El Factor de Crecimiento de Hígado "LGF" como agente terapéutico en la ataxia experimental
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- Víctor Serrano Henríquez
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1 El Factor de Crecimiento de Hígado "LGF" como agente terapéutico en la ataxia experimental Dra. Eulalia Bazán Izquierdo Servicio de Neurobiología (IRYCIS) Hospital Universitario Ramón y Cajal Madrid
2 INTRODUCCIÓN El término ataxia, que significa descoordinación y es un síntoma clínico, se usa como sinónimo de un grupo heterogéneo de aproximadamente 50 enfermedades caracterizadas por la falta de coordinación motora. Aunque tienen distinta etiología, todas tienen en común la disfunción del cerebelo y sus circuitos asociados, especialmente las aferencias espinocerebelosas. Hoy en día no existe un tratamiento eficaz para las ataxias cerebelosas Factores tróficos que potencian los procesos de reparación endógena del cerebro Calatrava-Ferreras et al., Journal of Mol Sci: Neuroprotective Strategies 2014 (en revisión) Franco C et al., Mol. Neurodegener, 7: 51-, 2012 Fernandez et al., Brain Res Brain Res Rev, vol. 50, no. 1, pp , 2005 Tolbert and Clark, Exp Neurol, vol. 183, no. 1, pp , 2003 Terapias basadas en la generación de drogas que corrigen alguno de los procesos moleculares implicados en la patogénesis de este grupo de enfermedades M. Pandolfo, Nat Clin Pract Neurol, vol. 4, no. 2, pp , 2008 Marmolino and Manto, Curr Neuropharmacol, vol. 8, no. 1, pp , 2010 Terapias regenerativas basadas en el implante de células troncales embrionarias Jones J. et al. PLoS One May 9;8(5):e62807, 2013 Calatrava-Ferreras et al.,stem Cells International, vol. 2012, Article ID , 14 pp Erceg et al., Stem Cells Dev, vol. 19, no. 11, pp , 2010
3 Factores tróficos que potencian los procesos de reparación endógena del cerebro El Factor de Crecimiento de Hígado, LGF, es un complejo albúmina-bilirrubina purificado por el Dr. Díaz-Gil del Hospital Universitario Puerta de Hierro-Majadahonda El LGF es un potente mitógeno hepático que estimula la proliferación y la regeneración tisular en diferentes patologías tanto hepáticas como extrahepáticas. En el SNC el LGF: Use of the Liver Growth Factor (LGF) as a neural tissue regenerator (Pat No., US 8,642,551 B2, date of Patent, Feb. 4, 2014) Continuation-in-part US 2014/ A1, 24 de abril 2014 Promueve la regeneración y supervivencia de neuronas DA dañadas Reimers et al., J Histochem Cytochem 2006;54:457-6 Gonzalo-Gobernado et al., PLOS ONE, Vol. 8, Issue 7, e67771, 2013 Estimula la neurogénesis Gonzalo-Gobernado et al., J Histochem Cytochem 2009;57: Incrementa la viabilidad y diferenciación de los implantes de células madre neurales Reimers et al., Curr Stem Cell Res Ther, vol. 7, no. 1, pp , 2012 Reduce la inflamación y los niveles de fosfo-tau y β-amieloide en un modelo experimental de Alzheimer en ratón. El LGF tiene actividad antioxidante in vivo e in vitro Condezo-Hoyos et al. Free Rad Biol Med., 46:656-62, 2009 Condezo-Hoyos et al., J Hypertension 30: , 2012 El LGF tiene actividad sobre el sistema cardiovascular reduciendo, entre otros parámetros, la hipertrofia ventricular en ratas hipertensas Somoza B. et al. Cardiovasc Res 69: , 2006
4 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Como hipótesis de trabajo planteamos que la administración de LGF podría ejercer efectos beneficiosos en el tratamiento de las ataxias cerebelosas, incluida la ataxia de Friedreich, debido a su potencial neuroreparador y a su actividad antioxidante. 1.- Determinar el potencial terapéutico de la administración intraperitoneal de LGF en el modelo experimental en rata de ataxia cerebelosa inducido por 3- acetilpiridina (3-AP) (Fernández et al., PNAS, U S A, vol. 95, no. 3, pp , 1998) 2.- Analizar la potencialidad del LGF como agente terapéutico en la ataxia de Friedreich experimental. Para ello se utilizarán ratones transgénicos humanizados de la estirpe Fxn tm1mkn / Tg (FXN) YG8Pook (YG8R) (Al-Mahdawi y col., 2006)
5 OBJETIVOS 1.- Determinar el potencial terapéutico de la administración intraperitoneal de LGF en el modelo experimental de ataxia cerebelosa en rata inducido por 3- acetilpiridina (3-AP)
6 RESULTADOS 1.- Efectos del tratamiento con LGF en ratas atáxicas Marcadores neuronales en tronco del encéfalo
7 RESULTADOS 1.- Efectos del tratamiento con LGF en ratas atáxicas Marcadores neuronales en cerebelo A B C D
8 RESULTADOS 1.- Efectos del tratamiento con LGF en ratas atáxicas Marcadores neuronales en cerebelo
9 RESULTADOS 1.- Efectos del tratamiento con LGF en ratas atáxicas Prevención de la activación de la microglia en cerebelo
10 RESULTADOS 1.- Efectos del tratamiento con LGF en ratas atáxicas Regulación de la concentración extracelular de GLU y GABA en cerebelo
11 RESULTADOS 1.- Efectos del tratamiento con LGF en ratas lesionadas con 3-AP Recuperación de la coordinación motora
12 CONCLUSIONES 1- El tratamiento con LGF estimula la supervivencia neuronal en el tronco del encéfalo de las ratas lesionadas con 3-AP 2.- En el cerebelo, el LGF previene la activación de la microglia, y protege a los terminales de las neuronas de Purkinje que proyectan sobre los núcleos profundos del cerebelo del daño provocado por la neurotoxina 3-AP. 3.- En la corteza cerebelosa de las ratas atáxicas el LGF modula la concentración extracelular de los neurotrasmisores glutamato y GABA que regulan la actividad de las neuronas de Purkinje. La estimulación de mecanismos de supervivencia celular, y el posible papel antiinflamatorio del LGF, junto con la mejoría observada en la coordinación motora nos permite proponer al LGF como un futuro agente terapéutico para las ataxias.
13 OBJETIVOS 2.- Analizar la potencialidad del LGF como agente terapéutico en la ataxia de Friedreich experimental. Para ello se utilizaron ratones transgénicos humanizados de la estirpe Fxn tm1mkn / Tg (FXN) YG8Pook (YG8R)
14 RESULTADOS 2.- Efectos del tratamiento con LGF en ratones AF YG8R Marcadores neuronales en SNC
15 RESULTADOS 2.- Efectos del tratamiento con LGF en la hipertrofia ventricular
16 RESULTADOS 2.- Efectos del tratamiento con LGF en ratones AF YG8R Expresión de frataxina y ferroportina en SNC y corazón
17 RESULTADOS 2.- Efectos del tratamiento con LGF sobre el estrés oxidativo en el músculo esquelético
18 RESULTADOS 2.- Efectos del tratamiento con LGF en ratones AF YG8R Coordinación motora
19 CONCLUSIONES 1- En el modelo experimental de ataxia de Friedreich en ratón, el LGF ejerce un efecto neuroprotector sobre las neuronas sensoriales de la médula lumbar y mejora la hipertrofia cardiaca. 2.- Ambos eventos podrían ser debidos al incremento en la expresión de FXN promovido por el factor en la médula espinal y el corazón, ya que la degeneración de ambas estructuras está directamente asociada con el déficit en esta proteína. 3.- Además, el LGF reduce el estrés oxidativo en el músculo esquelético, y mejora la coordinación motora, por lo que en conjunto podríamos considerar a este factor como un potencial agente terapéutico en el tratamiento de la AF.
20 Neurobiología (IRYCIS) Antonio Sánchez Herranz Diana Reimers Cerdá María José Casarejos Fernández Lucía Calatrava Ferreras Rafael Gonzalo Gobernado Neurología (HRyC) Adriano Jiménez Escrig Facultad de Medicina UAM Dr. Javier Regadera Lcdo. Juan Pedro Velasco Financiado por la Agencia Pedro Laín Entralgo (NDG7/09) y la Fundación Ataxias en Movimiento
21 MÉTODOS 1.- Tratamiento con LGF de ratas lesionadas con 3-AP
22 MÉTODOS 2.- Valoración de la coordinación motora mediante el test de rotarod Registro del tiempo de permanencia en la barra motoriz<<<<<<<<<<ada Velocidad constante (4 rpm) Aceleración progresiva (4-40 rpm en 1 minuto)x 3.- Valoración de la capacidad neuroregeneradora del LGF mediante el análisis por inmunohistoquímica y western blot de la expresión de marcadores específicos de las neuronas de la oliva inferior y de las neuronas de Purkinje en el cerebelo. 4.- Valoración de la capacidad del LGF para prevenir la reactividad de las células de la glía, y para potenciar la expresión de proteínas involucradas en la supervivencia celular 5.- Valoración de la capacidad del LGF para modular la funcionalidad del cerebelo mediante la determinación de la concentración extracelular de glutamato y GABA por técnicas de microdiálisis y HPLC
23 MÉTODOS 2.- Tratamiento con LGF en ratones transgénicos YG8R
24 MÉTODOS 2.- Valoración de la coordinación motora mediante el test de rotarod Registro del tiempo de permanencia en la barra motorizada Velocidad constante (4 rpm) Aceleración progresiva (4-40 rpm) 3.- Determinación por inmunohistoquímica y western blot de la expresión de marcadores específicos de neuronas y de glía en la médula espinal, el tronco del encéfalo y el cerebelo. 4.- Valoración de la la expresión de frataxina y de proteínas involucradas en la supervivencia celular en el SNC y el corazón. 4.- Valoración de la capacidad del LGF para modular la hipertrofia ventricular mediante el estudio del diámetro de los cardiomiocitos y la relación peso del ventrículo izquierdo vs peso corporal. 5.- Determinación de los niveles de glutation oxidado y reducido en el músculo esquelético
25 RESULTADOS Potencial Terapéutico de las HuUCBCs y del LGF en la Ataxia Cerebelosa Experimental 2.- Efectos del tratamiento con LGF en la expresión del complejo IV en SNC y corazón y sobre los niveles de glutation en músculo esquelético 350 CIV (35 kda) CIV / GAPDH en corazón (DO) % vs WT GAPDH (37 kda) 0 WT YG8R YG8R+LGF
26 RESULTADOS Potencial Terapéutico de las HuUCBCs y del LGF en la Ataxia Cerebelosa Experimental 2.- Efectos del tratamiento con LGF en ratones AF YG8R Marcadores de supervivencia celular en SNC y corazón 250 P-Akt/Akt en corazón % vs WT WT YG8R YG8R + LGF
27 RESULTADOS Potencial Terapéutico de las HuUCBCs y del LGF en la Ataxia Cerebelosa Experimental 1.- Efectos del tratamiento con LGF en ratas atáxicas Marcadores de daño en cerebelo
28 OBJETIVOS Potencial Terapéutico de las HuUCBCs y del LGF en la Ataxia Cerebelosa Experimental 2.- Estudiar la potencialidad del LGF como agente terapéutico en la ataxia de Friedreich experimental En la ataxia cerebelosa experimental el LGF: 1) previene la disminución en la expresión de calbindina en el cerebelo; 2) estimula la expresión de Bcl-2 en el tronco del encéfalo y 3) promueve una mejoría conductual que se mantiene durante al menos dos meses tras la administración del factor Calatrava-Ferreras et al., Journal of Mol Sci: Neuroprotective Strategies 2014 (en revisión) El LGF tiene actividad antioxidante in vivo e in vitro Condezo-Hoyos et al. Free Rad Biol Med., 46:656-62, 2009 Condezo-Hoyos et al., J Hypertension 30: , El LGF tiene actividad sobre el sistema cardiovascular en ratas hipertensas Somoza B.et al. Cardiovasc Res 69: , 2006
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