REAL TOTAL RNA FROM TISSUES AND CELLS STAR KIT

Transcripción

1 10/10 RBMER02 REAL TOTAL RNA FROM TISSUES AND CELLS STAR KIT Ref. RBMER02 1. INTRODUCCIÓN 1. INTRODUCTION Este kit permite la obtención de ARN total a partir de muestras de tejidos y células, sin la utilización de reactivos tóxicos. Este kit está especialmente diseñado para aplicaciones que requieran la eliminación del ADN contaminante que, casi inevitablemente, se purifica junto con el ARN. El procedimiento incluye una lisis celular seguida de una precipitación de las proteínas y parte del ADN genómico. Luego mediante una precipitación con isopropanol se obtiene el ARN total que finalmente es rehidratado. Posteriormente se realiza un tratamiento para la eliminación del ADN contaminante. El REAL TOTAL ARN de Tejidos y Células STAR Kit permite la extracción de ARN total a partir de 50 muestras de 20 mg de tejido, o 50 muestras de 3 x 10 6 células. Además incluye un kit completo de REALSTAR (ref. RBMER10) con todos los reactivos necesarios para la eliminación del ADN contaminante e inactivación y eliminación de la DNasa I. Si el RNA extraído ha de ser utilizado en ensayos de RT-PCR, se recomienda utilizar cantidades pequeñas de muestra, en un rango de 1x10 6 células o 10 mg de tejido. This kit allows the isolation of DNA-free Total RNA from tissues and cells samples without using toxic reagents. This kit is specially design for applications that require the removal of contaminant DNA which is purified together with the RNA. The process includes a cell lysis followed by the precipitation of the proteins and part of the genomic DNA. After a later precipitation with isopropanol the total RNA is obtained, which is finally rehydrated. A later treatment for removing the contaminant DNA is done. REAL Total RNA from Tissues and Cells Star Kit allows the extraction of total RNA from 50 tissue samples of 20mg tissue, or 100 samples of 3 x 10 6 cells. It also includes a REALSTAR (ref. RBMER10) complete kit with all the necessary reagents for removing the contaminant DNA and for the DNase I inactivation. If the extracted RNA must be used in RT-PCR assays, the use of small sample quantities (1x10 6 cells or 10 mg of tissue) is recommended. Sistema de producción certificado bajo norma ISO Production system certified under ISO 1/10

2 2. COMPONENTES DEL KIT KIT COMPONENTS REAL STAR KIT Solución de Lisis ARN RNA Lysis Solution Solución de Precipitación Proteínas ARN RNA Protein Precipitation Solution Solución de Rehidratación ARN RNA Rehydratation Solution Solución de Inactivación de DNasa I DNase I Inactivation Buffer DNasa I libre de RNasas Rnase-free DNase I Tampón de Reacción DNasa 10x DNase Reaction Buffer 10x Agua libre de Nucleasas Nuclease-free Water Ref. Ref. RBMER02 Tª ER01 30 ml RT ER02 10 ml RT ER03 5 ml 4ºC ER µl 4ºC ER µl -20ºC ER µl -20ºC ER13 1 ml 4ºC Equipos y reactivos necesarios no incluidos en el kit: * Isopropanol * Etanol 70%. * Nitrógeno Líquido /Homogeneizador Eléctrico * Glucógeno (20mg/ml) (para muestras con un bajo número de células) * Microtubos de 1.5 ml libres de RNasas Equipment and additional reagents required * Isopropanol * 70 % Ethanol * Liquid Nitrogen / Electric Homogeneizator * Glucogen (20mg/ml) (for low number of cells samples) * RNase-free microtubes 3. PROTOCOLO GENERAL GENERAL PROCEDURE 3.1 Consideraciones preliminares 3.1 Preliminary conditions Las RNasas se encuentran tanto en organismos procariotas como en eucariotas, y prácticamente en todos los tipos celulares. La principal fuente de RNasas son los microorganismos (bacterias, hongos y sus esporas) y sus derivados (enzimas de restricción, polimerasas, etc.). Por tanto, en un laboratorio de Biología Molecular pueden estar presentes en numerosos lugares y es conveniente tener en cuenta una serie de precauciones básicas como: 1. Utilizar guantes para prevenir la contaminación de las RNasas presentes en las manos. 2. Cambiar frecuentemente de guantes. 3. Disponer de un juego de pipetas para trabajar exclusivamente con ARN. 4. Utilizar tubos y pipetas que estén garantizados libres de RNasas. 5. Utilizar reactivos y compuestos químicos libres de RNasas. 6. Utilizar una zona exclusiva en el laboratorio donde trabajar con ARN. 2/10 RNases exist in prokaryotes as well as in eukaryotes organisms, and almost in every cell type. The main RNases sources are microorganisms (bacteria, fungi and its spores) and their products (restriction enzymes, polimerases, etc.). For such reason, they can be present in a Molecular Biology laboratory, in many different places and it s convenient to be careful with the following recommendations: 1. Use gloves to prevent contamination by the RNases present in the hands. 2. Change frequently your gloves. 3. Have pipettes for working exclusively with RNA. 4. Use RNase-free tubes and tips. 5. Use RNase-free reagents. 6. Have a determined area in the lab to work with RNA.

3 10/10 RBMER02 La obtención de ARN intacto es el principal y a menudo el paso más crítico para desarrollar algunos experimentos de Biología Molecular, incluyendo Northern, RT-PCR, ensayos de protección de la nucleasa, mapaje de ARN, traducción in vitro y construcción de genotecas de ADNc. Con el fin de aumentar la eficacia y productividad del método de purificación empleado, es conveniente: 1. Encontrar el método apropiado de lisis del tejido o células del material inicial, es importante para maximizar el rendimiento y calidad de la preparación de ARN. Durante este proceso es crucial que el agente desnaturalizante esté en contacto con el contenido celular para poder inactivar las RNasas endógenas de la propia muestra. 2. La lisis celular ha de ser rápida, en caso contrario, se puede producir la degradación del ARN por las RNasas endógenas. Una lisis pobre puede llevar a una baja obtención de ARN debido a que el ARN de la muestra permanecerá atrapado en las células intactas, y por tanto, no estará disponible para ser aislado. 3. Para aquellos tejidos difíciles de lisar, una solución es congelarlos y pulverizarlos con nitrógeno líquido y un mortero hasta conseguir un polvo fino; seguidamente se realizará una homogeneización mecánica en la solución de lisis. 4. Se recomienda congelar las muestras en los siguientes casos: Cuando se dispone de cantidad de muestras que no pueden ser procesadas simultáneamente. Cuando las muestras son recogidas fuera del laboratorio. Cuando se trata de muestras en las cuales el proceso mecánico no produce una lisis completa. 5. Los métodos de lisis celular son normalmente mecánicos o enzimáticos. Los métodos mecánicos se utilizan en tejidos frescos, y son los más efectivos, como por ejemplo, la homogeneización con un Dounce o homogenizador mecánico (tipo polytron). 6. Es Importante mantener el tejido siempre fresco y procesarlo rápidamente dentro de los 30 minutos después de su disección. 7. No mantener nunca las muestras en la solución de lisis sin llevar a cabo la homogeneización Intact RNA isolation is the most critical step to develop certain Molecular Biology experiments, including Northern, RT-PCR, nuclease protection assays, RNA mapping, in vitro transcription and cdna gene library construction. In order to have a higher productivity and efficiency of the purification method employed, is convenient to: 1. Find the correct method for cells or tissues lysis of the initial sample. It is important to maximize the RNA preparation yield and quality. During this process, is very important for efficient preparation that all the RNA contained in the sample is released from the cells by disruption and homogenization. 2. The cell lysis must be quick to prevent the degradation of the RNA by the endogen RNases. A bad lysis can lead to a low RNA collection due to the fact that the RNA will be kept inside the untouched cells, and it will not be possible to isolate it. 3. For those tissues which are difficult to lysate, a solution is grinding with a pestle and mortar the sample to a fine powder in the presence of liquid nitrogen. After this make a mechanical homogenization in the lysis solution. 4. It is recommended to freeze the samples in the following cases: When you have an amount of samples that can t be processed simultaneously. When the samples are collected out the lab. When you have a sample in which a mechanical process won t produce a complete lysis. 5. The cell lysis methods are usually enzymatic or mechanic. Mechanic methods are used with fresh tissues, and are the most effective, as for example the homogenization by a Dounce o mechanic homogenizator (polytron). 6. It is important to keep the tissue fresh and process it before 30 minutes after its dissection. 7. Never keep the sample in the lysis solution with out carrying out the homogenization 3/10

4 Qué cantidad de ARN puede ser tratado con el REALSTAR Kit? El protocolo es apropiado para eliminar ADN a partir de soluciones de ARN de µl. De esta manera, es posible eliminar 10 µg/ml de ADN contaminante de soluciones de ARN. De todas maneras, la cantidad de ARN que puede ser tratada en una reacción del REALSTAR depende de la cantidad de ADN contaminante. Así si se van a tratar 10 µg de ARN con una contaminación < 10 µg/ml de ADN, utilizar 1 µl de DNasa I; pero si se trata más cantidad de ARN o la concentración de ADN contaminante es mayor, se deberá utilizar más DNasa I. Por ejemplo, el ARN extraído a partir del bazo, riñón o timo típicamente tiene una elevada contaminación de ADN. Además, el método de extracción también puede afectar la cantidad de ADN presente en una preparación de ARN. El Tampón de Inactivación de la DNasa I puede ser dificultoso de pipetear después de varios usos o puede perder líquido. Si esto sucede, añadir 1 volumen de agua libre de nucleasas (suministrada) igual del % del volumen de lecho que queda de Tampón de Inactivación de la DNasa I. 3.2 Preparaciones preliminares Si la solución de lisis contiene un precipitado debido a las bajas temperaturas, incubar a 37ºC y mezclar para disolver el precipitado. How much RNA quantity can be treated with the REALSTAR Kit? This protocol is suitable to remove DNA from µl RNA in aqueous solutions. It can remove trace to moderate amounts of contaminating DNA (less than 10 µg/ml) to a level undetectable by RT-PCR. The amount of RNA that can be treated in a single REAL STAR reaction depends on the amount of DNA contamination present. This way, if you re going to treat 10 µg of ARN with a DNA contamination < 10 µg/ml ADN, use 1 µl of DNase I; but if it s a higher RNA quantity the contaminant DNA concentration is bigger, you will need to use more DNase I. For example, RNA isolated from spleen, kidney, thymus, typically has significant DNA contamination, for example carry-over of the interphase from organic extractions can cause DNA contamination, as can overloading the silica matrix in solid-phase RNA purification methods. The DNase I Inactivation Buffer may be difficult to pipette after multiples uses due to depletion of fluid from the intersticial spaces. If this happens add 1 volume of nuclease free water (supplied with the kit) equal to approximately the % of the bed volume of the remaining DNase Inactivation Buffer, and vortex thoroughly to recreate a pipettable slurry. 3.2 Preliminary Preparations If the Lysis Solution contains a precipitate due to the low temperatures, incubate at 37ºC and mix to dissolve the precipitate 3.3. Protocolo de extracción de ARN total a partir de 20 mg / 50 mg de tejidos animales 1. Diseccionar la muestra de tejido y rápidamente enfriar en nitrógeno líquido. Conservar a 70ºC o 80ºC. Se puede utilizar directamente el tejido fresco para la extracción, en este caso, trabajar rápidamente y mantener el tejido en hielo todo el tiempo. 2. Añadir 20 mg / 50 mg de tejido congelado pulverizado con nitrógeno líquido o de tejido fresco a 600 µl / 1.5 ml de Solución de Lisis. NOTA: Es esencial para una preparación de ARN eficiente que todo el ARN que contiene la muestra sea liberado de las células durante el proceso de homogeneización, al utilizar un homogeneizador mecánico, mantener el rotor sumergido con el fin de que no se forme mucha espuma. Para tejidos frescos y blandos se recomienda utilizar el homogenizador; para los tejidos frescos duros o ricos en RNasas, pulverizar con Nitrógeno líquido. De la misma manera, se recomienda, utilizar homogeneizador en el caso de tejidos congelados blandos o pequeñas piezas y para todos los demás tejidos congelados se aconseja pulverizar con Nitrógeno líquido. 3. Incubar durante 5-10 minutos a Tª ambiente. Para 50 mg pasar la muestra a un tubo de centrifuga Oak Ridge o similar que soporte velocidades elevadas. 4. Añadir 200 µl / 500 µl de Solución Precipitación de Proteínas al lisado. Invertir el tubo 10 veces e incubar en hielo durante 10 minutos. 5. Centrifugar a xg durante 5 minutos. El precipitado proteico formará un pellet. 6. Recoger el sobrenadante, que contiene el ARN, en un nuevo tubo que contenga 600 µl / 1.5 ml de Isopropanol. Mezclar por inversión varias veces. 4/10

5 10/10 RBMER02 7. Centrifugar a xg durante 3-5 minutos. 8. Eliminar el sobrenadante. Añadir 600 µl / 1.5 ml de Etanol 70% e invertir varias veces para lavar el pellet de ARN. 9. Centrifugar a xg durante 2 minutos. Cuidadosamente, pues el pellet puede perderse fácilmente, eliminar todo el etanol. 10. Invertir el tubo y dejar secar en papel absorbente durante 15 minutos. 11. Añadir 100 µl / 250 µl de Solución de Rehidratación. Pipetear para resuspender el pellet. 12. Permitir la rehidratación del ARN al menos durante 30 minutos en hielo. Pipetear para resuspender el pellet. 13. Conservar las muestras a 70ºC. NOTA: Para procesar muestras de mayor tamaño, ver la tabla adjunta con los reactivos escalados según el tamaño de la muestra y proceder como el protocolo descrito aplicando las cantidades correspondientes Eliminación del ADN contaminante Procesar el 10-50% del ARN total obtenido siguiendo el protocolo del REALSTAR: 1. Añadir 0.1 volúmenes del Tampón de Reacción 10x y 1 µl de DNasa I (2 U) al ARN. Mezclar suavemente e incubar a 37ºC durante minutos. En algunos casos, las siguientes modificaciones pueden mejorar la eficiencia de eliminación de ADN: a) Diluir las muestras viscosas 2 ó 3 veces con Tampón de Reacción 1x b) Para muestras muy contaminadas, diluir la muestra a 0.5 mg/ml de ácido nucleico antes del tratamiento con DNasa, y utilizar 2 ó 3 µl de DNasa I y/o extender el periodo de incubación a 1 hora. Si se utiliza más de 2 µl de DNasa I, incrementar la cantidad de Tampón de Inactivación de la DNasa utilizado en el punto 2, de 0.1 a 0.2 volúmenes. 2. Resuspender el Tampón de Inactivación de la DNasa mediante agitación suave. Añadir 0.1 volúmenes de la resina bien homogenada a la muestra (si el volumen de la reacción es inferior a 50µl, añadir 5µl de la resina). Si se utilizaron 2 µl de DNasa I, añadir 0.2 volúmenes de resina. Mezclar bien. Por ejemplo, si el volumen de la muestra es 50 µl, y en el punto 1 se utilizó 1 µl de DNasa I, añadir 5 µl del Tampón de Inactivación resuspendido. IMPORTANTE para una eficiente eliminación del ADN y los cationes divalentes, es importante utilizar una alicuota de Tampón de Inactivación que no contenga demasiado fluido. Se ha de actuar rápidamente una vez se ha resuspendido el Tampón de Inactivación, insertar la punta de la pipeta por debajo de la superficie y pipetear arriba y abajo varias veces, observar que la alicuota tomada es blanca, sin ninguna cantidad de líquido transparente. Si es necesario, agitar bien el reactivo entre muestras para asegurar la total homogeneización de las partículas. 3. Incubar el tubo 2 minutos a temperatura ambiente. Agitar el tubo varias veces durante el periodo de incubación para redispersar las partículas del Tampón de Inactivación. 4. Centrifugar el tubo a xg durante 1 minuto para precipitar el Tampón de Inactivación. Por lo general no es necesario eliminar la solución de ARN de esta solución centrifugada, si el periodo de almacenamiento es corto. Si lo que se quiere es almacenar al ARN por un periodo largo, se recomienda traspasar la solución que contiene el ARN a un nuevo tubo. Si se mantiene el Tampón de Inactivación en el tubo, no se ha de tocar ni remover cuando se saquen alicuotas de ARN. Si es necesario, centrifugar brevemente para obtener un pellet firme. Recomendamos no introducir partículas de Tampón de Inactivación en la reacción de PCR 5/10

6 3.3. Protocol for extraction of Total RNA from 20 mg / 50 mg of animal tissue 1. Dissect the tissue sample and quickly freeze in liquid nitrogen. Store at 70ºC or 80ºC. You can directly use the fresh tissue for the extraction, in such case, work quickly and keep the tissue on ice during whole process. 2. Add 20 mg / 50 mg frozen ground tissue with liquid nitrogen- or fresh tissue to 600µl / 1.5 ml of Lysis Solution. NOTE: It is very important for an efficient RNA preparation that all the RNA of the sample is released from the cells during the homogenization process. If you use a mechanic homogenizator, keep the rotor immerse to avoid foam. The homogenizator is recommended for fresh and soft tissues; for fresh hard or rich in RNases tissues ground with liquid nitrogen. In the same way, it is recommended to use a homogenizator for frozen soft tissues or small pieces and for the rest of samples frozen ground with liquid nitrogen. 3. Incubate for 5-10 minutes at room temperature. For 50 mg place the sample in a centrifuge tube Oak Ridge or other tube rated for high speed. 4. Add 200 µl / 500 µl of Protein Precipitation Solution to the cell lysate. Invert tube gently 10 times and incubate on ice for 10 minutes. 5. Centrifuge at xg for 5 minutes. The protein precipitate will form a tight pellet. 6. Put the supernatant containing the RNA, in a new tube containing 600 µl / 1.5 ml of Isopropanol. Mix by turning the tube upside down several times. 7. Centrifuge at xg for 3-5 minutes. 8. Remove the supernatant. Add 600 µl / 1.5 ml of 70% Ethanol and invert several times to wash the RNA pellet 9. Centrifuge at xg for 2 minutes. Carefully, avoiding losing the pellet, remove all the ethanol. 10. Invert and drain the tube on absorbent paper and allow to air dry for 15 minutes 11. Add 100 µl / 250 µl of Rehydratation Solution. Use the pipettor for resuspending the pellet. 12. Allow RNA to rehydratate on ice at least 30 minutes. Use the pipettor o vortex for resuspending the pellet. 13. Store the samples at 70ºC. If the obtained RNA is going to be used in RT-PCR assays, for removing the possible contaminant DNA, it is recommended to use the REAL Total RNA from Tissues and Cells STAR kit (ref. RBMER02) or the REALSTAR kit (Ref. RBMER10), starting form small samples quantities, in a range of 1x10 6 cells or 10 mg of tissue. False positives due to contaminant genomic DNA in a RT-PCR can be identified with a no reverse transcription control during the RT-PCR assay. The problem can also be minimized with the design of primers which are located at least inside an intron of the genomic sequence. This way, the PCR product obtained from contaminant DNA will be bigger than the one generated from the cdna. NOTE: To process bigger size samples, see table below with the reagents scaled volumes according to the sample size and proceed as said in the protocol using the correct quantities Removal of contaminated DNA Process the 10-50% of the obtained total RNA following the protocol for the REALSTAR: 1. Add 0.1 volumes of 10x Reaction Buffer and 1 µl of DNase I (2 U) to the RNA. Mix carefully and incubate at 37ºC for minutes. In some cases, the following modifications may improve the efficiency of DNA removal: a) Dilute the viscous samples 2 o 3 times with 1x Reaction Buffer. b) In case of very contaminated samples, dilute the sample at 0.5 mg/ml of nucleic acid before the DNase treatment and use 2 or 3 µl of DNase I and/or extend the incubation period to 1 hour. If you use more than 2 µl de DNase I, increase the 6/10 DNase Inactivation Buffer quantity used in step 2, in 0.1 to 0.2 volumes. 2. Resuspend the DNase Inactivation Buffer by flicking or vortexing the tube. Add 0.1 or 5µl, whichever is greater, of the slurry to the sample. If you used 2 µl of DNase I, add 0.2 volumes of slurry. Mix well. If for example the sample volume is 50 µl, and 1 µl of DNase I was used in step 1, add 5 µl of the resuspended Inactivation Buffer. IMPORTANT for an efficient removal of the DNA and divalent cations, it s important to use an aliquote of Inactivation Buffer that does not contain too much fluid. When pipeting the Inactivation Buffer, insert the pipette tip well below the surface an d observe the aliquot withdraw to ensure that it is mostly white,

7 10/10 RBMER02 without a significant amount of clear fluid. If necessary, re-vortex the reagent between samples occasionally to resuspend the particles. 3. Incubate the tube for 2 minutes at room temperature. Flick the tube several times during the incubation period to redisperse the particles in the Inactivation Buffer. 4. Centrifuge the tube at xg for 1 minute to precipitate the Inactivation Buffer. Generally it s not necessary to remove the RNA solution from the pelleted DNase I Inactivation Buffer for short term storage. For long term storage of RNA, however, we recommend removing the RNA to a new tube. If the DNase I Inactivation Buffer is left in the tube, it can be left undisturbed when removing aliquots of RNA. If necessary, centrifuge briefly to make a tighter pellet. Although we have not seen any inhibition of RT-PCR in the presence of deliberately carried-over DNase I Inactivation Buffer, we recommend avoiding introduction of the DNase I Inactivation Buffer into PCR Tabla de volúmenes de reactivos escalados a partir de 5 mg hasta 100 mg Reagents scaled volume from 5mg up to 100mg Cantidad tejido Tissue Quantity Tamaño tubo Tube Size Solución de Lisis Lysis Solution Solución.Precipitación Proteínas Protein Precipitation Solution Isopropanol 100% 100% Isopropanol Solución Hidratación Hydratation Solution 5-10 mg mg 25 mg mg 1.5 ml 1.5 ml 2.0 ml 15 ml 0.3 ml 0.6 ml 0.75 ml 1.5 ml 0.10 ml 0.20 ml 0.25 ml 0.50 ml 0.3 ml 0.6 ml 0.75 ml 1.5 ml 50 µl 100 µl 150 µl 300 µl 3.4. Protocolo de extracción de ARN total a partir de 3-5 millones / millones de células en cultivo Las células cultivadas en monocapa en placas o frascos de cultivo pueden ser lisadas directamente en la placa o frasco, para ello aspirar el medio de cultivo, opcionalmente lavar con PBS, y finalmente añadir el volumen de Solución de Lisis correspondiente. Mover la placa o frasco y arrastrar las células lisadas con la ayuda de una pipeta. Para las células cultivadas en suspensión se procede directamente con el protocolo. No se recomienda procesar pellets congelados de células. 1. Añadir directamente 3-5 millones de células en PBS o medio de cultivo a un microtubo de 1.5 ml. O añadir 10 millones de células directamente a un tubo de centrifuga Oak Ridge o similar que soporte velocidades elevadas. 2. Centrifugar a xg durante 5 segundos / 1 minuto para precipitar las células. Eliminar el 7/10 sobrenadante dejando µl / µl de líquido residual para facilitar la posterior lisis. 3. Agitar vigorosamente para resuspender las células en el sobrenadante residual. Es muy importante asegurarse de la completa disolución del pellet celular. 4. Añadir 600 µl / 1.5 ml de Solución de Lisis. Pipetear unas 3 veces para lisar las células. 5. Añadir 200 µl / 500 µl de Solución Precipitación de Proteínas al lisado. Invertir el tubo 10 veces e incubar en hielo durante 10 minutos. 6. Centrifugar a xg durante 5 minutos. El precipitado proteico formará un pellet. 7. Recoger el sobrenadante, que contiene el ARN, en un nuevo tubo que contenga 600 µl / 1.5 ml de Isopropanol. Mezclar por inversión varias veces. NOTA: Para muestras menores de

8 células, utilizar glucógeno (20 mg/ml) como carrier en la precipitación. Añadir 0.5 µl glucógeno / 300 µl de isopropanol. 8. Centrifugar a xg durante 3-5 minutos. 9. Eliminar el sobrenadante. Añadir 600 µl / 1.5ml de Etanol 70% e invertir varias veces para lavar el pellet de ARN. 10. Centrifugar a xg durante 2 minutos. Cuidadosamente, pues el pellet puede perderse fácilmente, eliminar todo el etanol. 11. Invertir el tubo y dejar secar en papel absorvente durante 15 minutos. 12. Añadir 100 µl / 200 µl de Solución de Rehidratación. Pipetear para resuspender el pellet. 13. Permitir la rehidratación del ARN al menos durante 30 minutos en hielo. Pipetear para resuspender el pellet. 14. Conservar las muestras a 70ºC. Si el RNA obtenido va a ser utilizado en ensayos de RT-PCR se recomienda la utilización del kit REAL ARN total de tejidos y células STAR kit (ref. RBMER02) o del REALSTAR kit (Ref. RBMER10), partiendo de cantidades pequeñas de muestra, en un rango de 1x10 6 células o 10 mg de tejido. Los falsos positivos debidos al ADN genómico contaminante en una RT-PCR pueden ser identificados realizando un control de no transcripción inversa durante el ensayo de RT- PCR. El problema también puede ser minimizado con el diseño de primers que se sitúen al menos dentro de un intrón de la secuencia genómica, de esta forma, el producto de PCR obtenido a partir de AND contaminante será mayor que el generado a partir del cdna. NOTA: Para procesar muestras de diferente tamaño, ver la tabla adjunta con los reactivos escalados según el tamaño de la muestra y proceder como el protocolo descrito aplicando las cantidades correspondientes Eliminación del ADN contaminante Procesar el 10-50% del ARN total obtenido mediante el protocolo del REALSTAR (Ver punto 3.3.1) 3.4. Protocol for extraction of Total RNA from 3-5 millions / millions of cultured cells The cells which have been grown in one layer on plates or culture flasks can be directly lysated on the plate or flask, so, aspirate de culture medium, optionally wash with PBS, and finally add the suitable Lysis Solution volume. Move the plate o flask and pull with a pipettor. For cells cultivated in suspension proceed directly with the protocol. It s not convenient to process frozen cell pellets. 1. Add directly 3-5 millions of cells in PBS or culture medium to a 1.5 ml. microtube. Or add 10 millions of cells directly into an Oak Ridge or other tube rated for high speed. 2. Centrifuge at xg for 5 seconds / 1minute to pellet cells. Remove the supernatant leaving µl / µl of residual liquid to ease the following lysis. 3. Shake vigorously to resuspend the cells in the residual supernatant. It is very important to assure the complete cell pellet resuspension. 4. Add 600 µl / 1.5 ml of Lysis Solution. Use the pipettor 3 times to lyse the cells. 5. Add 200 µl / 500 µl of Protein Precipitation Solution the lysate. Invert the tube 10 times and incubate in ice for 10 minutes. 6. Centrifuge at xg for 5 minutes. The protein precipitate will form a tight pellet. 7. Pour the supernatant containing the RNA in a new tube containing 600 µl / 1.5 ml of Isopropanol. Mix by inversion several times. NOTE: For samples with less than cells, use glucogen (20 mg/ml) as carrier in the precipitation. Add 0.5 µl glucogen / 300 µl isopropanol. 8. Centrifuge at xg for 3-5 minutes. 9. Remove the supernatant. Add 600 µl / 1.5 ml of 70% Ethanol and invert the tube several times to wash the RNA pellet. 10. Centrifuge at xg for 2 minutes. Do it carefully, for the pellet can be easily lost, remove all the ethanol. 11. Invert and drain the tube on absorbent paper and allow to air dry for 15 minutes 12. Add 100 µl / 200 µl of Rehydratation Solution. Use the pipettor for resuspending the pellet. 13. Allow RNA to rehydratate on ice at least 30 minutes. Use the pipettor o vortex for resuspending the pellet. 14. Store the samples at 70ºC. If the obtained DNA is going to be used in RT- PCR assays, the use of the REAL total RNA from tissues and cells STAR kit (ref. RBMER02) or REALSTAR kit (Ref. RBMER10), starting from small sample quantities (1x10 6 cells or 10 mg tissue) is recommended. False positives due to contaminant DNA in a RT-PCR can be identified by a non reverse transcription control during the RT-PCR assay. The problem can also be minimized with the design of primers that are located at least in one of the introns of the genomic sequence. This way, the obtained PCR product from contaminant DNA will be higher than the one generated from the cdna. 8/10

9 10/10 RBMER02 NOTE: To process different size samples, see table below with the reagents scaled volumes according to the sample size and proceed as said in the protocol using the correct quantities Removal of contaminated DNA Process the 10-50% of the total RNA obtained with the REALSTAR protocol (see section 3.3.1) Tabla de volúmenes de reactivos escalados a partir de millones de células Reagents scaled volume from millions of cells Número de células Cells number Tamaño del tubo Tube Size Solución de lisis Lysis Solution Solución de Precipitación de Proteínas Protein Precipitation Solution Isopropanol Isopropanol Solución Hidratación ARN RNA Hydratation Solution millones 3-5 millones 5 millones 10 millones 0.6 ml 1.5 ml 1.5 ml 1.5 ml 1.5 ml 2 ml 15 ml 0.06 ml 0.10 ml 0.15 ml 0.30 ml 0.60 ml 0.75 ml 1.5 ml 0.02 ml ml 0.05 ml 0.10 ml 0.20 ml 0.25 ml 0.50 ml 0.06 ml 0.10 ml 0.15 ml 0.30 ml 0.60 ml 0.75 ml 1.5 ml 10 µl µl µl 50 µl 100 µl 150 µl 200 µl 4. GUIA DE PROBLEMAS Y POSIBLES SOLUCIONES TROUBLESHOOTING Dada la gran variedad de muestras que se pueden tratar para extraer ARN total con este kit, se hace difícil poder generalizar los posibles problemas y soluciones. Es por ello, que recomendamos que no duden en ponerse en contacto con el servicio técnico del laboratorio REAL (en Durviz, s.l) para cualquier consulta adicional respecto a los protocolos de trabajo o problemas que puedan surgir durante el trabajo. En el protocolo de eliminación del ADN contaminante: 1. Comprobar que la concentración de EDTA es < 0.1 mm. Debido a que la DNasa I requiere cationes divalentes para una óptima actividad, puede ser menos activa en soluciones de ARN que contengan EDTA. Para eliminar el EDTA de preparaciones de ARN, precipitar con acetato de amonio 0.5 M y 2.5 volúmenes de Etanol 100 %. Incubar a 20ºC durante 20 minutos y centrifugar a máxima velocidad durante 15 minutos para recuperar el ARN. Eliminar el sobrenadante, resuspender el ARN en Tampón de Reacción 1x y continuar con el protocolo del REALSTAR 9/10 Due to the wide number of samples that can be treated to extract total RNA using this kit, it s difficult to generalize the possible problems. Please contact REAL Technical Service (in Durviz, s.l) for any comment or question regarding the protocol In the protocol for removing the contaminant DNA: 1. Make sure that the EDTA concentration is < 0.1 mm. Due to that the DNase I requires divalent cations for an optimal activity, it can be less active in RNA solutions which contains EDTA. To remove EDTA from RNA preparations, precipitate with 0.5M amonium acetate and 2.5 volumes of 100% Ethanol. Incubate at 20ºC for 20 minutes and centrifuge at maximum speed for 15 minutes to recover the RNA. Remove the supernatant in 1x Reaction Buffer and continue with the REALSTAR protocol.

10 2. Repetir el protocolo pero añadiendo un paso de desnaturalización. Aquellas muestras con ADN contaminante que no es eliminado con el protocolo, especialmente muestras de ARN vírico, pueden beneficiarse de un 2º tratamiento con DNasa I con un paso preliminar de desnaturalización como sigue: Calentar el ARN durante 3 minutos a 95ºC y pasar rápidamente a hielo. Esto degradará los heterodúplex de ARN/ADN, los cuales son pobres substratos para la DNasa I. Después del tratamiento con calor, repetir el protocolo del REALSTAR. No calentar el ARN si hay cationes divalentes en la preparación, ya que esto causaría la degradación del ARN, en su lugar, eliminar los cationes divalentes antes de calentar con el Tampón de Inactivación como se describen en los puntos 2 4 del protocolo 2. Repeat the protocol but adding a heat denaturation step. Samples with DNA contamination that is not removed by following the REAL STAR procedure, especially viral RNA samples, may beneficiate from a second round of DNase I treatment with preliminary heat denaturation step as follows: Heat the RNA for 3 minutes at 95ºC then quench on ice. This will denature any RNA/DNA heteroduplexes, which are poor substrates for DNase I, making the DNA more susceptible to DNase digestion, after the heat treatment, repeat the REAL STAR protocol. Do not heats the RNA if there are divalent cations in the preparation, for this would cause the RNA degradation. Instead, remove the divalent cations from the preparation before heating with the Inactivation Buffer, as described in step 2 4 in the protocol... 10/10