La importancia de la detección precoz de mutaciones de ABL Kinasa. Como identificar el fallo del tratamiento

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1 La importancia de la detección precoz de mutaciones de ABL Kinasa. Como identificar el fallo del tratamiento J. Martínez-López H. Universitario 12 de Octubre. i+12 CNIO Universidad Complutense CIBERONC Importancia de la detección de mutaciones en ABL-KD Metodología de estudio de las mutaciones de ABL-KD Impacto clínico de la detección de mutaciones de ABL-KD mediante técnicas sensibles y su detección precoz

2 Mecanismos de resistencia LMC seguimiento ,1 0,01 0,001 0, /01/ /04/ /07/ /10/2007 fecha LMC seguimiento ,1 0,01 0,001 0, /01/ /07/ /01/ /07/ /01/ /07/ /01/ /07/2007 fecha 1 aria 2 aria FC 4-6% 7-27% FA 24% 60% CB 66% 90% Mecanismos de resistencia 1.- Mutaciones en el dominio ABL cinasa 2.- Sobre-expresión de BCR/ABL Resistencias secundarias o adquiridas 3.- Alteraciones en la regulación de los transportadores del fármaco Resistencias primarias 4.- Mecanismos independientes de BCR/ABL

3 Mutaciones en el dominio ABL cinasa P-loop Gate keepers Catalytic domain Activation loop M244V D276G V289A M343T E355G/D H396R/P S417Y L248V T277A M351T/V L387M/F G250E Q252R/H Y253F/H E255K/V F311L/I F317L F359V F382L E459K F486S V379I T315I A380T Descritas 150 mutaciones diferentes que originan la sustitución de 50 aminoácidos 7 mutaciones suponen el 85% de los casos resistentes Mutaciones en el dominio ABL cinasa Mutaciones en el sitio de unión del fármaco: T315I F317L/I Mutaciones en el sitio de unión del fosfato (P-loop) L248V G250E Q252H Y253H E255K Mutaciones en la región de activación F328L G383D L384M L387F/M Mutaciones en el dominio catalítico M351T E355G/D K357R F359V

4 Mutaciones del Dominio ABL kinasa Significado Clínico La probabilidad de encontrar mutaciones es: Muy baja Fase crónica al diagnóstico Enfermos en CCyR o que disminuye el nivel de enf Alta probabilidad Fase crónica tardía 20% Fase Acelerada 30-50% Crisis Blástica 70-80% Resistencias secundarias 60-90% Resistencia primaria 20-40% Hockhous A Leukemia 02. Soverini. Clin Can Research 2006 Hughes T Blood Mutaciones del Dominio ABL kinasa Significado Clínico Mecanismo policlonal Se pueden detectar antes del inicio del tto con ITK La clones a nivel bajo no tienen significación? Algunas clones mutados regresan tras suprimir el ITK

5 Mutaciones del Dominio ABL kinasa Cuándo estudiar las mutaciones de ABL Kinasa en LMC? Solo indicado en caso de Fallo Mutaciones del Dominio ABL kinasa Cuándo estudiar las mutaciones de ABL Kinasa en LMC? M Baccarani, Blood 2013 M Baccarani, Blood 2013

6 Mutaciones del Dominio ABL kinasa Cuándo estudiar las mutaciones de ABL Kinasa en LMC? Tiempo Diagnóstico Estudio de mutaciones AKD NO 3 m No RHC Ph+>95% 6 m BCR-ABL1 > 10% Ph+ > 65% 12 m BCR-ABL1 > 10% Ph+ > 35% En cualquier momento Perdida de RHC, CCyR, PCyR, RMM Mutaciones del Dominio ABL kinasa Cuando estudiar las mutaciones de ABL Cinasa Guías CNNC v2017. treatment Milestones M Baccarani, Blood 2013 CNNC CML Guidelines 2017 V2

7 Mutaciones del Dominio ABL kinasa Cuando estudiar las mutaciones de ABL Cinasa Cual es la realidad? Selección de ITK en función de la presencia de mutaciones Mutaciones T315I V299L T315A F317L/V/I/C Y253H, E255K/V Otras itk Ponatinib Nilotinib, Ponatinib Imatinib, Busotinib, Nilotinib, Ponatinib Busotinib, Nilotinib, Ponatinib Dasatinib, Busotinib, Ponatinib Dasatinib, Nilotinib, Busotinib, Ponatinib

8 Importancia de las mutaciones en ABL-KD en la detección Metodología de estudio de las mutaciones de ABL-KD Impacto clínico de la detección de mutaciones de ABL-KD mediante técnicas sensibles y su detección precoz Metodología Fase PRE PCR Estudiar siempre sangre periférica Volumen 10 ml (5-10 millones de células) Sangre anticoagulada con EDTA Enviar a temperatura ambiente Debe procesarse en las primeras 24 horas Se deben estudiar leucocitos totales Métodos de Retrotranscripción y extracción de RNA son fundamentales

9 Mutaciones Dominio ABL Quinasa Metodología Secuenciación Método de Elección Sensibilidad 20% ASO-PCR/PCR Digital D-HPLC HRM Sensibilidad 0,1% Sensibilidad 1% Sensibilidad 1-5% NGS- secuenciación profunda Sensibilidad 1% Gorre E Science 2001 Willis S Blood Soverini S Blood Que és la secuenciación? El código genético

10 Pre-PCR Dominio ABL Quinasa 1 PCR BCR-ABL Exones 6-9 Residuos Exones d PCR Exones 6-9

11 Secuenciadores de Nueva Generación = Medicina Personalizada Micro-PCR Micro-detectors Massive Data Analysis Impacto NGS 22

12 Deep Sequencing a very interesting application of NGS WES, WTS, WGS Deep Sequencing A lot small fragments of DNA can be sequenced from 50 to 100 cells A small fragment of DNA from millions cells can be sequenced from a sample MRD detection Oligoclonality Proceso para realizar un estudio mediante NGS Extracción y purificación de DNA/RNA/cDNA/DNA metilado Tagmentación PCR multiplex Generar Librerias Control de calidad - Cuantificación - Mezcla de librerías Generar Librerias Hibridación y captura Control de calidad PCR en emulsión/ligación -Purificación -Amplificación -Mezcla de librerías -Cuantificación -Carga de Chip SECUENCIACIÓN ANÁLISIS DE DATOS

13 Secuenciadores 1 Baja Capacidad MiniSeq/PGM 2 Capacidad Media MiSeq/S5 3 Alta Capacidad NextSeq500/Hiseq2000/NovaSeq Coverage: x 10% C>G p.l248v Sanger: NO VARIANTS

14 Mutaciones en el dominio quinasa de BCR-ABL Hospital Universitario 12 de Octubre por Secuenciación Masiva MUTACIONES COMPUESTAS 27 Mutaciones en el dominio quinasa de BCR-ABL por Secuenciación Masiva Técnica NGS (Gly 227 -Gly 514 ) Secuenciación Sanger (SS) (Lys 245 *-Asn 479 ) Límite de detección 10-20% Número de mutaciones detectadas (>10%) Número de mutaciones detectadas (1-10%) Hospital Universitario 12 de Octubre Número pacientes = 62 (52% con mutaciones por NGS) Número de muestras = 78 (45/78 con mutaciones, 58%) Número total mutaciones en KD, desde Lys 245 hasta Glu 509 = /14 (36%) 42 1/21 (5%) % de mutaciones no detectadas por SS 29/35 (83%) Muestras con > de 1 mutación 12/78(15%) Muestras con mutación y BCRABL1<1% 6/78 (8%) 28

15 Secuenciación de nueva generación de ABL Kinasa Ventajas Secuenciación no dirigida a regiones concretas. Gran versatilidad Gran sensibilidad 1% Identifiación de mutaciones compuestas Inconvenientes Necesidad de infraestructuras complejas Validación clínica de los resultados Proyecto Nacional para Estudio de Mutaciones de ABL Kinasa mediante NGS. CUN Clínico Salamanca H 12 Octubre H La Fe Clinic de Bacerlona H Regional Málaga H Dr Negrin 30

16 Preguntas frecuentes sobre aspectos metodológicos del estudio de mutaciones ABL Kinasa Se puede estudiar las mutaciones en enfermos con BCR/ABL1 entre 0,1-1%? R SI Si la sensibilidad de la técnica es del 15% como podemos detectar mutaciones en un enfermo con BCR/ABL del 3%? R La sensibilidad del 15% se refiere a la técnica de secuenciación no a la técnica de BCR/ABL1 cuantitativo Importancia de las mutaciones en ABL-KD en la detección Metodología de estudio de las mutaciones de ABL-KD Impacto clínico de la detección de mutaciones de ABL-KD mediante técnicas sensibles y su detección precoz

17 La Presencia de mutaciones compuestas redefine el perfil de sensibilidad a los itk M Zabriskie, Cancer Cell 2014 La Presencia de mutaciones compuestas redefine el perfil de sensibilidad a los itk M Zabriskie, Cancer Cell 2014

18 Nuevos conceptos respecto a mutaciones Mutaciones predominantes Mutaciones únicas/simples Mutaciones a bajo nivel Mutaciones compuestas > 1 mutación Mutaciones simples Mutaciones compuestas Mutaciones policlonales Mutaciones policlonales Componente Khorashad J, et al Blood Relevancia de identificar mutaciones en baja frecuencia, en pacientes tratados con ponatinib Parker et al, Blood

19 Mejorar la identificación de mutantes de ABL Soverini et al, Oncotarget Detección precoz de clones mutados, en paciente en tto de segunda línea con itk pacientes con Fallo a Imanitib y a segundo ITK y tenían mutaciones - 43% se detectaban en el primer cambio la misma mutación pacientes resistentes a Imatinib que habían respondido a segundo itk - No se detecto mutaciones a baja frecuencia que conferían resistencia al segundo itk 3.- Se detecto mutación en el 45% de los 3 meses antes del cambio y un 25% en el momento de warning Soverini et al, BMC Cancer

20 Detección precoz de clones mutados, en paciente en tto de segunda línea con itk Estudio de mutaciones ABL KD, según ELN Al momento de fallo Adelantar el estudio al momento de Alarma Bacarrani, et al JCO 2013, Soverini et al, BMC Cancer Cuidado con las mutaciones compuestas, cuando se usa nested PCR Parker et al, Blood

21 Cuidado con el exceso de sensibilidad, errores de secuenciación Fox et al, Net Gen Seq A EL estudio de mutaciones es clave para establecer un tratamiento adecuado de los enfermos con LMC que no responde de forma adecuada al tratamiento 2.- Los estudios de mutaciones de ABL-KD se deben realizar en situaciones de alarma y fallo de tratamiento 3.- La presencia de mutaciones a baja frecuencia se debe tener en cuenta a la hora de indicar un tto itkd de segunda línea 4.- Hay que tener en cuenta las limitaciones de la NGS, a la hora de interpretar las mutaciones compuestas y de baja frecuencia

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