REVISTA CUADERNOS Vol. 51-2/2006. DNA-UMSAgen, EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO PARA DIAGNÓSTICO MOLECULAR: MÉTODO RÁPIDO Y ECONÓMICO

Transcripción

1 REVISTA CUADERNOS Vol. 51-/006 ARTICULO ORIGINAL -UMSAgen, EXTRACCIÓN DE GENÓMICO PARA DIAGNÓSTICO MOLECULAR: MÉTODO RÁPIDO Y ECONÓMICO Ricardo Amaru*, Hortencia Miguez*, Rosario Peñaloza*, Gina Torres*, Julio Silvestre*, Heriberto Cuevas*. RESUMEN INTRODUCCIÓN El estudio del ácido desoirribunocleíco () es imprescindible para la medicina moderna; por ello, se ha diseñado diferentes técnicas para su etracción, cuyos costos son altos y de tiempo prolongado. En este trabajo se describe un método modificado de etracción de (-UMSAgen) basado en la técnica de Miller. MÉTODOS Las células mononucleares fueron obtenidas de sangre venosa periférica de un sujeto voluntario, para realizar 40 etracciones de ; 0 con el método modificado -UMSAgen y otros 0 con el método clásico. Posteriormente se evaluó la concentración, calidad y utilidad de estos etraídos. RESULTADOS La pureza del etraído por el método -UMSAgen es de similar al de la técnica clásica 1, las concentraciones obtenidas son 0,4 ug/6 cel y ug/6 cel respectivamente. La evaluación por electroforesis en agarosa y la amplificación del eon 1 del gen JAK por PCR fue satisfactoria. CONCLUSIÓN El método -UMSAgen es una alternativa de etracción de genómico, rápido y económico, adecuado para países en vías de desarrollo. PALABRAS CLAVES Rev. Cuadernos 006; 51 (): - /, etracción, espectrofotometría, PCR, electroforesis en agarosa ABSTRACT INTRODUCTION is the genetic material of the cell. Actually for its study, laboratory techniques are available that require its etraction free of impurities. This paper describes the -UMSAgen method as an alternative for etraction which is based on the Miller technique. METHODS The mononuclear cells were obtained of venous peripheral blood of a voluntary subject, for to realize 40 s etractions; 0 with the modified method -UMSAgen and other 0 with the classic method. Later there was evaluated the concentration, quality and utility of these etracted. RESULTS The purity etracted by the -UMSAgen method is similar to the classic technique 1, the concentration obtained were 0,4 ug/6 cells and ug/6 cells respectively. The evaluation by agarose gel electrophoresis and the amplification of the eon 1 of the JAK gen by PCR was successful. CONCLUSION The -UMSAgen etraction method is a very acceptable fast, easy and inepensive alternative method for underdeveloped countries for etraction. KEY WORDS, etraction, spectrophotometry, PCR, agarose gel electrophoresis. * Unidad de Biología Celular, Departamento de Ciencias Funcionales, Facultad de Medicina, UMSA, La Paz, Bolivia Rev. Cuadernos 006; 51 (): - / Amaru R. Miguez H. Peñaloza R. Torres G. Silvestre J. Cuevas H.

2 Vol. 51-/006 REVISTA CUADERNOS INTRODUCCIÓN El ácido desoirribonucleico () es el material genético de las células eucarióticas 1 cuya manipulación y análisis es imprescindible para el estudio de las bases moleculares en las enfermedades; actualmente diversos métodos de biología molecular permiten etraer desde virus hasta células humanas,3. Para la etracción del se requiere aislar proteínas, polisacáridos y lípidos; además, el material utilizado en el proceso de etracción debe estar libre de DNasa asociado a manipulación cuidadosa para evitar su degradación 3,4. A diferencia del método clásico, el método modificado -UMSAgen no utiliza proteínasa K ni fenol cloroformo para la etracción del. El presente trabajo describe un método modificado de etracción de genómico a partir de la técnica de Miller (5) que es rápido y económico. MATERIAL Y MÉTODOS Las células mononucleares fueron separadas por gradiente de concentración en Histopaque 77 (Sigma - Aldrich, Reino Unido) a partir de ml sangre venosa periférica de un sujeto voluntario, posteriormente las células mononucleares fueron alicuotadas a una concentración de 1 6 en tubos Eppendorf y conservadas a -0 ºC. REACTIVOS NLB (nuclear lysis buffer) mm Tris-HCl ph 8, (Tris-hidroimetilaminometano) 0,4 M Na Cl (Cloruro de sodio) mm Na EDTA ph 8,0 (Acido Etilendiamino tetraacético sal disódica) Disolver 3,37 g de Na Cl en 00ml de agua destilada, agregar ml de Tris-HCl 1M ph 8, y ml de Na EDTA ph 8 enrasar a 1 litro con agua destilada. SDS % p/v (dodecil sulfato de sodio) Disolver 0 g de SDS en 1 litro de agua destilada a 0ºC en baño maría. Mezclar 300 ml de NLB con 0ml de SDS al %, antes de usar. Na Cl 6M (cloruro de sodio saturado) Disolver 350,64 g de NaCl en 800 ml de agua destilada después de agitar por 30 minutos enrasar a 1 litro con agua destilada. Acetato de sodio 3M CH3COONa (acetato de sodio) Disolver 4,6 g de acetato de Na en 0 ml de agua destilada. Solución de lisis para glóbulos rojos X NH4Cl (cloruro de amonio) KHCO3 (bicarbonato ácido de potasio) Na EDTA ph 8,00 (Acido Etilendiamino tetraacético sal disódica) Disolver 8, g de NH4Cl, g KHCO3 y 370 mg de Na EDTA en 800 ml de agua destilada y enrasar a 1litro. Pasar por filtro de 0,45um y diluir 1: antes de usar. EXTRACCIÓN DEL GENÓMICO CON EL MÉTODO -UMSAgen. Resuspender el sedimento de células (1 6) en 00 µl de NLB-SDS. Agregar 300 µl de cloruro de sodio 6 M, luego agitar en vorte por un minuto. Agregar 600 µl de cloroformo. Mezclar por inversión durante 5 minutos hasta observar una solución homogénea. Centrifugar a 4000 rpm durante 5 minutos. Recuperar la fase superior en otro tubo Agregar 600 µl de cloroformo - alcohol isoamílico 4:1. Mezclar por inversión durante 5 minutos hasta observar una solución homogénea. Centrifugar a 4000 rpm durante 5 minutos. Recuperar la fase superior en otro tubo Agregar 30 µl de acetato de sodio 3M. Agregar 1 ml de alcohol absoluto frío (conservado a -0ºC). Mezclar hasta la visualización del precipitado. Sacar el precipitado con una aguja hipodérmica G1 y depositarlo en otro tubo Resuspender en 1ml de etanol al 70% (conservado a -0ºC) Centrifugar a rpm durante 5 minutos. Desechar el sobrenadante y dejar secar el a medio ambiente. Resuspender en 0 µl de agua tridestilada. Dejar una noche a temperatura ambiente para 1 -UMSAgen, EXTRACCIÓN DE GENÓMICO PARA DIAGNÓSTICO MOLECULAR: MÉTODO RÁPIDO Y ECONÓMICO

3 REVISTA CUADERNOS Vol. 51-/006 su disolución completa. Conservar a 4ºC. EXTRACCIÓN DEL GENÓMICO CON EL MÉTODO CLÁSICO. Resuspender el sedimento de células (1 6) en 480 µl de TNE 1. Agregar 0 µl de SDS % y 0 µl de proteinasa K (0 mg/ml). Incubar en baño maría a 37 ºC por 1 horas. Agregar 600 µl de fenol - cloroformo (1:1). Mezclar por 5 minutos hasta su homogenización. Agregar 600 µl de cloroformo/alcohol isoamílico (4:1). Mezclar por 5 minutos hasta su homogenización. Agregar 50 µl de acetato de sodio 3 M. Agregar 1 ml de etanol absoluto frío (-0ºC). Agitar gentilmente y esperar su precipitación. Centrifugar a rpm por 5 minutos. Desechar el sobrenadante. Agregar 1ml de etanol al 70% conservado a -0ºC. Centrifugar a rpm por 5 minutos. Desechar el sobrenadante. Secar el a medio ambiente. Agregar 0 µl de agua tridestilada y dejar por una noche a temperatura ambiente para su disolución completa. Conservar a 4ºC. separación electroforética en gel de agarosa al 0.8% con bromuro de etidio, migrado a 80 V por 60 minutos. En la migración se utilizó el marcador de pares de bases: Marker II. Se consideró de alta calidad, a la presencia de bandas iguales o superiores a bp. ANÁLISIS DE PUREZA DE La pureza del se calculó mediante la relación entre la absorbancia a 60 nm y 80 nm; considerando de alta pureza a valores igual a 1.8 ± 0.1. AMPLIFICACIÓN DE El genómico se amplificó mediante la técnica del PCR (reacción en cadena de polimerasa) utilizando primers del eon 1 del gen Jak de acuerdo a protocolo establecido 6. Los productos amplificados fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al % con bromuro de etidio. RESULTADOS Se realizaron 40 etracciones de genómico a partir de 1 6 células mononucleares, 0 por el método -UMSAgen y 0 por el método clásico. Las concentraciones de fueron 0.4 µg y µg por 6 células mononucleares por el método -UMSAgen y Clásico respectivamente (cuadro 1 y ). La pureza del etraído fue 1.88 para el método -UMSAgen y 1.1 por el método clásico (cuadro 1 y ). CUADRO 1 ANÁLISIS CUANTITATIVO DEL. La concentración de se determinó por espectrofotometría UV a 60 nm en una solución diluida de 1/50. El cálculo se realizó con la siguiente fórmula: Absorbancia 60nm 50 dilución 00 ANÁLISIS CUALITATIVO DEL = µg/µl La calidad del se evaluó mediante la Etracción de por el método -UMSAgen Muestra g/ 6 cel,5,5 38,5 0,5,8 4,5 Rev. Cuadernos 006; 51 (): - / Amaru R. Miguez H. Peñaloza R. Torres G. Silvestre J. Cuevas H. Abs 60/80 6

4 Vol. 51-/006 REVISTA CUADERNOS ,5 6, ,40 CUADRO. 6 6 FIGURA 1. Migración de etraído con método -UMSAgen y Clásico. A M II 1 3 Etracción de por el método clásico Muestra g/ 6 cel ,5 3,5, 80 5,5 3,5 73, 5, Abs 60/ Los resultados de la concentración del etraído por ambos métodos son estadísticamente diferentes y en referencia a la pureza y calidad ambos métodos son adecuados (cuadro 3, figura 1). Cuadro 3. Comparación de la concentración y pureza de etraído por los métodos - UMSAgen y clásico. SD p g/ 6 cel -UMSAgen Clásico Abs 80/60 -UMSAgen 0,4, 55, 31. 0,06 0,0000 0,1 Clásico 1 0, B 364 A. Migración electroforética de 3 µg de en agarosa 0.8% con bromuro de etidio. MII, Marker II; columna 1, método -UMSAgen; columna, degradado; columna 3, método clásico. B. Migración electroforética de Amplificación del eon 1 del gen JAK por PCR en agarosa % con bromuro de etidio. MVIII Marker VIII; columna 1, método -UMSAgen; columna, degradado; columna 3, método clásico. El estudio de costos para el método - UMSAgen es de un dólar y para el método clásico es de dos dólares. El tiempo de etracción utilizado por el método -UMSAgen es de horas, mientras para el método clásico es de 4 horas. DISCUSIÓN MVIII 1 3 El genómico es utilizado en laboratorios de Biología Molecular para determinar la etiología y las características genéticas de diferentes patologías. Desde la primera etracción del hasta la fecha se han diseñado diversos métodos de etracción; en los últimos años se hicieron populares los Kits -UMSAgen, EXTRACCIÓN DE GENÓMICO PARA DIAGNÓSTICO MOLECULAR: MÉTODO RÁPIDO Y ECONÓMICO

5 REVISTA CUADERNOS Vol. 51-/006 patentados que simplifican la etracción, pero disminuyen la calidad del con costos cada vez mayores. En el método -UMSAgen no se utiliza la proteinasa K, (enzima de alto costo); en su lugar se utiliza el NLB (del anglosajón: nuclear lysis buffer ) que reduce el tiempo del procedimiento de 1 horas (método clásico) a 5 minutos. Además no se utiliza el fenol, una sustancia catalogada como muy tóica para el manipulador y para el medio ambiente. Al recuperar el precipitado con una aguja hipodérmica, nos permite obtener de alta calidad (de mayor número de pares de bases) dejando de menor número de pares de bases en la solución; probablemente por ello la concentración del sea inferior en relación con el método clásico. El método -UMSAgen simplifica los pasos, ahorra tiempo y dinero, obteniendo de alta calidad tal como lo demuestran los estudios de espectrofotometría y electroforesis en gel de agarosa. Los costos de etracción se reducen en aproimadamente 50% en relación con el método clásico y más de 00% en relación con otros métodos patentados. La cantidad de etracción de con - UMSAgen es menor en relación con el método clásico, pero suficiente para realizar técnicas como Southern blot, PCR, etc. La pureza es ligeramente superior con -UMSAgen aunque no estadísticamente significativo. El método -UMSAgen con las ventajas ya descritas, requiere ser validado para su utilización a nivel internacional. REFERENCIAS. 1. Watson JD, Crick FHC. Molecular structure of nucleic acids: A structure for deoyribose nucleic acid. Nature 53;1:737.. Jones SW, Dobson ME, Francesconi SC, Schoske R, Crawford R. Assays for Detection, Identification, and Individualization of Select Agent Microorganisms Croat Med J 005; 46: Maniatis T, Fritsch EF, Sambrock J. Molecular cloning: A laboratory Manual. Ed. 8. Cold Spring Harbor. New York. 4. Luque J, Herraez A. Teto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética. Ed Harcourt. Madrid. 5. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for etracting from human nucleated cells. Nucleic Acid Res 88;:5. 6. Bater EJ, Scott lm, Campbell PJ,et al. Adcquired mutation of the tyrosine kinase JAK- in human myeloproliferative disorders. Lancet 005; 365:33. Rev. Cuadernos 006; 51 (): - / Amaru R. Miguez H. Peñaloza R. Torres G. Silvestre J. Cuevas H.