REALPURE SSS KIT. Ref. RBME01 (for 50ml of sample) Ref. RBME02 (for 100ml of sample) Ref. RBME04 (for 300ml of sample) 1. INTRODUCCIÓN 1.

Transcripción

1 12/14 RBME01/RBME02/RBME04 REALPURE SSS KIT Ref. RBME01 (for 50ml of sample) Ref. RBME02 (for 100ml of sample) Ref. RBME04 (for 300ml of sample) Kit Optimizado: Tampón de Lisis RBC reformulado Improved Kit: Reformulated RBC Lysis Buffer 1. INTRODUCCIÓN 1. INTRODUCTION El Kit REALPURE SSS es un método para la extracción de DNA genómico de alta calidad a partir de sangre total o médula ósea de mamíferos, saliva o semen. Es un método rápido, seguro y económico. Su protocolo es escalable permitiendo procesar muestras de diferentes tamaños. En el protocolo se incluye un paso de desproteinización con un novedoso tampón salino evitando el uso de disolventes orgánicos tóxicos como fenol o cloroformo. Este Kit provee de reactivos suficientes para el procesado de 50, 100 y 300ml, (según ref.) de sangre, saliva o semen. La obtención de DNA oscila entre g / ml de sangre total, libre de inhibidores de la PCR y otras reacciones enzimáticas. En el caso de la saliva y semen la obtención de DNA en un mismo individuo presenta una variabilidad intrasujeto, es decir, no existe una cantidad aproximada de DNA / ml ya que puede variar según el momento de la recogida de la muestra, dándose el caso de que no se obtenga una gran cantidad de DNA y no se puedan llevar a cabo aplicaciones posteriores que requieren gran cantidad de DNA. Por ello, se recomienda que cuando se requieran grandes cantidades de DNA, se trabaje con sangre total como material de trabajo. The REALPURE SSS Kit is a method for the extraction of high quality genomic DNA from mammalian whole blood or bone marrow, saliva or semen. It is a fast, save and economical method. Its protocol can be scale allowing to process different size samples. The protocol includes a deproteination step using a new saline buffer, avoiding the use of toxic organic solvents such as phenol or chlorophorm. This Kit provides enough reagents to process 50/100 or 300 ml (depending on ref.) of blood, saliva or semen. The DNA extraction oscillates between g / ml of blood and it is free from PCR inhibitors and other enzymatic reactions. In case of semen and saliva, the DNA obtained from one only person shows an intra-subject variability, this is, there is not an estimated DNA/ ml quantity as it can change depending on the moment of collecting the sample. It may happen that the obtained DNA quantity is not very big and it will not be possible to carry on with later applications which need a big amount of DNA. That is why it is recommended to work with blood when big DNA amounts are needed. 1/8

2 2. COMPONENTES DEL KIT KIT COMPONENTS Tampón de Lisis RBC RBC Lysis Buffer Tampón de Lisis Lysis Buffer Solución de Precipitación de Proteínas Protein Precipitation Solution Ref. Ref. RBME01 (50ml) Ref. RBME02 (100ml) Ref. RBME04 (300ml) E ml 300 ml 900 ml RT E21 50 ml 100 ml 300 ml RT E23 30 ml 60 ml 180 ml RT Tª Equipos y reactivos necesarios no incluidos en el kit: * Isopropanol * Etanol 70 %. * Microtubos de 1.5, 15 o 50 ml * Microcentrifuga o centrífuga clínica * Vortex * Baño de Agua * RNasa para extracciones a partir de saliva o semen Equipment and additional reagents required * Isopropanol * 70 % Ethanol * 1.5, 15 or 50 ml microtubes * Microcentrifuge or clinic centrifuge. * Vortex * Water Bath * RNase for saliva or semen extraction 3. PROTOCOLO GENERAL GENERAL PROCEDURE 3.1 Consideraciones preliminares El protocolo implica los siguientes pasos: 1. Lisis selectiva de los eritrocitos - sólo en extracción a partir de sangre -, las células que contienen el DNA son separadas de los eritrocitos que son lisados. 2. Lisis celular. Las células son lisadas con un detergente aniónico que solubiliza los componentes celulares. 3. Tratamiento con RNAsa - sólo en extracción a partir de saliva o semen Precipitación de proteínas. Se eliminan las proteínas citoplasmáticas y nucleares por precipitación salina. 5. Precipitación del ADN. El ADN genómico se obtiene mediante una precipitación con isopropanol. 6. Hidratación del ADN. El pellet de DNA es disuelto en agua estéril o TE mediante incubación corta a 65ºC o manteniendo en agitación a temperatura ambiente durante toda la noche. La hidratación con TE permite la conservación del ADN durante periodos largos de tiempo. 3.1 Preliminary conditions The protocol implies the following steps: 1. Erythrocyte selective lysis only for extractions from blood -, cells containing DNA are isolated from the erythrocytes, which are lysed. 2. Cell lysis. The cells are lysed with an anionic detergent that solubilizes the cell components. 3. Treatment with RNAse only for extractions from saliva or semen Protein precipitation. Cytoplasm proteins are removed by precipitation. 5. DNA precipitation. The genomic DNA is obtained by a precipitation with isopropanol. 6. DNA hydratation. The DNA pellet is dissolved in sterile water or TE by short incubation at 65ºC or keeps it mixing at room temperature overnight. The hydratation with TE allows the DNA conservation for a long time. 2/8

3 12/14 RBME01/RBME02/RBME Preparaciones preliminares 3.2 Preliminary Preparations Si la Solución de Lisis contiene un precipitado debido a las bajas temperaturas, incubar a 37ºC y mezclar para disolver el precipitado. If the Lysis Solution contains a precipitate due to the low temperatures, incubate at 37ºC and mix to dissolve the precipitate. 3.3 Extracción de ADN a partir de sangre 1. Recoger la sangre en tubos que contengan 15 % EDTA para reducir la degradación del DNA y la coagulación sanguínea, también pueden utilizarse otros anticoagulantes como el citrato de sodio o la heparina. 2. Las muestras frescas pueden conservarse a 4ºC durante un máximo de 5 días. 3. Las muestras congeladas son estables a -80ºC durante dos años. 3.3 DNA extraction from blood 1. Collect blood in tubes containing 15 % EDTA to reduce the DNA degradation and blood coagulation, anticoagulants such as sodium citrate or heparin can also be used. 2. Fresh samples can be stored at 4ºC for a maximum of 5 days. 3. Frozen samples are stable at -80ºC for two years Extracción a partir de muestras de 300 l. (Utilizando Microtubos ml y microcentrifuga) Lisis Celular Precipitación del DNA. 1. Añadir 300 l de sangre (o médula ósea) en un microtubo que contenga 900 l de Solución Lisis de RBC (ref. E20). Mezclar e incubar 1. Traspasar el sobrenadante que contiene el DNA a un microtubo nuevo que contenga 300 l de Isopropanol. durante 10 minutos a Tª ambiente. Invertir el 2. Mezclar por inversión unas 50 veces. tubo varias veces durante la incubación. 3. Centrifugar a x g durante 2 2. Centrifugar durante segundos a x g. Eliminar el sobrenadante con una minutos. El DNA será visible como un pellet blanco. pipeta evitando dañar el pellet visible de células y dejando l de líquido residual. 4. Eliminar el sobrenadante y secar el tubo de forma breve en papel absorbente. Añadir Agitar mediante vortex el microtubo para l de Etanol 70% para lavar el DNA. resuspender el pellet, este proceso ayudará a optimizar la lisis celular en el paso siguiente. 5. Centrifugar a x g durante 1 minuto. Cuidadosamente eliminar el 4. Añadir 300 l de Solución de Lisis (ref. E21) y resuspender mediante pipeta para lisar las células. Es muy importante observar que queda sobrenadante evitando tocar el pellet de DNA. Se puede volver a centrifugar brevemente para recoger las últimas gotas de etanol residual. una solución homogénea sin grupos celulares, se recomienda incubar a 37ºC durante 5 6. Invertir el microtubo en un papel absorbente y dejar secar durante unos 15 minutos. minutos o hasta que se observe la solución Hidratación del DNA. homogénea Precipitación proteica. 1. Añadir 100 l de agua estéril o TE y resuspender con pipeta. 1. Dejar que la muestra se atempere a temperatura ambiente. 2. Incubar a 65ºC durante 1 hora con periódicas agitaciones para ayudar a la dispersión del 2. Añadir 180 l de Solución de Precipitación proteica (ref. E23) al lisado celular. DNA, o incubar durante la noche a temperatura ambiente con ligera agitación. 3. Agitar mediante vortex vigorosamente a máxima velocidad durante segundos. 3. Conservar a 2-8ºC. Para almacenajes largos se recomienda resuspender con TE y conservar a - 4. Centrifugar a xg durante 3-5 minutos. Se formará un precipitado marrón oscuro. Si se observan partículas flotando en el sobrenadante, volver a centrifugar después de incubar 5 minutos en hielo. 20ºC/ -80ºC. 3/8

4 Extraction from 300 l samples. (Using ml microtubes and microcentrifuge) Cell Lysis 1. Add 300 l of whole blood (or bone marrow) to a microtube containing 900 l of RBC Lysis Solution (ref. E20). Mix and incubate for 10 minutes at room temperature. Turn the tube upside down several times during the incubation period. 2. Centrifuge for seconds at x g. Remove the supernatant using a pipette and avoiding damaging the cell visible pellet and leaving l of residual liquid. 3. Vortex the microtube to resuspend the pellet, this process will help to optimize the cell lysis in the following step. 4. Add 300 l of Lysis Solution (ref. E21) and resuspend with pipette to lyse the cells. It is very important to observe that the solution is homogeneous without groups of cells, it is recommended to incubate at 37ºC for 5 minutes or until the solution is homogeneous. Protein precipitation. 1. Cool sample to room temperature Add 180 l of Protein precipitation solution (ref. E23) to the cell lisate. 3. Vortex vigorously at maximum speed for seconds. 4. Centrifuge at x g for 3-5 minutes. A dark brown precipitate will be formed. If there are particles floating in the supernatant centrifuge again once you have incubated in ice for 5 minutes. DNA precipitation. 1. Transfer the supernatant containing the DNA into a new microtube containing 300 l of Isopropanol. 2. Mix turning the tube upside down for about 50 times. 3. Centrifuge at x g for 2 minutes. The DNA will be visible as a white pellet. 4. Remove the supernatant and dry the tube on absorbent paper. Add 300 l of Ethanol 70% to wash the DNA. 5. Centrifuge at xg for 1 minute. Carefully remove the supernatant, avoiding touching the DNA pellet. It can be briefly centrifuged to collect the drops of residual ethanol. 6. Turn the microtube upside down on absorbent paper and leave it to dry for about 15 minutes. DNA Hydratation 1. Add 100 l of sterile water or TE and mix well with pipette. 2. Incubate at 65ºC for 1 hour shaking periodically to help the DNA dispersion, or incubate during the night at room temperature shaking gently Keep it at 2-8ºC. To storage for a long time it is recommended to dissolve it with TE and to keep it at -20ºC/ -80ºC Extracción a partir de muestras de 3 ml (Utilizando Tubos de 15 o 50 ml y centrifugas clínicas) Lisis Celular 1. Añadir 3 ml de sangre (o médula ósea) en un tubo que contenga 9 ml de Solución Lisis de RBC (ref. E20). Mezclar y incubar durante 10 minutos a Tª ambiente. Invertir el tubo varias veces durante la incubación. 2. Centrifugar durante 10 minutos a xg Eliminar el sobrenadante con una pipeta evitando dañar el pellet visible de células y dejando l de líquido residual. 3. Agitar mediante vortex el tubo para resuspender el pellet, este proceso ayudará a optimizar la lisis celular en el paso siguiente. 4. Añadir 3 ml de Solución de Lisis (ref. E21) y resuspender mediante pipeta para lisar las células. Es muy importante observar que queda una solución homogénea sin grupos celulares, se recomienda incubar a 37ºC durante 5 minutos o hasta que se observe la solución homogénea Precipitación proteica. 1. Dejar que la muestra se atempere a la temperatura ambiente. 2. Añadir 1.8 ml de Solución de Precipitación proteica (ref. E23) al lisado celular. 4/8 3. Agitar mediante vortex vigorosamente a máxima velocidad durante segundos. 4. Centrifugar a x g durante 5 minutos. Se formará un precipitado marrón oscuro. Si se observan partículas flotando volver a centrifugar después de incubar 5 minutos en hielo. Precipitación del DNA. 1. Traspasar el sobrenadante que contiene el DNA a un tubo nuevo que contiene 3 ml de Isopropanol. 2. Mezclar por inversión unas 50 veces. 3. Centrifugar a x g durante 3 minutos. El DNA será visible como un pellet blanco. 4. Eliminar el sobrenadante y secar el tubo de forma breve en papel absorbente. Añadir 3 ml de Etanol 70% para lavar el DNA. 5. Centrifugar a x g durante 2 minutos. Cuidadosamente eliminar el sobrenadante evitando tocar el pellet de DNA. Se puede volver a centrifugar brevemente para recoger las últimas gotas de etanol residual. 6. Invertir el microtubo en un papel absorbente y dejar secar durante unos 15 minutos.

5 12/14 RBME01/RBME02/RBME04 Hidratación del DNA. 1. Añadir 250 l de agua estéril o TE y resuspender con pipeta. 2. Incubar a 65ºC durante 1 hora con periódicas agitaciones para ayudar a la dispersión del DNA, o incubar durante toda la noche a temperatura ambiente con ligera agitación. 3. Transferir a un microtubo de 1.5 ml y conservar a 2-8ºC. Para almacenajes largos se recomienda resuspender con TE y conservar a - 20ºC o - 80 ºC Extraction from 3 ml samples (Using Tubes of 15 or 50 ml and clinic centrifuges) Cell Lysis 1. Add 3 ml of whole blood (or bone marrow) to a tube containing 9 ml of RBC Lysis Solution (ref. E20). Mix and incubate for 10 minutes at room temperature. Turn upside down the tube several times during the incubation. 2. Centrifuge for 10 minutes at xg. Remove the supernatant with a pipette avoiding damaging the visible cell pellet and leaving l of residual liquid. 3. Vortex the tube to resuspend the pellet, this process will help to optimize the cell lysis in the following step. 4. Add 3 ml of Lysis Solution (ref. E21) and resuspend with pipette to lyse the cells. It is very important to obtain a homogeneous solution without groups of cells, it is recommended to incubate at 37ºC for 5 minutes until you obtain a homogeneous solution. Protein precipitation. 1. Cool sample to room temperature. 2. Add 1.8 ml of Protein precipitation solution (ref. E23) to the cell lysate. 3. Vortex vigorously at maximum speed for seconds. 4. Centrifuge at x g for 5 minutes. A dark brown precipitate will be formed. If there are particles floating, centrifuge again once you have incubated 5 for minutes in ice. DNA precipitation. 1. Transfer the supernatant, which contains the DNA, into a new tube containing 3 ml of Isopropanol. 2. Mix turning the tube upside down for about 50 times. 3. Centrifuge at x g for 3 minutes. The DNA will be visible as a white pellet. 4. Remove the supernatant and dry briefly the tube on absorbent paper. Add 3 ml of 70% Ethanol for washing the DNA. 5. Centrifuge at x g for 2 minutes. Remove carefully the supernatant avoiding touching the pellet of DNA. It can be briefly centrifuge the last drops of residual ethanol. 6. Turn the tube upside down on an absorbent paper and let it to dry for about 15 minutes. DNA hydratation. 1. Add 250 l of sterile water or TE and dissolve with pipette. 2. Incubate at 65ºC for 1 hour shaking periodically to help DNA dispersion, or incubate overnight at room temperature shaking gently. 3. Transfer to a micro tube of 1.5 ml and keep it at 2-8ºC. To storage for a long time it is recommended to mix well with TE and to keep it at -20ºC or - 80 ºC. 5/8

6 Tabla de volúmenes de reactivos escalados desde 5 l hasta 10 ml Scaled reactive volumes table from 5 l to 10 ml Volumen de sangre Blood Volume Tamaño del Tubo Tube size Tampón de Lisis RBC RBC Lysis Buffer Tampón de Lisis Lysis Buffer Solución de Precipitación de Proteínas Protein Precipitation Solution Isopropanol Isopropanol Etanol 70% 70% Ethanol g de DNA obtenidos g of DNA obtained 5-25 l 50 l 200 l 500 l 1 ml 5 ml 10 ml 1.5 ml 1.5 ml 1.5 ml 2.0 ml 15 ml 50 ml 50 ml 75 l 150 l 600 l 1.5 ml 3 ml 15 ml 30 ml 5-25 l 50 l 200 l 500 l 1 ml 5 ml 10 ml 5-15 l 30 l 120 l 300 l 0.6 ml 3.0ml 6 ml 25 l 50 l 200 l 500 l 1 ml 5 ml 10 ml 25 l 50 l 200 l 500 l 1 ml 5 ml 10 ml Extracción de ADN a partir de muestras de Saliva y Semen DNA extraction from Saliva and Semen samples 1. Las muestras de saliva se han de recoger antes de las comidas: lavarse la boca con agua y esperar unos minutos para recoger la muestra. 2. Tanto las muestras de saliva como las de semen deben ser congeladas hasta su procesamiento, o conservarse a 4º C si van a ser procesadas en menos de 2 horas. 3. Ambos fluidos no requieren el paso de lisis de RBC, por tanto, el protocolo de extracción debe comenzar en el paso 2 de la Lisis Celular, centrifugando la muestra durante 90 segundos a xg en muestras que requieran una microcentrifuga. En el caso de muestras que necesiten centrifuga clínica centrifugar durante 10 min. a x g 4. Eliminar el sobrenadante con pipeta evitando dañar el pellet visible de células y dejando l de líquido residual, en el caso de muestras de pequeño volumen; si se trabaja con muestras de mayor volumen, dejar l de líquido residual. 5. Agitar mediante vortex el microtubo para resuspender el pellet, este proceso ayudará a optimizar la lisis celular en el paso siguiente. 6. Continuar el protocolo exactamente igual que en el caso de la sangre teniendo en cuenta los volúmenes dados en la tabla adjunta. 7. A diferencia de la sangre, la saliva y el semen si necesitan un tratamiento con RNAsa después de la lisis celular. Añadir la cantidad de RNAsa suficiente, invertir el tubo unas 25 veces para mezclar e incubar unos minutos a 37ºC 1. Saliva samples must be collect before the meals, clean the mouth with water and wait minutes to collect the sample. 2. Either saliva or semen samples must be frozen until its processing, or kept at 4º C if they are going to be processed in less than 2 hours. 3. None of the fluids require the RBC lysis step, so the extraction protocol has to begin in step 2 of the Cell lysis, centrifuging the sample for 90 seconds at xg in samples that require a micro centrifuge. In case of samples that need clinic centrifuge, centrifuge for 10 minutes at x g 4. Remove the supernatant with pipette avoiding damaging the visible cell pellet and leaving l of residual liquid, in case of small volume samples, or if you work with bigger volume samples, leave l of residual liquid. 5. Vortex the microtube to resuspend well the pellet, this process will help to optimize cell lysis in the following step. 6. Go on with the protocol exactly the same way as in case of blood, taking into consideration the volumes given in the table. 7. Unlike blood, saliva and semen do need an RNAse treatment after the cell lysis. Add enough RNAse quantity, turn the tube upside down about 25 times to mix up and incubate for minutes at 37ºC 6/8

7 12/14 RBME01/RBME02/RBME Tabla de volúmenes de reactivos escalados desde 100 µl hasta 5 ml Scaled reactive volumes table from 100 l to 5 ml Saliva/ Semen 200 l 400 l 600 l l 1 ml 3 ml 5 ml Tamaño del Tubo Tube size 1.5 ml 1.5 ml 1.5 ml 2.0 ml 15 ml 15 ml 15 ml Tampón de Lisis Lysis Buffer 200 l 400 l 600 l 800 l 1 ml 3 ml 5 ml RNAsa 10mg/ml 10mg/ml RNase 5 l 10 l 15 l 20 l 25 l 75 l 125 l Solución de Precipitación de Proteínas Protein Precipitation 120 l 240 l 360 l 480 l 600 l 1.8 ml 3 ml Solution Isopropanol Isopropanol 200 l 400 l 600 l 800 l 1 ml 3 ml 5 ml Etanol 70% 70% Ethanol 200 l 400 l 600 l 800 l 1 ml 3 ml 5 ml La obtención de ADN es mayor con semen que con saliva. No se indican cantidades estimadas de obtención de ADN puesto que la cantidad de final es variable incluso para un mismo individuo según el momento de la recogida de la muestra. En el caso de muestras de semen esta variabilidad suele ser menor. The obtained DNA quantity is bigger with semen than with saliva. There are not estimated quantities of DNA obtained as the final amount is different even for one single person depending on the moment of collecting the sample. In case of semen samples, this variability is usually lower. 4. GUIA DE PROBLEMAS Y POSIBLES SOLUCIONES TROUBLESHOOTING 1. Lisis incompleta de eritrocitos. Volver a incubar con la solución Lisis de RBC. 2. Presencia de coágulos sanguíneos en la muestra de sangre total. La muestra no fue conservada adecuadamente o fue mezclada inadecuadamente con el EDTA en el tubo de recogida. Extraer el DNA sólo de la porción de muestra no coagulada, evitando transferir coágulos del tubo de recogida. 3. Lisis celular incompleta Debido a que el número de células era demasiado grande para la cantidad de Solución de Lisis utilizada. Añadir más cantidad de la Solución de Lisis Debido a la formación de grumos o grupos de células, esto ocurre cuando las células no son resuspendidas correctamente antes de añadir la Solución de Lisis. Incubar en la solución de Lisis hasta que la solución sea homogénea. 1. Erythrocyte incomplete lysis. Incubate once again with the RBC Lysis Solution. 2. Presence of blood coagulum s in the blood sample. The sample was not kept in a correct way or was mixed up with the EDTA in the collecting tube in a wrong way. Extract DNA only from the non-coagulated portion of blood, avoiding transferring coagulum from the collecting tube. 3. Incomplete cell lysis Due to the fact that the number of cells was too big for the Lysis solution quantity used. Add more Lysis solution Due to the formation of groups of cells, this happens when the cells are not correctly dissolved before adding the Lysis Solution. Incubate in the Lysis solution until the solution is homogeneous. 7/8

8 4. No se produce precipitación proteica Debido a que la muestra no fue suficientemente enfriada previamente a la adición de la Solución de Precipitación Debido a que no se mezcló lo suficientemente con la Solución de Precipitación. Agitar mediante vortex el tiempo indicado Debido a que la velocidad de centrifugación no fue correcta. Para microcentrífugas utilizar la velocidad máxima. Para otras centrifugas, la velocidad debe ser de 2.000xg (que no es equivalente a rpm). Si su centrifuga no alcanza 2.000xg, aumentar el tiempo de centrifugación. 5. Baja rehidratación del DNA Debido a que las muestras no fueron mezcladas durante el paso de rehidratación. Mezclar las muestras periódicamente Debido a que los pellets se secaron en exceso. Aumentar el tiempo de rehidratación. No incubar durante toda la noche a 65ºC. 6. Contaminación proteica en el DNA rehidratado Debido a que se utilizó una muestra demasiado grande. Re-extraer el DNA. 7. Calidad del DNA Se obtiene una relación A 260/280 demasiado alta o demasiado baja. Si la muestra está contaminada con proteínas, el valor que se obtendrá en la relación A 260/280 será menor a 1.6. Por el contrario, si la ratio obtenida es mayor de 2.0, nos indica que la muestra contiene ARN, para eliminarlo se recomienda realizar un tratamiento con RNAsa Otro indicador de la calidad del DNA extraído es que pueda ser digerido con enzimas de restricción o amplificado mediante técnicas de PCR. 8. El DNA obtenido es menor de 50Kb El DNA está degradado debido a una incorrecta recogida de la muestra o un almacenamiento incorrecto del material a utilizar. 9. Baja obtención de DNA Debido a un insuficiente número de células en la muestra inicial - sobretodo en muestras de saliva y semen Debido a que la lisis celular no fue completa. Este paso es muy importante, se ha de prolongar la lisis hasta que la muestra sea homogénea Debido a la presencia de grumos o grupos de células no disueltos después de añadir la Solución de lisis. Es muy importante disolver estos grupos de células previamente a la adición de la Solución de Lisis. 4. The protein precipitation is not produced Due to the sample was not cooled enough before the addition of the Precipitation Solution Due to the sample was not mixed up enough with the Precipitation Solution. Shake with vortex for the indicated time Due to the centrifugation speed was not correct. For microcentrifuges use the maximum speed. For other centrifuges, the speed must be of 2.000xg, (which is not equivalent to rpm). If your centrifuge does not reach xg, increase the centrifugation time. 5. Low DNA rehydrated Due to the samples were not mixed up during the rehydrated step. Mix up the samples periodically Due to the pellets were dried in excess. Increase the rehydrating period. Do not incubate over night at 65ºC. 6. Protein contamination of the rehydrated DNA Due to the fact that the sample used was too big. Re-extract the DNA. 7. DNA quality The relation A 260/280 obtained is too high or too low. If the sample is contaminated with proteins, the value obtained in the A 260/280 will be less than 1.6. Unlike, if the obtained ratio is higher than 2.0, it indicates that the sample contains RNA, for removing it, it is recommended to make a treatment with RNAse Another indicator of the extracted DNA quality is the fact that it can be digested with restriction enzymes or amplified with PCR techniques. 8. The DNA obtained is less than 50Kb The DNA is degraded due to an incorrect sample collection or an incorrect storage of the material that is going to be used. 9. Low DNA obtaining Due to the number of cells in the initial sample was not enough mostly in saliva and semen samples Due to an incomplete cell lysis. This is a very important step, the lysis must continue until the sample is homogeneous Due to the presence of groups of cells that have not been dissolved after the addition of the Lysis solution. It is very important to dissolve these groups of cells before the addition of the Lysis Solution. 8/8