SÍNTESIS ENZIMÁTICA DE ALCAMIDAS EN MEDIO NO ACUOSO Y EVALUCIÓN DE SU ACTIVIDA BIOLÓGICA

Transcripción

1 Clave: SÍNTESIS ENZIMÁTICA DE ALCAMIDAS EN MEDIO NO ACUOSO Y EVALUCIÓN DE SU ACTIVIDA BIOLÓGICA AUTORES: Félix de Jesús Gómez Miranda 1, Enrique Ramirez Chaves 2, Jorge Molina Torres 2 DIRECCIÓN DE LOS AUTORES: 1 Depto. De Ingeniería Bioquímica del Instituto Tecnológico Superior de Irapuato. 2 Departamento de Biotecnología y Bioquímica, Laboratorio de Fitobioquímica, Centro de investigación y de Estudios Avanzados, Campus Irapuato, Guanajuato. CORREO ELECTRÓNICO: 2 jmolina@ira.cinvestav.mx

2 INTRODUCCIÓN Las alcamidas son metabolitos secundarios que comprenden un grupo de aproximadamente 70 estructuras distribuidas a lo largo del reino vegetal y que representan una clase singular de productos naturales que se forman al combinar dos rutas metabólicas diferentes. Las alcamidas están constituidas por la condensación de un ácido graso de longitud de cadena de mediana a larga, que puede ser de ocho a dieciocho carbonos generalmente, alifática o lineal, y una amina proveniente de algún aminoácido por descarboxilacion al momento de su condensación. Su importancia radica en la variedad de efectos, ya que su actividad depende de la estructura y el número de enlaces o ligaduras dobles que presenten. (Molina Torres y García Chávez, 2001). Estos compuestos bioactivos alifáticos se han dividido en dos grupos principales: las alcamidas olefínicas, que tienen sólo dobles ligaduras, y las acetilénicas, que presentan al menos una triple ligadura (Molina-Torres y García Chávez, 1999). La síntesis de alcamidas que se producen naturalmente, puede tener lugar en condiciones de laboratorio mediante métodos químicos o enzimáticos. La síntesis enzimática constituye una estrategia a través de la cual se pueden desarrollar moléculas de alcamidas similares a las que producen las plantas naturalmente y propicia además que se pueda manipular la reacción y obtener nuevas estructuras cuya actividad biológica es más especializada y dirigida. Las alcamidas naturales más ampliamente utilizadas son extraídas de las raíces de la planta de Heliopsis longipes que comúnmente se le conoce como chilcuague la cual es una planta endémica de la sierra gorda de Guanajuato La afinina, es la más distribuida de las alcamidas, tiene efecto bactericida, insecticida, fungicida, anestésico local, entre otras (García- Chávez y Molina-Torres, 2004). Estudios recientes afirman que además de la afinina existen otras alcamidas que presentan actividad fungistática y bacteriostática como son las moléculas N-isobutil- 2E-decanamida, N-(2-fenil-etil) decanamida y N-isobutil dodecanamida, (Molina-Torres et al.,2004)

3 MATERIALES Y MÉTODOS SÍNTESIS Y PURIFICACIÓN DE ALCAMIDAS En un reactivial, limpio y libre de humedad se hicieron reaccionar µl del etil éster del ácido 2,4-decanoico, µl, 3 ml de Tolueno y mezclar. Antes de adicionar 20 mg de enzima Novozim y 20 mg de Na 2 SO 4, se analizó una alícuota diluida 1:10 (T0) del contenido del reactivial, por GC/MSD para la caracterización de los reactivos y de los productos de la reacción. Posteriormente se incubó el reactivial con la mezcla durante 24 h en un termoblock, que se ajustó a 70 C con agitación constante. Se evaluó la cinética de reacción, tomando de la mezcla 10 µl y 90 µl de Tolueno y se analizaron por GC /MSD a las 0, 24, 48, 144 y 168 horas de iniciada la reacción. La purificación de la alcamida obtenida, se realizó por TLC. OBTENCIÓN DE ISÓMEROS DE PELLITORINA Y N-(2-FENIL-ETIL-) 2E, 4E- DECADIENAMIDA En una celda de cuarzo se colocó 500 mg de muestra, 500 µl de etanol absoluto, 3 ml de tolueno, y agregó un pequeño cristal de yodo, y se sometió la muestra contenida en las celdas cuarzo a luz ultravioleta de 254 nm por espacio de 1 h, una vez transcurrido el tiempo, se tomó una alícuota 1:10 de la muestra y se analizó por GC/MSD. Para separar los distintos componentes de la muestra que se isomerizó, se usó TLC, solo que ahora se le agregó nitrato de plata al sílice. ACTIVIDAD BACTERICIDA DE LA ALCAMIDA N-2-FENILETIL-2E,4Z-DECADIENAMIDA Se colocaron 10ml de medio PDB y Kb correspondientemente, en matraces. Se agregó al medio la cantidad correspondiente de la alcamida, para concentraciones iníciales: 0, 25, 75 y 150 µl por duplicado. A cada par de matraces se añadió 100 µl de cultivo de Bacillus Subtillis y de Pseudomonas tagetes en cada caso y se procedió a incubar a C a 200 rpm por 24Hrs. Se midió la densidad óptica a 650 nm con el espectrofotómetro cari varían.

4 Una vez que se finalizaron las lecturas en el espectrofotómetro se procedió a graficar los resultados obtenidos. RESULTADOS Figura 1. Efecto de la alcamida N-2-feniletil -2E, 4Z-decadienamida, en el crecimiento de B. subtilis y P. tagetes. Figura 2. Efecto de la N-isobutil-2E, 4Z -decadienamida en el crecimiento de B. subtilis y P. tagetes.

5 Fig.3, efecto de la alcamida N-isobutil-2E, Fig.4, efecto de la alcamida N-(2-fenil- 4E-decadienamida, en el crecimiento de etil-)-2e,4e-decadienamida, en el B. subtilis y P. tagetes crecimiento de B. subtilis y P. tagetes CONCLUSIÓN Y DISCUSIÓN El desarrollo de presente trabajo permitió llegar a las siguientes conclusiones: Se logró obtener por la vía enzimática en medio no acuosos, 2 alcamidas, donde al termino de la reacción, se obtuvo un % de conversión de los reactantes. Las alcamidas N-isobutil-2E, 4Z-decadienamida y N-2-feniletil-2E-4Z-decadienamida, no presentaron efecto inhibitorio en el crecimiento de B. subtilis ni S. tagetes, a ninguna concentración. Los isómeros N-isobutil-2E,4E-decadienamida y N-2-feniletil-2E,4E-decadienamida, de las alcamidas sintetizadas, solo tuvieron efecto inhibitorio en las bacterias Gram (+), B. subtilis, a una concentración de 75 mg/ml y no en las Pseudomonas tagetes a ningunas de las concentraciones estudiadas.

6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Molina-Torres J, García-Chávez A (2001) Alcamidas en plantas: Distribución e importancia. Avance y Perspectiva 20: Molina-Torres J, García-Chávez, Urías-Silvas J (1999). Alcamidas Saborizantes en Plantas 9: Molina-Torres J, Salazar-Cabrera C, Armenta-Salinas C y Ramírez Chávez E (2004).Fungistatic and Bacteriostatic Activites of alkamides from Heliopsis longipes roots: Affinin and Reduced amides. J. Agric. Food Chem. 52 (15):