Seminario Taller de Citogenética y Discusión de Resultados del Programa EEDDCARIO INAS Septiembre 19 de 2013

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1 PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO PARA LABORATORIOS DE CITOGENÉTICA CLÍNICA - EEDDCARIO Seminario Taller de Citogenética y Discusión de Resultados del Programa EEDDCARIO INAS Septiembre 19 de 2013

2 Análisis de mutaciones en el dominio Tirosina quinasa BCR-ABL, en pacientes con leucemia mieloide crónica GONZALO VÁSQUEZ PALACIO Biol. Esp. MSc Profesor: Unidad de Genética Médica Facultad de Medicina Universidad de Antioquia Fecha: septiembre 19, 2013

3 Agenda Introducción Leucemia Mieloide Crónica Citogenética del cromosoma Ph+ Biología Molecular LMC Era del Imatinib Mutaciones DTK Proyecto Mutaciones en pacientes Colombianos Conclusiones

4 INTRODUCCIÓN

5 Cantidad de búsquedas 300 Búsquedas PUBMED por año "FISH" and "Leukemia" Series1,

6 Cantidad de búsquedas 600 Búsquedas por año "PCR" and "Leukemia" Series

7 Cantidad de búsquedas 250 Búsquedas por año "Cytogenics" and "Leukemia" Series1 50 0

8 INCIDENCIA Y MORTALIDAD DE CÁNCER

9 INCIDENCIA Y MORTALIDAD DE CÁNCER

10 Leucemia mieloide crónica

11 lmc La leucemia mieloide crónica (LMC) es un neoplasma mieloproliferativo que se origina a partir de células madre pluripotenciales anormales en médula ósea y se asocia con la fusión génica BCR-ABL1 localizada en el cromosoma Filadelfia Ph+. Swerdlow SH, Campo E, Lee Harris N, Jaffe ES, Pileri SA, Stein H, Thiele J, Vardiman JW. WHO classification of tumours of haematopoietic and Lymphoid tissues. WHO

12 Hematopoyesis

13 Modelo de progresión LMC

14 CITOGENÉTICA

15 P.NOWELL, D HUNGERFORD - JANET D. ROWELY 1960 Peter Nowell y David Hungerford ( Ph ) 1973 Janet D rowely t(9;22)(q34;q11)

16

17

18 Biología molecular

19 Métodos de diagnóstico Ph+ J Cancer Res Clin Oncol (2011) 137:

20 gen de fusión BCR-ABL1 Expresa una oncoproteína de fusión con aumento de la actividad tirosinaquinasa (TK).

21 Gen de fusión BCR-ABL1 puede incluir el exón 14 del gen BCR

22 Los puntos de quiebre genómicos pueden variar entre pacientes pero, siempre se producen uno de dos transcriptos primarios. (b2a2 ) (b3a2)

23 Era del imatinib

24 Imatinib Louise N. Johnson.ord, Oxford. Proteinkinaseinhibitors: contributions from structure to clinical compounds. Quarterly Reviews of Biophysics 42, 1 (2009), pp

25 Gambacorti-P.C, Gunby. RH, Piazza R., Galietta A, Rostagno R, and Scapozza L. Molecular mechanisms of resistance to imatinib in Philadelphia-chromosome-positive leukaemias. THE LANCET Oncology Vol 4 February 2003

26 Mecanismo de acción del Imatinib DRUKER BLOOD, 15 DECEMBER 2008 VOLUME 112, NUMBER 13

27 Mutaciones dtk

28 CATEGORIA DE LAS MUTACIONES Las mutaciones se pueden clasificar en 4 categorías: Las que impiden la unión de Imatinb al sitio Catalítico Ocurren dentro del P-Loop Ocurren dentro el sitio activo del P-Loop e Impiden la unión del Imatinib a la Forma Inactiva. Ocurren dentro dominio catalítico e impiden la fosforilación.

29 Modelo de progresión y resistencia LMC

30 Curso Clínico LMC Células madre hematopoyéticas normales 1era Mutación Eventos mutagénicos Expansión clonal de la población de progenitores pre-malignos (Ph negativo/bcr/abl: negativo) 2da Mutación. Origen BCR/ABL en clon Stem cell premaligno Prefase de LMC. Ph +, BCR/ABL: positivo. Conteos celulares sanguíneos normales, clínicamente silenciosos Eventos oncogénicos adicionales en la transformación del clon Stem Cell. Fase crónica de LMC. BCR/ABL como el blanco y el factor oncogénico más importante que contribuye a la supervivencia de las células leucémicas.

31 Curso Clínico LMC Células madre hematopoyéticas normales Futuras mutaciones oncogénicas Progresión Fase acelerada de LMC. BCR/ABL permanece como el factor más importante pero adicionalmente otras moléculas oncogénicas participan en el crecimiento de las células leucémicas Futuras mutaciones oncogénicas que permiten la maduración proliferación y Progresión Fase blástica de LMC. BCR/ABL permanece como un co-factor, pero otros mecanismos conducen a la progresión a síndrome similar a LMA con abundante proliferación celular y detenimiento en la maduración celular

32 Seguimiento molecular BCR-ABL (RT-PCR)

33 BCR-ABL1/BCR% Incremento de la probabilidad de mutaciones en el gen de fusión BCR-ABL Imatinib 400 N N N N M M E453G 2.1- PTO. RES. Standardised baseline Reducción Log Estudio STI571 Pre 3 IRIS Meses desde el inicio de tratamiento con Imatinib Hughes, Branford et al, 2006

34 Mapa de mutaciones: 4 regiones críticas de TKD

35 GUÍAS DE SEGUIMIENTO LMC

36 FASE CRÓNICA Aspirado y biopsia M.O Sangre periférica Morfológica Citogenética FISH Biología molecular (QPCR) % de blastos % de basófilos t(9;22)(q34;q11) UGM nuc ish(abl1,bcr)x3(abl1 con BCRx2) UGM Ejemplo de amplificación y curva estándar para la cuantificación del transcripto p210. UGM.

37 El seguimiento inicial requerimiento para una respuesta óptima

38 El seguimiento a los 12 meses

39 El seguimiento al los 18 meses

40 DETECCIÓN DE MUTACIONES EN EL DOMINIO TIROSINA QUINASA DE BCR-ABL EN PACIENTES COLOMBIANOS CON LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA (LMC), RESISTENTES AL IMATINIB GONZALO VÁSQUEZ PALACIO Biol. Esp. MSc Coinvestigadores Carlos Muskus PhD José domingo Torres MD Hematologo

41 Proyecto DETECCIÓN DE MUTACIONES EN EL DOMINIO TIROSINA QUINASA DE BCR-ABL EN PACIENTES COLOMBIANOS CON LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA (LMC), RESISTENTES AL IMATINIB HIPÓTESIS La presencia de mutaciones en el dominio Tirosina QUINASA del gen fusión BCR-ABL confieren resistencia al tratamiento con Imatinib en pacientes colombianos con LMC. OBJETIVO GENERAL Detectar las mutaciones en la región génica que codifica para el dominio Tirosina Quinasa del gen de fusión BCR-ABL, y que se asocian con falla en la respuesta al tratamiento con Imatinib en pacientes colombianos con LMC OBJETIVOS ESPECÍFICOS Identificar mutaciones nuevas o informadas, mediante secuenciamiento de la región génica ABL del gen fusión BCR- ABL, en pacientes que no responden a la terapia con Imatinib.

42 Metodología Población : 50 pacientes LMC en TTO con imatinib y resistentes. Secuencia de 869-bp región de BCR ABL que corresponde a el sitio de unión al ATP y horquilla de activación del dominio TK Punto de mutación en el sitio de unión al ATP del dominio kinasa Abl confiere resistencia a STI-57 en pacientes con recaída.

43 PRIMER PCR ANIDADA

44 Metodología Pacientes con LMC. TTO Imatinib Resistencia Consentimiento Informado CLC Main Workbench

45 Proyect o MUTACIONES EN PACIENTES COLOMBIANOS E255K H396P Sec. Ref PM11 Sec. Ref PM34 Mutación encontrada en 2 pacientes (PM11, PM40) Mutación encontrada en la muestra PM34

46 ALGUNAS MUTACIONES INFORMADAS

47 DETECCIÓN DE MUTACIONES EN EL DOMINIO TIROSINA QUINASA DE BCR-ABL EN PACIENTES COLOMBIANOS CON LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA (LMC), RESISTENTES AL IMATINIB

48 Altamente Resistentes Resistentes Moderadamente resistentes Sensibles Brandford et al, 2009

49 conclusiones

50 CONCLUSIONES 1. Las mutaciones Y253F/H, E255V,H396P/R y T315I confieren resistencia a inhibidores TKS. 2. La detección temprana de mutaciones de mutaciones durante el tratamiento, puede ayudar a la estratificación de los pacientes para la toma de desiciones. 3. Los laboratorios de diagnóstico para malignidades hematológicas deben implemtar las técnicas: Citogenética, FISH y biología molecular. 4. Las publicaciones en este campo tendrán cada día un mayor impacato en la producción científica.

51 Propósito

52 Compañeros de la Unidad de Genética Médica. Doctores: Carlos Enrique Muskus. José Domingo Torres. Gentica Lab Novartis Pacientes Hospitales Agradecimientos

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