Biopsia Líquida: Experiencia del Hospital Clínico Universitario de Salamanca

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Emilio Marín Cáceres
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1 Biopsia Líquida: Experiencia del Hospital Clínico Universitario de Salamanca Rebeca Lozano Mejorada Hospital Clínico Universitario de Salamanca CNIO-IBIMA Genitourinary Cancer Clinical Research Unit

2 BIOPSIA LÍQUIDA

3 BIOPSIA LÍQUIDA Único sistema aprobado por FDA CellSearch Circulating Tumor Cell System (VERIDEX) Técnica FDA Volumen SP Principio Sensibilidad y Especificidad Veridex SI 7,5 ml Células epiteliales Alta RT-PCR NO 5-10 ml RNA Alta S, Baja E ISET NO 10 ml Tamaño celular Buena S, baja E Microchip NO 7,5 ml Células epiteliales Alta, en investigación Microfiltros NO 7,5 ml Tamaño celular Alta, en investigación Citometría de flujo NO 100 µl Células epiteliales Alta Caracterización molecular

4 NUESTRO MÉTODO 2011 Aislamiento y caracterización genómica mediante técnicas de citogenética molecular (sistema automatizado MetaFer-MetaCyte) Nos permite seleccionar células por tamaño y alteraciones citogenéticas.

5 Extracción de SP y separación por gradiente de densidad (Ficoll). - 80ºC

6 Extracción de SP y separación por gradiente de densidad (Ficoll). Primera fase: Contaje celular + detección de células genéticamente alteradas > 7 μm

7 Extracción de SP y separación por gradiente de densidad (Ficoll). Primera fase: Contaje celular + detección de células genéticamente alteradas PTEN CEP 10

8 Extracción de SP y separación por gradiente de densidad (Ficoll). Primera fase: Contaje celular + detección de células genéticamente alteradas. Segunda fase: Extracción DNA en plasma.

9 1. VALIDACIÓN METODOLÓGICA DE LA TÉCNICA

10 1. VALIDACIÓN METODOLÓGICA DE LA TÉCNICA 30 pacientes con Cáncer de Mama Estadio IV 15 controles Alteraciones en PTEN en CTCs mediante FISH Alteraciones en el exon 20 de PIK3CA en plasma mediante HRM Cizkova M, et al. Breast Cancer Research 2012.

Edad, años Media Mediana Rango Histología, N (%) CDI CLI Otros Receptores de estrógenos, N (%) Positivos Negativos Desconocido Receptores de progesterona, N (%) Positivos Negativos Desconocido HER2,

11 Edad, años Media Mediana Rango Histología, N (%) CDI CLI Otros Receptores de estrógenos, N (%) Positivos Negativos Desconocido Receptores de progesterona, N (%) Positivos Negativos Desconocido HER2, N (%) Positivo Negativo Desconocido Metástasis. N (%) Viscerales No viscerales (gg, óseas) Líneas de tratamiento previas, N (%) Tratamiento actual, N (%) Quimioterapia Hormonoterapia Terapias biológicas (80) 4 (13.3) 2 (6.7) 20 (66.7) 10 (33.3) 0 (0) 16 (53.3) 12 (40) 2 (6.7) 4 (13.3) 22 (73.4) 4 (13.3) 18 (60) 12 (40) 6 (20) 8 (26.7) 16 (53.3) 19 (63.3) 9 (30) 2 (6.7)

12 1. VALIDACIÓN METODOLÓGICA DE LA TÉCNICA De las 30 pacientes analizadas 10% 3 pacientes: No células > 7 μm. 27 pacientes: Células > 7 μm. 90% 44% PTEN 37% PIK3CA 56% 63%

13 1. VALIDACIÓN METODOLÓGICA DE LA TÉCNICA De las 30 pacientes analizadas 10% 3 pacientes: No células > 7 μm. 27 pacientes: Células > 7 μm. 90%

14 1. VALIDACIÓN METODOLÓGICA DE LA TÉCNICA De las 30 pacientes analizadas 10% 3 pacientes: No células > 7 μm. 27 pacientes: Células > 7 μm. 90% PIK3CA Mut PIK3CA wt TOTAL PTEN Del 5 (18,5%) 7 (26%) 12 (44,5%) PTEN wt 5 (18,5%) 10 (37%) 15 (55,5%) 62,9 % TOTAL 10 (37%) 17 (63%) 27 (100%)

15 N (%) PTEN Del N (%) PTEN Norm P (Χ 2 ) Histología CDI CLI Otros Receptores hormonales RE- RE+ RP- RP+ Desconocido Estado HER2 HER2- HER2+ Desconocido Metástasis Viscerales No viscerales Líneas de tratamiento (26.7) 3 (10) 1 (3.3) 3 (10) 9 (30) 1 (3.3) 9 (30) 2 (6.7) 9 (30) 1 (3.3) 2 (6.7) 12 (40) 0 (0) 2 (6.7) 1 (3.3) 9 (30) 16 (53.7) 1 (3.3) 1 (3.3) 7 (23.3) 11 (36.7) 11 (36.7) 7 (23.3) 0 (0) 15 (50) 1 (3.3) 2 (6.7) 6 (20) 12 (40) 18 (60) 7 (23.3) 7 (23.3) NS NS NS NS *0.000 NS

16 Distribución según subtipo intrínseco (subrogado) Luminal HER2 TN Desconocido PIK3CA PTEN 5 casos con asociación entre deleción de PTEN y mutación de PIK3CA LUMINAL Cizkova M, et al. Breast Cancer Research 2012 Jones N, et al IJC, 2012 Kalinsky K, et al. Clin Cancer Res 2009

17 2. VALIDACIÓN CLÍNICA DE LA TÉCNICA Total pacientes: 76 Pacientes excluidas: 6 Muestra no valorable Pacientes evaluables: 70 Pacientes con Cáncer de Mama Localizado (Estadios I-III)

18 PRÓSTATA A NOVEL CAPILLARY NANO-IMMUNOASSAY FOR ASSESSING ANDROGEN RECEPTOR SPLICE VARIANT 7 IN PLASMA. CORRELATION WITH CD133 ANTIGEN EXPRESSION IN CIRCULATING TUMOUR CELLS. A PILOT STUDY IN PROSTATE CANCER PATIENTS. AR-V7 Antonorakis ES, et al. N Engl J Med 2014 García J.L, Cruz J.J, et al. Clin Trans Oncol In Press

19 PRÓSTATA CD 133 Guzel E, et al. Cancer Res Frontiers 2015 Reyes EE, et al. J Transl Sci 2015 Pal SK, et al. Clin Genitourin Cancer 2015

20 PRÓSTATA AR and PTEN Claessens et al, Nat Rev Urol 2014 Dehm SM, Endoc Related Cancer 2011 Ferraldeschi R, Eur Urol 2015

PRÓSTATA A NOVEL CAPILLARY NANO-IMMUNOASSAY FOR

N: 72 Prostate Cancer patients Localized PCa

21 PRÓSTATA A NOVEL CAPILLARY NANO-IMMUNOASSAY FOR ASSESSING ANDROGEN RECEPTOR SPLICE VARIANT 7 IN PLASMA. CORRELATION WITH CD133 ANTIGEN EXPRESSION IN CIRCULATING TUMOUR CELLS. A PILOT STUDY IN PROSTATE CANCER PATIENTS. N: 72 Prostate Cancer patients Localized PCa Metastatic PCa (CRPC, Castration-näive) FACS FISH AR PTEN CD133+ CD45- CD34- García J.L, Cruz J.J, et al. Clin Trans Oncol In Press

22 PRÓSTATA A NOVEL CAPILLARY NANO-IMMUNOASSAY FOR ASSESSING ANDROGEN RECEPTOR SPLICE VARIANT 7 IN PLASMA. CORRELATION WITH CD133 ANTIGEN EXPRESSION IN CIRCULATING TUMOUR CELLS. A PILOT STUDY IN PROSTATE CANCER PATIENTS. AR-V7 1. Cell lines VCaP (Positive control) PC3 (Negative control) García J.L, Cruz J.J, et al. Clin Trans Oncol In Press

23 PRÓSTATA A NOVEL CAPILLARY NANO-IMMUNOASSAY FOR ASSESSING ANDROGEN RECEPTOR SPLICE VARIANT 7 IN PLASMA. CORRELATION WITH CD133 ANTIGEN EXPRESSION IN CIRCULATING TUMOUR CELLS. A PILOT STUDY IN PROSTATE CANCER PATIENTS. AR-V7 1. Cell lines VCaP (Positive control) PC3 (Negative control) 2. Healthy donors 3. PCa patients García J.L, Cruz J.J, et al. Clin Trans Oncol In Press

24 PRÓSTATA AR-V7 GLEASON SCORE N:51 (%) AR-V7 + N:21 (%) TOTAL N:72 (%) GS 6 8 (16) 2 (9,5) 10 (14) p-values GS 7 12 (23) 8 (38) 20 (28) NS GS 8 29 (57) 9 (43) 38 (53) Not available 2 (3,9) 2 (9,5) 4 (5,5) CRPC M1 Localization Yes 30 (59) 15 (71) 45 (62) NS No 21 (41) 6 (29) 27 (37) Yes 38 (74) 18 (86) 56 (78) NS No 13 (25) 3 (14) 16 (22) Bone Only 20 (53) 6 (33) 26 (46) NS Lymph node only 3 (7,9) 1 (5,6) 4 (7,1) Bone and LN 10 (26) 6 (33) 16 (29) Treatment Visceral 5 (13) 5 (28) 10 (18) Local 9 (18) 2 (9,5) 11 (15) NS ADT 13 (25) 2 (9,5) 15 (21) Abi/Enza 12 (24) 3 (14) 15 (21) Chemotherapy 13 (25) 12 (57) 25 (35) Corticosteroids 4 (7,8) 2 (9,5) 6 (8,3) PSA (Median) 14,7 (0, ) CD133+ (Median) 3 (0 1922) 672,50 (2,7 1349) 7 (1 81) 23 (0, ) 4 (0 1922) p<0.05 NS 81% Gleason 7 AR-V7+ 29 % 71% CRPC 86% M1 Median PSA (672 Vs 14) Median CD133+ (7 Vs 3) García J.L, Cruz J.J, et al. Clin Trans Oncol In Press

25 PRÓSTATA A NOVEL CAPILLARY NANO-IMMUNOASSAY FOR ASSESSING ANDROGEN RECEPTOR SPLICE VARIANT 7 IN PLASMA. CORRELATION WITH CD133 ANTIGEN EXPRESSION IN CIRCULATING TUMOUR CELLS. A PILOT STUDY IN PROSTATE CANCER PATIENTS. CD % patients (69/72) In half of patients (37/72 51%) 4 CD133+ AR amplification 60 cases analyzed 4 CD AR amplification (81%) PTEN deletion 59 cases analyzed 4 CD PTEN deletion (72%) García J.L, Cruz J.J, et al. Clin Trans Oncol In Press

BIOPSIA LÍQUIDA: CONCLUSIONES La detección y aislamiento de CTCs nos permite no sólo cuantificar, si no también estudiar alteraciones genómicas específicas.

26 BIOPSIA LÍQUIDA: CONCLUSIONES La detección y aislamiento de CTCs nos permite no sólo cuantificar, si no también estudiar alteraciones genómicas específicas. En CMM se ha realizado la validación metodológica de la técnica MetaFer- MetaCyte para la detección de CTCs por tamaño y alteraciones moleculares. Análisis de alteraciones en dos genes implicados en la misma cascada de señalización, como son PTEN y PIK3CA. Sus alteraciones pueden tener efectos aditivos o sinérgicos a través de las rutas funcionales no canónicas. En cáncer de próstata se ha realizado la validación metodológica de una técnica novedosa y relativamente sencilla para la detección de AR-V7 en plasma. Existe asociación entre el status de AR-V7 y la presencia de células CD133+, amplificación del AR y deleción de PTEN.

27 LÍQUIDA BIOPSIA EXPERIENCIA: Conocimiento de algo, o habilidad para ello que se adquiere al haberlo realizado, vivido, sentido o sufrido una o más veces.

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