REALPLASMID SPIN MIDI/MAXI PREP KIT

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1 05/10 RBMEPS02 REALPLASMID SPIN MIDI/MAXI PREP KIT Ref. RBMEPS02 20 Preps. 1. INTRODUCCIÓN 1. INTRODUCTION REALPLASMID Spin Midi/Maxiprep Kit provee de un método simple y rápido para aislar ADN plasmídico a partir de cultivos recombinantes de E.coli en un rango de ml utilizando para ello columnas con membranas de fibra de vidrio que unen selectivamente el DNA. Las células bacterianas son recolectadas por centrifugación y sometidas a una lisis alcalina seguido de una absorción del DNA en la membrana de la columna en presencia de sales caotrópicas. Los contaminantes son eliminados por un paso de lavado. Finalmente, el ADN plasmídico unido es eluido con un tampón de elución. Se suministran suficientes reactivos para realizar 20 Midis o Maxis preparaciones de ADN plasmídico a partir de cultivos en un rango de ml, siendo el usuario el que decide con que volumen desea trabajar y siguiendo el mismo protocolo independientemente del volumen de cultivo elegido. Sistema de producción certificado bajo norma ISO REALPLASMID Spin Midi/Maxiprep Kit provides a simple and fast method for isolating plasmid DNA from cultures of recombinant E. coli in a range of ml using glass fiber membrane columns which selectively bounds to DNA. Bacteria cells are collected by centrifugation and submitted to an alkaline lysis followed by absorption of the DNA on the column membrane in presence of chaotropic salts. The contaminants are removed by a washing step. Finally, the bounded plasmid DNA is eluted with an elution buffer. It supplies enough reagents for doing 20 Midis or Maxis preparations of plasmid DNA from cultures in a range of ml, and it s the user who decides which volume he wants to work with and following the same protocol independently of the chosen volume. Production system certified under ISO 1/6

2 2. COMPONENTES DEL KIT KIT COMPONENTS Equipos y reactivos necesarios no incluidos en el kit: * Etanol 100 %. * Microtubos de ml * Centrifuga. Solución de Resuspensión Resuspension Solution Solución de Lisis Lysis Solution Solución de Neutralización / Unión Neutralization/Binding Solution Solución de Lavado Wash Solution Tampón de Elución Elution Buffer RNasa RNase Spin Columnas Spin Columns Tubos de Recogida Collection Tubes Ref. Ref. RBMEPS02 20 preps Equipment and additional reagents required * 100 % Ethanol * ml centrifuge tubes *Centrifuge. Tª EP ml RT EP ml RT EPS ml RT EP08 80 ml RT E13 60 ml RT EP06 20 mg 4ºC RSC02 20 unid. RT R unid. RT 3. PROTOCOLO GENERAL GENERAL PROCEDURE 3.1 Consideraciones preliminares Varios factores pueden influir en la obtención del ADN plasmídico. Estos incluyen el número de copias de vector, el inserto de ADN, la cepa huésped, condiciones de crecimiento y el medio. El uso de cepas huésped que contiene una mutación en el gen Endonucleasa I (end A) son recomendables, tales como JM109, DH5alpha, DH10B, XL1-Blue. Extracción de ADN con cepas que contienen el producto del gen endonucleasa I, tales como HB101 y MC106, pueden producir muestras con trazas de endonucleasas, por tanto, estas cepas deberían evitarse. Si es necesario utilizar estas cepas pónganse en contacto con el servicio técnico del laboratorio REAL en Durviz, s.l.u. que les facilitará un protocolo adicional. 3.1 Preliminary conditions Several factors can interfere in the plasmid DNA obtaining. These includes the number of copies of the vector, the DNA insert, the strain host, the medium and growing conditions The use of host strains that contain a mutation in the Endonuclease I (end A) gene are commendable. Such as JM109, DH5alpha, DH10B, XL1-Blue. DNA extraction from strains that contain the product of the endonuclease I gene, such as HB101 and MC106, can produce samples with traces of endonucleases, for this reason, these strains should be avoided. If it is necessary to use these strains contact REAL Laboratory Technical Service in Durviz, s.l.u, and we ll supply you with an additional protocol. 2/6

3 05/10 RBMEPS Preparaciones preliminares ATENCION: La Solución Neutralización/ Unión EPS03 contiene guanidine hydrochloride que es un agente irritante, por lo que se recomienda el uso de guantes y gafas de seguridad para su manipulación La Solución de Resuspensión EP01 ya contiene RNasa. El kit incluye un vial extra de RNasa (EP06) para aquellos usuarios en los que se hace necesaria una mayor cantidad de esta enzima para obtener un plasmídico libre de contaminaciones de RNA. Así, en caso de ser necesario, disolver el polvo de RNasa en la solución de resuspensión, luego almacenar a 4ºC. Esta solución así preparada es estable durante 6 meses. Verificar que la Solución de Lisis EP02 no tiene SDS precipitado debido a las bajas temperaturas. Si es necesario, disolver el SDS calentando a 37ºC. Añadir 320 ml de Etanol 100 % a la Solución de Lavado (EP08). Mantener el envase bien cerrado para evitar la evaporación del etanol. La elución se puede llevar a cabo a temperatura ambiente aunque el rendimiento puede ser incrementado un 20 % si el Tampón de Elución es calentado a 55ºC. 3.2 Preliminary Preparations ATENTION: The Neutralization/Binding Solution EPS03 contains guanidine hydrochloride that is an irritant agent, it is recommeded to use gloves and glasses. The Resuspension solutions already contain EP01 RNase. The kits includes an extra vial with RNase (EP06) for that customers who need and extra quantity of this enzyme in order to obtain an RNA-free plasmídic DNA. If you need it, dissolved the RNase powder into the Resuspension Solution and then store it at 4ºC, this prepared solution is stable during 6 months Verify that the Lysis Solution EP02 does not contain precipitated SDS due to the low temperatures. If necessary, dissolve the SDS heating at 37ºC. Add 320 ml of 100% Ethanol to the Wash Solution (EP08) Keep the container closed to avoid the evaporation of the ethanol. The elution can be done at room temperature although the yield can be increased a 20 % if the Elution Buffer is heated at 55ºC. 3.3 Protocolo de extracción de ADN plasmídico a partir de cultivos de ml 1. Centrifugar ml de un cultivo overnight de E.coli a 5000 xg durante 10 minutos. Eliminar el sobrenadante por aspiración sin tocar el pellet. Nota: para obtener mejores resultados, comenzar con una única colonia a partir de una placa fresca. Crecer overnight en LB conteniendo la cantidad apropiada de antibiótico a 37ºC con agitación rpm. Medir la absorbancia a 600 nm, utilizar una masa celular total de 300. Para calcular el volumen de cultivo a utilizar, coger el valor de la masa celular (300) y dividir por la absorbancia del cultivo a 600 nm. Por ejemplo, con un cultivo denso de E.coli con una OD 600 de alrededor 4.0, utilizar 75 ml de cultivo; con un cultivo menos denso, donde OD 600 de alrededor de 2.0, utilizar 150 ml. Para plásmidos de baja copia utilizar una masa celular total de Resuspender el pellet en 7 ml de Solución de Resuspensión EP01 mediante agitación con vortex., asegurándose de la completa resuspensión de las células. Una incompleta resuspensión en este paso producirá un bajo rendimiento de ADN. Utilizar un tubo de centrífuga capaz de soportar altas velocidades. 3. Lisar las células con 7 ml de Solución de Lisis EP02. Suavemente invertir el tubo 8-10 veces hasta que la mezcla aparezca clara y viscosa. No utilizar vortex. Se puede incubar 1-3 minutos, pero nunca más de 3 minutos. 4. Neutralizar añadiendo 10 ml de Solución de Neutralización / Unión EPS03. Suavemente invertir el tubo 8-10 veces. Se recomienda la incubación durante 5 minutos en hielo. 5. Centrifugar a máxima velocidad en una centrifuga durante 10 minutos. Si hubiera partículas flotando en el sobrenadante, volver a centrifugar. 3/6

4 6. Cuidadosamente pasar el sobrenadante a una Spin columna con su tubo de recogida. 7. Centrifugar a 4000 xg en una centrífuga con cabezal oscilante, durante 2 minutos. Sacar la Spin columna del tubo de recogida, eliminar el líquido y volver a colocar la spin columna en el mismo tubo de recogida. 8. Añadir 20 ml de Solución de Lavado en el reservorio de la spin columna. Centrifugar a 4000 xg, en una centrífuga de cabezal oscilante durante 5 minutos. Eliminar el líquido. 9. Centrifugar a 4000 xg durante 3 minutos más para eliminar el etanol residual. 10. Insertar la spin columna en un tubo de 50 ml nuevo. Añadir 1-3 ml de Tampón de elución en el reservorio de la spin columna. Incubar 2 minutos. Se recomienda que el tampón esté a 55ºC. 11. Centrifugar a 4000 xg en una centrífuga con cabezal oscilante durante 3-5 minutos. El tubo contiene ahora el ADN plasmídico. 3.3 Protocol for plasmid DNA extraction from ml cultures 1. Centrifuge ml of an overnight culture of E.coli at 5000 xg for 10 minutes. Remove the supernatant by aspiration without disturbing the pellet. Note: in order to obtain better results, begin with a single colony from a fresh plate. Grow overnight in LB with the appropriate quantity of antibiotic at 37ºC shaking at rpm. Measure the absorbance at 600 nm, use a total cell mass of 300. In order to calculate the culture volume to be used, pick up the value of cell mass (300) and divide by the culture absorbance at 600 nm. For example, for a dense E. coli culture with a OD 600 around 4.0, use 75 ml of culture; with a less dense culture, with OD 600 around 2.0, use 150 ml. For low copy plasmids use a total cell mass of Resuspend the pellet in 7 ml of Resuspension Solution EP01 by vigorous vortexing, assure the complete cell resuspension. An incomplete resuspension in this step will produce a low DNA yield., Use a centrifuge tube that supports high speed. 3. Lyse the cells with 7 ml of Lysis Solution EP02. Carefully invert the tube 8-10 times until de mixture appears clear and viscose. Do no use vortex. It can be incubated for 1-3 minutes, but never for more than 3 minutes. 4. Neutralize with the addition of 10 ml of Neutralization/Binding Solution EPS03. Carefully invert the tube 8-10 times. It is recommended to incubate on ice for 5 minutes. 5. Centrifuge at maximum speed in a centrifuge for 10 minutes. If there were particles floating in the supernatant, centrifuge once more. 6. Carefully pour the supernatant to a MicroSpin column with its collection tube. 7. Centrifuge at 4000 xg in a centrifuge with oscillator headstocke for 2 minutes. Take the spin from the collection tube, remove the liquid and place the spin column back in the same collection tube. 8. Add 20 ml of Wash Solution to the spin column. Centrifuge at 4000 xg in a centrifuge with oscillator haadstocke for 5 minutes. Remove the liquid. 9. Centrifuge at 4000 xg for 3 more minutes to remove the residual ethanol. 10. Insert the spin in a new 50 ml. tube. Add 1-3 ml. of Elution Buffer to the spin reservoir. Incubate for 2 minutes. It is recommended that the buffer is at 55ºC. 11. Centrifuge at 4000 xg in a centrifuge with oscillator haedstocke for 3-5 minutes. The tube contains now the plasmid DNA. 3.4 Protocolo de extracción de ADN plasmídico a partir de cultivos de ml 1. Centrifugar ml de un cultivo overnight de E.coli a 5000 xg durante 10 minutos. Eliminar el sobrenadante por aspiración sin tocar el pellet. Nota: para obtener mejores resultados, comenzar con una única colonia a partir de una placa fresca. Crecer overnight en LB conteniendo la cantidad apropiada de antibiótico a 37ºC con agitación rpm. Medir la absorbancia a 600 nm, utilizar una masa celular total de 300. Para calcular el volumen de cultivo a utilizar, coger el valor de la masa celular (300) y dividir por la absorbancia del cultivo a 600 nm. Por ejemplo, con un cultivo denso de E.coli con una OD 600 de alrededor 4.0, utilizar 75 ml de cultivo; con un cultivo menos denso, donde OD 600 de alrededor de 2.0, utilizar 150 ml. Para plásmidos de baja copia utilizar una masa celular total de Resuspender el pellet en 10 ml de Solución de Resuspensión EP01 mediante agitación con vortex., asegurándose de la completa resuspensión de las células. Una incompleta resuspensión en este paso producirá un bajo rendimiento de ADN. Utilizar un tubo de centrífuga capaz de soportar altas velocidades. 4/6

5 05/10 RBMEPS02 3. Lisar las células con 10 ml de Solución de Lisis EP02. Suavemente invertir el tubo 8-10 veces hasta que la mezcla aparezca clara y viscosa. No utilizar vortex. Se puede incubar 1-3 minutos, pero nunca más de 3 minutos. 4. Neutralizar añadiendo 14 ml de Solución de Neutralización / Unión EPS03. Suavemente invertir el tubo 8-10 veces. Se recomienda la incubación durante 5 minutos en hielo. 5. Centrifugar a máxima velocidad en una centrifuga durante 10 minutos. Si hubiera partículas flotando en el sobrenadante, volver a centrifugar. 6. Cuidadosamente pasar el sobrenadante a una Spin columna con su tubo de recogida. 7. Centrifugar a 4000 xg en una centrífuga con cabezal oscilante, durante 2 minutos. Sacar la Spin columna del tubo de recogida, eliminar el líquido y volver a colocar la spin columna en el mismo tubo de recogida. 8. Añadir 20 ml de Solución de Lavado en el reservorio de la spin columna. Centrifugar a 4000 xg, en una centrífuga de cabezal oscilante durante 5 minutos. Eliminar el líquido. 9. Centrifugar a 4000 xg durante 3 minutos más para eliminar el etanol residual. 10. Insertar la spin columna en un tubo de 50 ml nuevo. Añadir 1-3 ml de Tampón de elución en el reservorio de la spin columna. Incubar 2 minutos. Se recomienda que el tampón esté a 55ºC. 11. Centrifugar a 4000 xg en una centrífuga con cabezal oscilante durante 3-5 minutos. El tubo contiene ahora el ADN plasmídico. 3.4 Protocol for plasmid DNA extraction from ml cultures 1. Centrifuge ml of an overnight culture of E.coli at 5000 xg for 10 minutes. Remove the supernatant by aspiration without disturbing the pellet. Note: in order to obtain better results, begin with a single colony from a fresh plate. Grow overnight in LB with the appropriate quantity of antibiotic at 37ºC shaking at rpm. Measure the absorbance at 600 nm, use a total cell mass of 300. In order to calculate the culture volume to be used, pick up the value of cell mass (300) and divide by the culture absorbance at 600 nm. For example, for a dense E. coli culture with a OD 600 around 4.0, use 75 ml of culture; with a less dense culture, with OD 600 around 2.0, use 150 ml. For low copy plasmids use a total cell mass of Resuspend the pellet in10 ml of Resuspension Solution EP01 by vigorous vortexing, assure the complete cell resuspension. An incomplete resuspension in this step will produce a low DNA yield., Use a centrifuge tube that supports high speed. 3. Lyse the cells with 10 ml of Lysis Solution EP02. Carefully invert the tube 8-10 times until de mixture appears clear and viscose. Do no use vortex. It can be incubated for 1-3 minutes, but never for more than 3 minutes. 4. Neutralize with the addition of 14 ml of Neutralization/Binding Solution EPS03. Carefully invert the tube 8-10 times. It is recommended to incubate on ice for 5 minutes. 5. Centrifuge at maximum speed in a centrifuge for 10 minutes. If there were particles floating in the supernatant, centrifuge once more. 6. Carefully pour the supernatant to a MicroSpin column with its collection tube. 7. Centrifuge at 4000 xg in a centrifuge with oscillator headstocke for 2 minutes. Take the spin from the collection tube, remove the liquid and place the spin column back in the same collection tube. 8. Add 20 ml of Wash Solution to the spin column. Centrifuge at 4000 xg in a centrifuge with oscillator haadstocke for 5 minutes. Remove the liquid. 9. Centrifuge at 4000 xg for 3 more minutes to remove the residual ethanol. 10. Insert the spin in a new 50 ml. tube. Add 1-3 ml. of Elution Buffer to the spin reservoir. Incubate for 2 minutes. It is recommended that the buffer is at 55ºC. 11. Centrifuge at 4000 xg in a centrifuge with oscillator haedstocke for 3-5 minutes. The tube contains now the plasmid DNA. 5/6

6 4. GUIA DE PROBLEMAS Y POSIBLES SOLUCIONES TROUBLESHOOTING Recomendamos ponerse en contacto con el servicio técnico del laboratorio REAL en Durviz s.l.u. para cualquier consulta adicional respecto a los protocolos de trabajo o problemas que puedan surgir durante el trabajo. We recommend contact with REAL laboratory technical service at Durviz s.l.u. for any additional question regarding the work protocols or any problems you may have during work. 6/6