Laboratorio N 3 ENZIMOLOGÍA

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1 Laboratorio N 3 ENZIMOLOGÍA I. - INTRODUCCIÓN La mayoría de las reacciones químicas que ocurren en los sistemas vivos, si siguieran sus propios mecanismos, ocurrirían demasiado lentas. Se requiere de catalizadores para que estas reacciones transcurran a velocidades que realmente sean útiles para la célula. En los sistemas biológicos, los catalizadores de dichas reacciones químicas son las enzimas. Qué es catálisis? Qué es lo que hace la catálisis? Para entenderlo, consideremos una reacción química simple: A + B C + D Si la reacción ocurre sin interferencia, eventualmente, parecerá como si se detuviera. Lo que sucede realmente es que tanto la reacción directa como la inversa están ocurriendo en el mismo grado. Esto es lo que conocemos como equilibrio químico y podemos expresar su constante de equilibrio: Keq = [ C] [ D] [ A] [ B] Esta constante es característica de la reacción. Un catalizador aumenta la velocidad a la que la reacción se acerca al equilibrio, pero no altera la naturaleza del estado de equilibrio. Otra propiedad importante de los catalizadores es que son muy efectivos en cantidades muy pequeñas, con respecto a las cantidades a catalizar. La Cinética Enzimática, es una rama especializada de la cinética química, que está basada en la teoría cinética de la materia. En esta teoría, se ve que una solución está hecha de un grupo de moléculas y que cada una de ellas se mueve a una velocidad particular. En este movimiento, ellas chocan entre sí, cada colisión involucra una cierta cantidad de energía. Si la colisión no involucra suficiente energía, la reacción no ocurre. Si la energía es suficiente, las moléculas se combinan para formar un intermediario activado, estableciendo un estado de transición. La energía mínima que se requiere para la formación de este intermediario es la Energía de Activación. Esto lo podemos representar mediante: A B* C Esta reacción la podemos graficar de la siguiente manera: Energía libre... B* Donde B* es el estado de transición Sustrato A Producto C Progreso de la Reacción

2 En una reacción catalizada por una enzima, esta actúa agregando pasos a la reacción, de manera que la energía de activación requerida sea menor:.. Energía libre Sustrato A ES Producto C Donde ES es la unión de la enzima con el sustrato Progreso de la Reacción Note que en las reacciones catalizadas por enzimas, al reaccionante se le llama sustrato. El cambio de Energía libre ó ΔG, es la diferencia de energía libre que se produce entre el estado inicial (sustrato) y el producto final. Si se observa en los gráficos anteriores, el cambio de energía libre es la distancia entre el estado energético del sustrato y la del producto. Note que, con o sin enzima, los niveles de energía libre inicial y final son los mismos y el ΔG es el mismo, por lo que la termodinámica de la reacción no ha cambiado. La Actividad enzimática de una enzima se determina midiendo la cantidad de producto formado (o de sustrato consumido) por unidad de tiempo. La Comisión de Enzimas de la Unión internacional de Bioquímíca ha definido la unidad de enzima como: la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 μmol (micro mol) de sustrato por minuto bajo condiciones definidas

3 En la figura anterior se puede observar la típica evolución de una curva obtenida en un ensayo enzimático. Inicialmente, la enzima transforma el sustrato en producto siguiendo un comportamiento lineal. A medida que avanza la reacción, se va agotando la cantidad de sustrato y va disminuyendo la cantidad de producto que se genera por unidad de tiempo (disminuye la velocidad de la reacción), lo que se manifiesta en forma de curva asintótica. Dependiendo de las condiciones del ensayo y del tipo de enzima, el período inicial puede durar desde milisegundos hasta horas. La mayoría de los estudios de cinética enzimática se centran en el período inicial, es decir, en la zona lineal de la reacción enzimática. Sin embargo, también es posible medir toda la curva de la reacción y ajustar estos datos a una ecuación no lineal. Esta forma de medir las reacciones enzimáticas es denominada análisis de la curva de progreso. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Para definir la actividad de una preparación enzimática se utiliza en la práctica distintas expresiones. La cantidad de enzima se indica habitualmente en unidad de actividad enzimática (U). Se define la unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micromol de sustrato por minuto (μmol/min), bajo condiciones óptimas de temperatura y ph. Normalmente, las unidades de actividad que contiene una solución se suele expresar en función del volumen de la misma, en U/mL de solución o referida a la cantidad de proteína presente en la solución, expresada en U/mg de proteína. En este último caso, la actividad enzimática se denomina Actividad específica. Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama katal (kat). Como 1 mol son 1x10 6 µmoles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a 60x10 6 U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los submúltiplos como el microkatal (µkat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat). La actividad de una enzima puede determinarse midiendo la cantidad de producto formando (o de sustrato consumido) por unidad de tiempo. De esta manera existen distintos factores que pueden modificar la actividad enzimática. Los factores que modifican la actividad enzimática, entre otros, son: 1.- Concentración de enzima 2.- Concentración de sustrato 3.- Temperatura 4.- ph 5.- Inhibidores A continuación se detalla el efecto de cada uno de los factores mencionados anteriormente. 1.- Concentración de enzima Cuando se determina la velocidad inicial de una reacción catalizada por una enzima a distintas concentraciones de ésta, en presencia de concentraciones saturantes de sustrato y manteniendo constante los otros factores ambientales (temperatura y ph) se puede establecer la relación entre cantidad de enzima y actividad. Cuanto mayor cantidad de enzima este presente, mayor será la velocidad que se alcanzará, debido a que necesito más cantidad de sustrato para alcanzar la saturación.

4 La velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración de la enzima a cualquier concentración de sustrato. Por ejemplo, si la concentración de enzima es disminuida a la mitad, la velocidad inicial de la reacción es reducida también a la mitad de la original. 2.- Concentración de sustrato A medida que aumenta la cantidad de sustrato la velocidad aumenta en forma lineal (zona proporcional), luego si bien la velocidad continúa aumentando ya no lo hace en forma lineal (zona mixta) hasta que finalmente la reacción alcanza una velocidad máxima que es constante, se vuelve independiente de la cantidad de sustrato (zona de saturación). Esto ocurre debido a que los sitios activos de las enzimas se encuentran todos interactuando con las moléculas de sustrato, por lo tanto hasta que no finalice la reacción la enzima no puede unirse a otro sustrato. La cinética enzimática comienza a inicios del 1900 con la derivación de la Ecuación de Michaelis-Menten, la que describe la relación entre la velocidad de la reacción y la concentración de sustrato: k 1 k 3 E + S ES E + P k 2 Se asume que la constante de velocidad de la reacción inversa para k 3 es insignificante y que lo importante son los valores de velocidad inicial. Cuando estamos en velocidad inicial, la cantidad de P es despreciable y, por lo tanto, la reacción inversa, E + P ES, es también despreciable. Las constantes de velocidad se combinan dando la siguiente constante: k2 + k3 Km = k 1 Donde k 1, k 2 y k 3 son constantes de velocidad Donde La velocidad de la reacción queda definida por la siguiente ecuación: V = [ S] V max [ S] + Km V = velocidad de la reacción Vmax = velocidad máxima [S] = concentración de sustrato Km= constante de Michaelis-Menten

5 Km es un parámetro cinético muy importante al momento de determinar la actividad de una enzima, ya que indica el grado de afinidad de la enzima por un sustrato. El valor de Km es inversamente proporcional a la fuerza de unión entre la enzima y el sustrato. Un valor alto de Km, indica baja afinidad de la enzima por el sustrato y un valor bajo, una alta afinidad. Gráfico de Velocidad de Reacción versus Concentración de sustrato (V / [S]) La magnitud de Km es un valor característico para la combinación de cada enzima con su sustrato. Al graficar V / [S] se tendrá: V V max V max Km [S] De este gráfico se desprende que la Km corresponde a la concentración de sustrato a la que se obtiene la mitad de la velocidad máxima. Además se pueden distinguir dos fases en la reacción. Una primera fase, en que la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración de sustrato, es decir, es de orden uno. Esto ocurre a bajas concentraciones de sustrato, por lo que la enzima no está saturada de sustrato, de manera que si aumentamos la concentración de sustrato, la velocidad aumenta. En la segunda fase, la velocidad de la reacción se vuelve independiente de la concentración de sustrato, es decir, es de orden cero. Esto ocurre cuando la enzima es saturada por el sustrato, de manera que aunque aumentemos la concentración de sustrato, la velocidad se mantiene constante. Al tipo de curva obtenido por este gráfico se le llama hipérbola rectangular. Como no es una representación lineal, es difícil trabajar con ella y obtener algunos datos. Lineaweaver-Burk, proponen un tipo de gráfico que considera los inversos de la velocidad (1/V) y de la concentración de sustrato (1/[S]), obteniéndose el siguiente tipo de gráfico 1 V La pendiente de la Recta es igual a Km / Vmax V 1 max 1 Km 1 S A este gráfico, también se le conoce como de Dobles Recíprocos.

6 3.- Temperatura Un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de reacción hasta cierta temperatura, la temperatura óptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reacción debido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse. Las enzimas de muchos mamíferos tienen una temperatura óptima de 37 C, por encima de esa temperatura comienzan a inactivarse y se destruyen. Sin embargo existen especies de bacterias y algas que habitan en fuentes de aguas termales y en el otro extremo ciertas bacterias árticas tienen temperaturas óptimas cercanas a 0 C. 4.- ph Las graficas muestran que a ph extremos las proteínas se desnaturalizan, por lo tanto la actividad biológica decae. Algunas enzimas no varían su actividad con el ph sino que esta se mantiene constante en un amplio rango. Otra tendrá el ph óptimo ácido o básico teniendo en cuenta el medio en donde actúan. 5.- Inhibidores Muchos tipos diferentes de moléculas inhiben las enzimas, y actúan de diversas formas. Estos inhibidores pueden provocar una inhibición irreversible o una inhibición reversible. Inhibidores irreversibles: estos inhibidores se enlazan con fuerza a la enzima, se unen COVALENTEMENTE a algún aminoácido del sitio activo. Producen cambios permanentes en la molécula de enzima, con deterioro definitivo de su capacidad catalítica. (Ejemplos, son los compuestos organofosforados utilizados como insecticidas, el alopurinol un inhibidor utilizado en el tratamiento de la Gota, etc). Inhibidores reversibles: Los diversos modos de inhibición reversible implican todos ellos la unión NO COVALENTE de un inhibidor a la enzima, pero difieren en los mecanismos por medio de los cuales reducen la actividad enzimática y en la forma en que afectan la cinética de la reacción. Dentro de este grupo encontramos los inhibidores competitivos, no competitivos y incompetitivos. Sin embargo, los tipos de inhibición más frecuentes son la competitiva y la no competitiva. o Los inhibidores competitivos compiten con el sustrato por el sitio activo de la enzima, y si aumentamos la cantidad de sustrato, el efecto inhibidor se revierte alcanzándose la velocidad máxima.

7 o Los inhibidores no competitivos se enlazan a un sitio distinto del sitio activo, de manera que el inhibidor se puede unir a la enzima libre o bien al complejo enzima sustrato, pero en ninguno de los casos obtendremos productos. El efecto de estos inhibidores no se revierte por el agregado de mayor cantidad de sustrato, de manera que se llega a una velocidad máxima menor que si no tuviera el inhibidor. o Los inhibidor incompetitivo se fijan a un sitio distinto al del sustrato, con la diferencia que solamente se fija al complejo enzima-sustrato. No es raro observar algunos inhibidores a los cuales no se les puede comprobar el mecanismo exacto de inhibición, siendo en algunos casos un tipo de inhibición mixta. Método de análisis Como ya se ha visto, las enzimas son proteínas que en los sistemas vivos se encuentran mezcladas entre sí y con muchas otras especies moleculares. Sin embargo, es posible detectarlas y determinarlas con exactitud por las reacciones que catalizan, para lo cual es necesario conocer el o los sustratos que utilizan y el o los productos de sus reacciones, además de poseer los métodos analíticos para medirlos. También se deben considerar todos los controles experimentales, de manera de descartar cualquier otro artefacto experimental de la reacción que pueda hacer aparecer producto o desaparecer sustrato de forma inespecífica. Los controles más importantes son: a. Blanco Sustrato: Es una mezcla de reacción semejante a la mezcla en la que se detecta la actividad enzimática, pero en ella se reemplaza la solución que contiene al sustrato por un volumen equivalente de su solvente. Este volumen puede ser reemplazado por agua o el buffer de la reacción. b. Blanco Enzima: También corresponde a una mezcla semejante a la mezcla en la que se detecta la actividad enzimática, pero en ella se reemplaza la solución que contiene a la enzima por un volumen equivalente de su solvente. Este blanco es importante cuando el sustrato es inestable y se puede obtener producto en ausencia de la enzima. c. Tiempo Cero: Este control contiene todos los componentes necesarios para la detección de la actividad enzimática. Consiste en que la reacción es detenida en el momento mismo en que se inicia (tiempo cero). Por lo general una reacción enzimática se inicia con la adición de la enzima o bien con la de su sustrato. El método analítico para determinar la cantidad de producto formado será a través de un espectrofotómetro. El espectrofotómetro permite determinar la absorción de la luz a determinadazas longitudes de onda, la cual está directamente relacionada con la concentración de los productos. II.- PARTE EXPERIMENTAL

8 1. Material de estudio Entre las enzimas que se han conocido desde muy antiguo, se encuentran aquellas que hidrolizan la sacarosa. En 1860, Berthelot purificó una enzima procedente de la levadura y que hidrolizaba la sacarosa, la llamó Ferment inversif. más recientemente se le ha llamado: invertasa, sucrasa, sacarasa y O-fructofuranosidasa. El sustrato de esta enzima es la sacarosa y se obtiene como productos glucosa y fructosa. En esta sesión experimental, se usará el procedimiento de análisis a tiempo fijo, que consiste en detener la reacción usando el reactivo 3,5-DNS (ácido 3,5-dínitrosalicílíco) y medir el poder reductor de los productos. Curva de Calibración (ó Curva Estándar) Objetivo: Desarrollar una curva de calibración que permita relacionar la cantidad de producto obtenido con la Absorbancia. Procedimiento: 1) Desarrolle el siguiente protocolo: Reactivos Glucosa y Fructosa 0,005 M Sacarosa 0,6 M H 2 O destilada 3,5-DNS TUBOS Blanco Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5-0,2 ml 0,4 ml 0,8 ml 1,2 ml 1,5 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 2,0 ml 1,8 ml 1,6 ml 1,2 ml 0,8 ml 0,5 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2) Desarrolle el color calentando los tubos durante 5 minutos en baño termorregulado a 100ºC. 3) Enfríe los tubos. 4) Determine la Absorbancia de cada tubo, leyendo en espectrofotómetro a 540 nm de longitud de onda 5) Anote las lecturas en la siguiente tabla: CURVA DE CALIBRACIÓN Cantidad de glucosa y fructosa (μmol) Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5 1,0 2,0 4,0 6,0 7,5 Absorbancia 0,006 0,013 0,024 0,038 0,047 6) Realice un gráfico (curva de calibración), Absorbancia versus concentración de producto

9 Influencia de la concentración de Sacarosa sobre la Velocidad de la Reacción. Objetivo: Determinar el efecto de la concentración de sustrato en la velocidad de una reacción enzimática. 1) Desarrolle el siguiente protocolo: Procedimiento: Reactivos Blanco Buffer Acetato 0,1 M ph 4,7 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 2 ml Sacarosa 0,05 M 1 ml Sacarosa 0,10 M - 1 ml Sacarosa 0,20M ml Sacarosa 0,30 M ml - - Sacarosa 0,50 M ml - Invertasa 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 2) Incube por 5 minutos a temperatura ambiente. 3) Adicione 2 ml de 3,5 DNS a cada uno de los tubos. 4) Desarrolle el color calentando los tubos durante 5 minutos en baño termorregulado a 100ºC. 5) Enfríe los tubos. 6) Seleccione en el espectrofotómetro una longitud de onda de 540 nm. Ajuste a cero el equipo utilizando el tubo blanco 7) Mida las absorbancias de los otros tubos ( del 1 al 5) y anote las lecturas en la siguiente tabla: Absorbancia ) Con los datos anteriores, extrapole los valores de Absorbancia en la curva de calibración, para obtener la cantidad de producto y complete la siguiente tabla: Producto (µmol) ) Determine la velocidad de reacción (V=Producto/5) y la cantidad de sustrato para completar la siguiente tabla. Cantidad de Sustrato (sacarosa) (μmol) Producto / 5 = Velocidad

10 10) Complete la siguiente tabla y confeccione un gráfico de 1/S versus 1/V, (gráfico de Lineweaver Burk ) 1 / Sustrato / Velocidad 11) A partir del gráfico anterior determine los valores de la Km y la Vmáx. Efecto de la Temperatura sobre la Actividad enzimática. Objetivo: Determinar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática de la Invertasa. 1) Desarrolle el siguiente protocolo: Procedimiento: Reactivos Buffer Acetato 0,1 M ph 4,7 Sacarosa 0,6 M Invertasa Temperatura de Incubación (5 minutos) TUBOS 1 1e 2 2e 3 3e 1 ml 2 ml 1 ml 2 ml 1 ml 2 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml - 1 ml - 1 ml - 3ºC Ambiente 99ºC 2) Registre la temperatura ambiente con un termómetro. 3) Adicione 2 ml de 3,5-DNS a cada uno de los tubos. 4) Desarrolle color calentando durante 5 minutos en baño termorregulado a 100ºC. 5) Enfríe los tubos. 6) Seleccione en el espectrofotómetro una longitud de onda de 540 nm. Ajuste a cero el equipo utilizando el tubo blanco ( tubo 1e) 7) Mida la absorbancia del tubo 1y anote las lecturas en la siguiente tabla. 8) Repita el procedimiento 6) y 7) para las otras temperaturas 9) Anote las lecturas en la siguiente tabla. Absorbancia

11 10) Con los datos anteriores, extrapole los valores de Absorbancia de la curva de calibración (práctico N 2) para obtener la cantidad de producto y complete la siguiente tabla: Temperatura 3ºC Ambiente 99ºC Producto (µmol) 11) Grafique temperatura versus Producto 12) Determine el efecto de la temperatura sobre la actividad de la Invertasa