Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

Transcripción

1 Células tumorales y ADN circulante, nuevos marcadores en el Laboratorio Clínico Luis Francisco Sáenz Mateos. Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca-IMIB/FFIS, Murcia.

2 Circulante

3 ADN Circulante Material genético liberado por las células al torrente sanguíneo. En forma de fragmentos de pequeño tamaño.

4 ADN Circulante Para su detección se usa la PCR digital

5 ADN Circulante- Laboratorio Clínico Cáncer mama (metastásico) Imágenes Tumores Vs ctdna-ca15-3-ctcs ctdna detectado 29 de 30 mujeres (97%) CA15-3 detectado 21 de 27 mujeres (78%) CTCs detectadas en 26 de 30 mujeres (87%) Los niveles ctdna mostraron mayor correlación con cambios en la masa tumoral. Biomarcador informativo, específico y muy sensible en el Cáncer de mama.

6 ADN Circulante- Laboratorio Clínico Cáncer >75% ctdna detectable Ca. AVANZADO Páncreas, ovario, colorrectal, vejiga, gastroesofágico, mama, melanoma, hepatocelular y de cabeza y cuello. 50% - 70% ctdna detectable tumores LOCALIZADOS colorrectal, gastroesofágico, páncreas y mama <50% ctdna detectable tumores PRIMARIOS cerebro, renal, próstata o de tiroides

7 ADN Circulante - Laboratorio Clínico Cáncer-Epigenética-Metilación Grado de metilación es crucial en la regulación de la expresión de genes que controlan funciones celulares importantes en el desarrollo del cáncer Grupos Metilo

8 Epigenetica- Metilación Existe mucho interés en el estudio de la metilación del ADN en el cáncer colorrectal (CCR) Se han descrito 50 genes con alteraciones somáticas del grado de metilación en distintos estadios del CCR identificándose así como un potencial biomarcador. Septina 9 metilada

9 Método detección ms9 Plasma EDTA 5 ml Extracción DNA Conversión Bisulfito Citosina Uracilo DNA NO metilado Purificación Bis DNA Amplificación Detección

10 Resultados - ms9 POSITIVO COLONOSCOPIA SINTOMATOLOGÍA SANGRE HECES COLONOSCOPIA SIGMOIDOSCOPIA POBLACIÓN RIESGO NEGATIVO NO SINTOMATOLOGÍA Repetir ms9 a 2 años NO RIESGO

11 ADN Circulante - Laboratorio Clínico Estudios prenatales ctdna fetal en sangre periférica materna = posibilidad de realizar diagnósticos prenatales sin necesidad de utilizar técnicas obstétricas invasivas para la obtención de material genético fetal. Sexo (secuencias de los genes SRY y DYS14) RH (exones 5, 7 y, ocasionalmente, exón 10 del gen RhD) Aneuploidias (cromosomas X, Y, 21, 18, 13) Enfermedades monogénicas (Huntington, distrofia miotónica, distonía de desarrollo precoz, B-talasemia, fibrosis quística, etc)

12 Circulante

13 Células tumorales Circulantes (CTCs) Descritas por primera vez por Asworth en 1869 en pacientes con cáncer Su presencia significaba progresión de la enfermedad neoplásica y se relacionaba directamente con la aparición de metástasis tumorales

14 Células tumorales Circulantes (CTCs) No existían técnicas que permitieran su aislamiento e identificación. Con las técnicas actuales sabemos: Que poseen alteraciones genómicas propias de células malignas Rara vez se encuentran en sangre periférica de personas sanas Su destino: gánglios linfáticos médula ósea sangre periférica finalmente órganos distales

15 Células tumorales Circulantes (CTCs)

16 Células tumorales Circulantes (CTCs) Se estima 1 CTC por cada 10^6-10^7 células mononucleares en sangre periférica (PBMC) en pacientes con cáncer. Enriquecimiento preanalítico basado en propiedades fisicoquímicas Técnicas de Inmunoseparación

17 Enriquecimiento basado en propiedades fisicoquímicas de las CTCs Tamaño ISET MEMS Densidad PBMC + CTCs Tampón lisis Ficoll Lymphoprep Oncoquick Citocentrifugación

18 Células tumorales Circulantes (CTCs) Oncoquick

19 CTCs Técnicas de inmunosepación

20 CTCs Cell Search Aprobado por la FDA para cáncer de mama, colon y próstata Detecta en sangre periférica una CTC por cada 10^5-10^7 PBMC mediante inmunomagnetismo Fiable y reproducible

21 CTCs Cell Search

22 CTCs Cell Search - Objeciones Citoqueratinas en otros tipos celulares Células epiteliales en sangre periférica en determinadas condiciones fisiopatológicas: Inflamación Cirugía Enfermedades proliferativas epiteliales benignas Traumas Transición epitelial-mesenquimal (EMT)

23 CTCs Concepto EMT

24 CTCs IsofluxTM System Alta recuperación y pureza de CTC. Anticuerpos de captura definidos por el usuario. No es una plataforma cerrada. Bajo volumen de elución, <5 μl. Formato de elución compatible con técnicas moleculares. Puede procesar hasta 4 muestras al mismo tiempo. Control de temperatura a 4 ºC para evitar uniones inespecíficas. Fácil transferencia de las CTC para análisis posteriores.

25 CTCs IsofluxTM System

26 CTCs IsofluxTM System Contaje celular Análisis de Mutaciones por qpcr (KRAS, EGFR y BRAF) Expresión génica RT-qPCR (Her2) FISH

27 CTCs Laboratorio Clínico El número de CTCs detectadas en sangre ha sido correlacionado con: Desarrollo de metástasis Supervivencia libre de progresión (PFS) Supervivencia general (OS) Su disminución o desaparición indica la respuesta favorable a un tratamiento y su persistencia resistencia al mismo En pacientes sin evidencia de metástasis, puede brindar un pronóstico de la evolución de la enfermedad y contribuye en la elección del tratamiento para prevenir su recidiva

28 CTCs en Hepatocarcinoma

29 CTCs en Hepatocarcinoma El carcinoma hepatocelular (HCC) representa el 80-90% de las neoplasias primarias del hígado y cerca del 5% de todas las neoplasias malignas. El HCC aparece en más del 90% de los casos sobre una cirrosis hepática La incidencia en España es intermedia (5-10 casos por habitantes) ascenso en los últimos años, en relación con la evolución de la epidemia de VHC, principal factor de riesgo en nuestro país

30 CTCs en Hepatocarcinoma- Factores de riesgo Cirrosis VHB Coinfección VHC, VHD, VIH VHC Coinfección VHC, VHD, VIH y fibrosis avanzada Exposición a aflatoxinas Alcoholismo

31 CTCs en Hepatocarcinoma - Diagnóstico Ecografía Pruebas de imagen dinámicas Tomografía computadorizada (TC) cuatrifásica Angio-resonancia magnética (RM)

32 CTCs en Hepatocarcinoma - Diagnóstico Arterial lenta venoso rápido Otras pruebas

33 CTCs en Hepatocarcinoma - Estadificación Sistema BCLC (Barcelona Clinic Liver Cancer) Variables pronósticas: Tamaño tumoral Disfunción hepática subyacente Presencia de síntomas Vincula cada grupo pronóstico con una recomendación terapéutica Detección de ctdna y CTCs Patrones de expresión génica Nuevos marcadores bioquímicos

34 CTCs en Hepatocarcinoma - Estadificación

35 CTCs en Hepatocarcinoma - Tratamiento En el HCC es necesaria una cuidadosa selección de los candidatos para cada opción terapéutica Curativos: Resección quirúrgica Ablación percutánea Quimioterapia sistémica con sorafenib Trasplante Inyección percutánea de etanol (IPE) La radiofrecuencia (RF)

36 CTCs - HCC Tratamiento - Trasplante Ideal porque resuelve el problema tumoral y la enfermedad de base sobre la que asienta, la cirrosis hepática Con los criterios de Milán se han constatado supervivencias por encima del 70% a los 5 años, con una tasa de recurrencia de menos de un 15% Criterios de Milán: Lesión única igual o menor de 5 cm Máximo de 3 lesiones iguales o menores de 3 cm, sin invasión vascular ni enfermedad extrahepática

37 CTCs - HCC Tratamiento - Trasplante Principal problema es la disminución de la supervivencia en el trasplante. Número limitado de donaciones Incremento del número de candidatos Aumento del tiempo de espera Mayor progresión tumoral Exclusión del 25% de los pacientes si la lista de espera supera los 12 meses

38 CTCs - HCC Tratamiento - Trasplante Soluciones? Aumento del número de donantes Escala MELD de priorización Tratamientos locorregionales durante el tiempo en lista de espera Ablación por radiofrecuencia Quimioembolización transarterial (TACE) Coste-efectivo si la lista de espera es superior a los 6 meses

39 CTCs - HCC Tratamiento Trasplante - TACE En el progresivo crecimiento tumoral del HCC el aporte sanguíneo se vuelve cada vez más dependiente de un origen arterial La TACE consiste en la combinación de la obstrucción arterial tumoral y la aplicación de quimioterapia local Adriamicina Y Cisplatino Gelfoam coils metálicos alcohol polivinilo

40 CTCs - HCC Tratamiento Trasplante - TACE

41 CTCs - HCC Tratamiento Trasplante - TACE Indicación de la TACE Tumor multinodular Sin invasión vascular Ni extensión extrahepática Pacientes asintomáticos Función hepática conservada Rendimiento de la TACE dudoso Supervivencia global El estadio intermedio abarca una población muy heterogénea No todos los pacientes de este grupo se beneficiarán de igual modo El tejido tumoral residual recupera su irrigación y el tumor continúa creciendo No está demostrado cuál es el mejor esquema de tratamiento, a intervalos regulares o a demanda

42 CTCs - HCC Tratamiento Trasplante - TACE Nuevo sistema DEB (drug eluting beads)-tace Consiste en esferas de alcohol polivinilo cargadas de Adriamicina Ventajas: Mayor concentración de agente quimioterápico de una forma más sostenida en el tiempo Menor liberación del fármaco a nivel de la circulación sistémica reduciendo la toxicidad y aumentando la tolerancia Permite elegir el tamaño de las partículas en función del calibre del vaso que se va a embolizar (más homogéneo y reproducible)

43 CTCs - HCC Tratamiento Trasplante - TACE La DEB-TACE es mejor tolerada globalmente y genera un mayor beneficio en los pacientes con perfil más desfavorable dentro del estadio intermedio. Futuros estudios deben profundizar en la valoración de los efectos de la TACE en los diferentes subgrupos de pacientes dentro del estadio intermedio y seleccionar así los candidatos adecuados para optimizar los resultados. Es necesario el desarrollo de nuevas técnicas y la búsqueda y validación de nuevos criterios que permitan valorar fielmente la eficacia de las terapias moleculares en los pacientes con HCC.

44 Proyecto - CTCs - Hepatocarcinoma Pre TACE Post TACE Post Tx Post Tx 6 meses CTCs Cell Search Isoflux CTCs Expresión génica RT-qPCR Marcadores bioquímicos

45 Proyecto - CTCs HCC Cell Search CTCs Cell Search Cell Search HCCp1 HCCp2 HCCp3 HCCp4 HCCP5 HCCP6 HCCP7 CTCs pre TACE / CTCs posttace/ CTCs post TOH / 7.5 ml 7.5 ml 7.5 ml /7 14.3%

46 Proyecto - CTCs HCC - IsofluxTM System Isoflux CTCs pre TACE / 7.5 ml CTCs posttace/ 7.5 ml CTCs post TOH / 7.5 ml CTCs Isoflux HCCp1 44 HCCP5 20 HCCP6 33 HCCP7 3 4/4 100%

47 Proyecto - CTCs HCC RT-qPCR CTCs Expresión génica RT-qPCR Hep G2 CTCs - 80ºC Extracción RNA RT- qpcr

48 Proyecto - CTCs - HCC - Bioquímica Biobanco Marcadores bioquímicos Plasma Suero ADN Marcadores de función hepática Marcadores tumorales Marcadores de Recidiva (Self-seeding) tras trasplante Marcadores de inflamación/rechazo Otros marcadores ADN circulante?

49 Objetivos del proyecto Hepatocarcinoma Determinar el perfil de CTCs en sangre periférica pre y post-tace en pacientes con hepatocarcinoma sometidos a un trasplante. Correlacionar estos hallazgos con la respuesta tumoral del HCC a la TACE y con la supervivencia libre de enfermedad tras el trasplante. Comparar y evaluar el método CellSearch, Isoflux y los métodos genéticos indirectos basados en la expresión de mrnas específicos, para detectar las CTCs en pacientes con HCC pendientes de trasplante.

50 Grupo de Investigación multidisciplinar Servicio Cirugía/Unidad de trasplantes Dr. Pablo Ramírez Romero Dr. Pascual Parrilla Paricio María del Rocío González Sánchez Servicio de Inmunología Dr. Alfredo Minguela Puras María Victoria Martínez Sánchez Unidad de Cirugía experimental Dr. Alberto Baroja Mazo Dra. Beatriz Revilla Nuin Servicio Análisis Clínicos Dr. José Antonio Noguera Velasco María Isabel Sánchez Lorencio Dr. Luis Francisco Sáenz Mateos Servicio Análisis Clínicos Hospital Clínico San Carlos Madrid Dra. María Luisa Maestro De Las Casas Silvia Veganzones De Castro Virginia De La Orden García Beatriz Mediero Valeros

51 Conclusiones generales La estandarización de estas técnicas para la determinación de ctdna y CTCs en los laboratorios clínicos asistenciales es hoy día relativamente sencilla. La detección de este tipo de células y su estudio genético en profundidad, podría ser una herramienta útil para la individualización del tratamiento del cáncer Esto permitiría tomar decisiones terapéuticas que aumenten la supervivencia de los pacientes con cáncer.

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