). CMR. 22:

16 ENZIMAS AmpC O CEFALOSPORINASAS 1. En E. coli un fenotipo AmpC puede ser sobrexpresión de AmpC cromosomal o presencia de AmpC plásmidica 2. Detección fenotípica no permite determinar las diferentes enzimas AmpC plásmidicas, es necesario realizar técnicas como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). 3. La sobrexpresión del gen AmpC se realiza a través de una PCR-transcriptasa reversa (RT-PCR) en tiempo real. Jacoby (2009). CMR. 22:

17 TÉCNICAS MOLECULARES PARA DETECCIÓN DE BETALACTAMASAS 1. Existen diversas técnicas moleculares para realizar la detección de genes codificantes de betalactamasas siendo el método estándar y convencionalmente utilizado la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del ingles Polimerase Chain Reaction) ya sea la PCR de tipo convencional o la variante PCR en tiempo real. 2. La secuenciación del producto de amplificación (permite la genotipificación de la enzima) estas es la técnica gold standard para conocer la secuencia de aminoácidos de la enzima en estudio

18 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA 1. Síntesis in-vitro de grandes cantidades de un segmento de acido nucleico. 2. El procedimiento requiere: ADN en estudio Dos oligonucleótidos iniciadores específicos (forward y reverse). Polimerasa estable al calor. Desoxirribonucleótidos (dntps) datp, dgtp, dttp, dctp Torres (1995). Elementos. 3: 16-21

19 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) 1. La reacción requiere de ciclos repetidos de tres pasos que incluyen cambios en temperatura : Denaturación del acido nucleico. Alineación Extensión Torres (1995). Elementos. 3: 16-21

20 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

21 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

22 PCR SIMPLE Y PCR MÚLTIPLEX 1. PCR simple: Se analiza un único segmento de ADN o un único gen en la reacción. 2. PCR Múltiplex: Se analizan diferentes genes en una sola reacción, este tipo de ensayo busca reducir costos. Para su realización se necesita tener en cuenta: Diseño de oligonucleotidos inicidores. Productos de amplificación Torres (1995). Elementos. 3: 16-21

23 EVALUACIÓN DE PRODUCTOS OBTENIDOS EN LA PCR 1. Para la detección de los productos obtenidos en la PCR (amplímeros) en una PCR convencional son evaluados por electroforesis en geles de agarosa y visualizados a través de tinciones como bromuro de etidio o SYBR GREEN 2. Pero también se pueden evaluar por hibridización utilizando sondas especificas (técnica Hyplex).

24 EJEMPLO DE PCR SIMPLE CONVENCIONAL A continuación se muestra un ejemplo de una PCR simple para la detección del gen blakpc en aislamientos de Klebsiella pneumoniae resistentes a carbapenémicos, positivos para la prueba de Hodge y negativos para prueba fenotípica de metaloenzimas

25 EJEMPLO DE PCR SIMPLE CONVENCIONAL INICIADOR SECUENCIA 5 3 TAMAÑO ESPERADO DEL AMPLIMERO blakpc F blakpc R 5 ATG TCA CTG TAT CGC CGT CT TTT 3 5 TCA GAG CCT TAC TGC CC pb Bradford (2004). Clin Inf Dis. 39: 55-60

26 EJEMPLO DE PCR SIMPLE CONVENCIONAL Foto Laboratorio de Microbiología Universidad Nacional de Colombia M: Marcador de peso molecular 1 Kb Invitrogen 1 a 7: Muestras positivas para el gen blakpc CN: Control negativo

27 REPORTE DE PCR SIMPLE CONVENCIONAL El resultado que reportamos es aislamientos de K. pneumoniae positivos para el gen blakpc sin establecer la variante de la enzima que poseen estos aislamientos, para esto es necesario realizar una reacción de secuenciación del producto de amplificación.

28 EJEMPLO DE PCR MÚLTIPLEX CONVENCIONAL A continuación se muestra un ejemplo de una PCR multiplex para detectar los genes codificantes de carbapenemasas tipo OXA en aislamientos de A. baumannii resistentes a carbapenémicos.

29 EJEMPLO DE PCR MÚLTIPLEX CONVENCIONAL NOMBRE DE INICIADOR blaoxa-23-like blaoxa-24-like blaoxa-51-like blaoxa-58-like SECUENCIA DE INICIADORES Forward 5 GAT CGG ATT GGA GAA CCA GA 3 Reverse 5 ATT TCT GAC CGC ATT TCC AT 3 Forward 5 GGT TAG TTG GCC CCC TTA AA 3 Reverse 5 AGT TGA GCG AAA AGG GGA TT 3 Forward 5 TAA TGC TTT GAT CGG CCT TG 3 Reverse 5 TGG ATT GCA CTT CAT CTT GG 3 Forward 5 AAG TAT TGG GGC TTG TGC TG 3 Reverse 5 CCC CTC TGC GCT CTA CAT AC 3 TAMAÑO 501 pb 246 pb 353 pb 599pb Woodford (2006). Int J Antimicrob agents. 27:

30 EJEMPLO DE PCR MÚLTIPLEX CONVENCIONAL Foto tomada de Woodford (2006) Muestra 1: Marcador de peso molecular 1 Kb Invitrogen Muestras 2 7:: Muestras positivas para diferentes genes blaoxa Woodford (2006). Int J Antimicrob agents. 27:

31 REPORTE DE PCR MÚLTIPLEX CONVENCIONAL Aislamientos 2 y 4 positivos para carbapenemasas del subgrupo OXA-23 Like y a la carbapenemasa de ocurrencia natural OXA-51 Like. Aislamiento 3 positivo para carbapenemasas del subgrupo OXA-24 Like y a la carbapenemasa de ocurrencia natural OXA-51 like. Aislamiento 5 y 6 positivo para carbapenemasa de ocurrencia natural OXA-51 like. Aislamiento 7 positivo para carbapenemasa OXA-58 like.

32 CASO 1

33 ENUNCIADO Y PREGUNTA 1 Observe la siguiente tabla que describe los iniciadores utilizados para amplificar genes que codifican enzimas AmpC de tipo plasmidicas y compare los tamaños del amplímero esperado con el resultado visualizado en el gel. en el aislamiento en estudio se obtuvo amplificación utilizando que juego de iniciadores?.

34 OLIGONUCLEOTIDOS INICIADORES PARA AMPLIFICAR GENES AmpC PLASMÍDICOS

35 FOTO. Amplificación de genes AmpC plasmídicos M: Marcador de peso molecular de 1Kb (invitrogen) 1: Aislamiento en estudio CN: Control Negativo

36 RESPUESTA 1 Iniciadores FOX óiniciadores FOX-F y FOX-R

37 PREGUNTAS 2 Como reportaría el resultado observado en el gel?

38 RESPUESTA 2 Aislamiento productor de enzimas AmpC tipo FOX o aislamiento productor de enzimas FOX

39 CASO 2

40 ENUNCIADO Y PREGUNTA 1 Observe la siguiente tabla que describe los iniciadores utilizados para amplificar genes tipo blakpc que codifican enzimas KPC y compare el tamaño del amplimero esperado con los resultados visualizados en el gel. En los aislamientos 1 y 2 como reportaría el resultado?.

41 OLIGONUCLEOTIDOS INICIADORES PARA AMPLIFICAR GENES blakpc

42 FOTO. Amplificación de genes blakpc M: Marcador de peso molecular de 1Kb (invitrogen) CP: Control Positivo CN: Control Negativo 1: Aislamiento 1 del estudio 2: Aislamiento 2 del estudio

43 RESPUESTA 1 Aislamientos productores de enzimas KPC

44 SECUENCIACIÓN 1. Técnica gold estándar para determinar la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN en estudio. 2. Para realizar la secuenciación de ADN es necesario emplear los oligonucleótidos iniciadores (Forward y Reverse) que permitan amplificar y secuenciar el fragmento de ADN de interés. 3. Los análisis de los resultados obtenidos de la secuenciación se realiza con el uso de herramientas bioinformáticas para establecer los nucleótidos y la identidad de la secuencia evaluada (en el caso de un amplímero del gen blakpc posterior a la secuenciación podemos especificar que el aislamiento es portador de la enzima KPC-3).

45 OTRAS TÉCNICAS MOLECULARES PARA IDENTIFICACIÓN DE VARIANTES DE BETALACTAMASAS Sin embargo existen otros métodos que no usan la secuenciación para identificar la variante de las betalactamasas como son: Análisis del polimorfismo del gen amplificado por PCR (PCR-RFLP), Análisis del polimorfismo conformacional de cadenas sencillas de ADN (SSCP por las siglas del inglés: Single Strand Chain Polymorphism). Ensayos de restricción del producto de amplificación Microarreglos