E-seminar. 26 de Septiembre de Máximas prestaciones para el análisis de hormonas y dioxinas en muestras alimentarias
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- Vicenta Aguilera Hidalgo
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1 Máximas prestaciones para el análisis de hormonas y dioxinas en muestras alimentarias E-seminar 26 de Septiembre de 2014 José Juan Rivero Marabé Especialista de producto GC y GCMS Agilent Technologies, Spain
2 Reto analítico en Alimentación y Medioambiente Residuos: >1000 Pesticidas >300 Drogas veterinarias Contaminantes naturales: >500 Micotoxinas >500 Toxinas de plantas >100 Biotoxinas marinas >1000 Contaminanates: Medioambientales: Dioxinas, PCBs, HPAs, Retardantes de llama, PFCs, Biocidas, Disruptores endocrinos, Metales pesados >>Cientos de contaminantes de procesos y adulterantes: Acrilamida, Aminas heterocíclicas, Furanos, desinfectantes, Melamina Niveles ultrabajos
3 Por qué MS/MS? Hoy día, MS/MS es una técnica de rutina y representa una poderosa herramienta analítica para la determinación de ultratrazas en matrices incluso muy complejas, así como para resolver problemas graves como compuestos con la misma masa. Gran selectividad eliminación del fondo de la matriz. Inigualable sensibilidad Buena calidad espectral confirmación más fiable Preparación de muestra más sencilla
4 Cuándo usar MS/MS? Cuando la Matriz es compleja se pueden producir Interferencias por coincidencia de los iones de cuantificación del analito con los de la matriz Permite la cuantificación selectiva de compuestos CONOCIDOS en muestras que presentan un elevado fondo químico Mejor S/N en matrices complejas que el que puede obtenerse por tecnologías que trabajan en Scan o SIM. Las exigencias de las normativas más actuales resultan más fáciles de cumplir gracias al poder de la confirmación MS/MS o alta resolución de masas
5 Portfolio Agilent GCMSMS
6 Nuevo Agilent 7010 GC/MS/MS Triple Cuadrupolo 4 a Generación Introducido Junio 2014
7 Nuevo GCQQQ Agilent C 7010 Septiembre 2013 Junio 2014
8 Portfolio de GCMSMS Agilent
9 Cual de ellos usar?: Tipo de aplicación * Problemas complejos de separación cromatográfico y de detección. * Screening indiscriminado * Analíticas de altísima sensibilidad * Efecto matriz sea muy grave * Mejores LD en EI P Ej.- Dioxinas & Hormonas. * La mayoría de las aplicaciones. * Métodos en PCI y NCI. P Ej: Pesticidas, PAHs, contaminantes emergentes
10 Ejemplos de Aplicaciones target C Análisis de: - Dioxinas, Furanos y PCBs en matrices medioambientales y alimentarias - Hormonas - Problemas graves de matriz - Mejores LD en EI Análisis de: - Pesticidas - PAHs - Ftalatos - PBDEs - Métodos en PCI y NCI
11 Mejoras introducidas en el Agilent 7010
12 Agilent 7010: Basado en la exitosa plataforma 7000C Cuadrupolos hiperbólicos reales recubiertos de oro Detector de Triple Eje Fuente de iones: Mayor eficacia en la ionización 20-30x mas iones Celda de colisión compacta con aceleración axial para cambio rápido de condiciones MRM (800 MRM/sec) y reducción del ruido por uso de He Quenching
13 Nueva EPC preparada para Backflush
14 Medida de la sensibilidad Parámetro S/N anticuado
15 En los ultimos 15 años, S/N se ha incrementado desde 10:1 to > 1000:1. Esto hace que sea dificil de predicir el verdadero limite de detección, incluso cuando es observable el ruido de fondo Que reportamos con S/N para la mayoría de sistemas de MS hoy? Este elevado valor de S/N viola los principios de la química Analítica y no cumple las normas de Calidad a seguir
16 Maneras de manipular S/N Aumentando la señal Incrementando la ganancia Picos más estrechos Incrementando el promedio de scan Bajando el ruido Seleccionando la zona de mejor ruido Estrechar zona de ruido Ajustar la zona de línea base Aplicar suavizados y filtrados Variedad de algoritmos de calculo del ruido: Peak-to-Peak, RMS,... a. Peak-to-peak b. RMS c. Smoothing d. Baseline noise filtering Para un Sistema de MS las especificaciones S/N, la mayoría de las manipulaciones vienen a traves de la manipulacion del ruido y no de incrementar la señal (ion count)
17 S/N de diferentes zonas de ruido 1 pg reserpine on-column, mismo fichero
18 S/N de diferentes zonas de ruido 1 pg reserpine on-column, mismo fichero -5X S/N: 10,745 RMS x 1 Zona de ruido: min Anchura: 0.05 min Ruido 0.43 S/N: 6,682 RMS x 1 Zona de ruido: min Anchura: 0.1 min Ruido 0.69 S/N: 1,938 RMS x 1 Zona de ruido: min Anchura: 0.1 min Ruido 2.39
19 Limite de detección instrumental (IDL) Definido por estadísticas IDL = t SD = t (%RSD / 100) cantidad medida Criterio basado de formula estadística, seguido por multitud de normativas y guías de validación metodológicas IDL La mínima cantidad de analito que es detectable y que se pueda distinguir del ruido de fondo con un nivel de confianza %RSD vs. Cantidad Inyectada t Valor de t Student, para 99% nivel de confianza n 1 grados de libertad %RSD Cantidad medida Desviación estándar relativa / precisión del área de pico a la cantidad medida Con n replicados inyectados Limitado a 2 5 x veces mayor que el Limite de Detección (DL) Ajuste Teórico de %RSD basado en estadísticas %RSD aumenta cuanto mas bajo es la cantidad inyectada
20 Especificaciones IDL Agilent 7010 Triple Cuadrupolo Mas iones = Mejor Precisión IDL = 0.5 fg 2 fg/µl OFN standard 8 inyecciones consecutivas 1 µl splitless Comprobado en fábrica Comprobado en instalación
21 Sólo cuestión de mejores limites de detección? Limites de detección mejores hasta un orden de magnitud en muchos casos Mismos limites de detección, pero Menor cantidad de muestra - Diluyendo, o inyectando menos Aumenta la vida de Liner y columna - Bajar escala de muestra 1 litro a 100 ml, o 10 g a 1 g Menor preparación de muestra - Sin pasos de preconcentración l/l extracción SPE Evaporar y disolver
22 Aumento de la vida del liner 0.5 µl 2 µl 64 injecciones de extracto de QuEChERS manzana
23 Menor Volumen de Injección Mejora resultados y menor mantenimiento CAL µl injections (1/4 of the normal 2 µl injection) 10 ppb (MRL) - Average RSD = 5.5%
24 Menor tiempo de adquisición por MRM - Tiempos de Dwell más cortos Acorte de los tiempos de run Mas compuestos a analizar por run Mas cualificadores para mayor confianza - Menores RSDs Mayor confianza en los resultados
25 7010 estabilidad de los ratios de iones 160 Mevinphos PCB Chloropropham 140 HCB Fonofos Terbacil Tefluthrin 120 Chlorothalonil PCA Vinclozolin Metolachlor 100 % (Cal) ppb Ratio (+/- 20%) mantenido a niveles de concentracion 10 veces abajo Chlorpyrifos Dacthal Diphenamid Procymidone Prothiofos Fludioxonil DDE-p,p' Oxyfluorfen Flusilazole Endrin Bromopropylate Tebufenpyrad Fenarimol Coumaphos *Same transition, Plum matrix, result based on one analysis, n= 5 cal sets ppb
26 Demostración de 1 ms tiempo de Dwell
27 Actualización en su plataforma de GC/TQ 7010: El Nuevo standard para las mejores prestaciones en EI 7000C: La opción más allá del estándar de confianza necesario para cumplir con todas las regulaciones hoy día incluido alimentación infantil Actualización
28 Agilent 7010 Análisis de hormonas derivatizadas (TMS)
29 Condiciones cromatográficas y de detección Agilent UI 15m DB-5MS x 250 μm x 0.25 μm Temperatura de Horno 160 C (0.3min) 30 C/min hasta 290ºC (0 min) 50 C/min hasta 305 C (0 min) Post Run 70 C ALS Syringe Size Injection Volume 5 μl 1 μl Front MM Inlet He Mode Pulsed Splitless Heater 250 C Injection Pulse Pressure 25 psi Until 0.5 min Flujo 1.2 ml/min 4mm STGW UI liner QQQ EPC Celda de Colisión He Quench 2.25 ml/min N2 Collision Gas 1.5 ml/min Temp Linea transferencia: 250 C
30 Cálculo del IDL para la E2-TMS Test Date: Customer: Melissa Start Time: Serial #: Finish Time: ALS: fg E2 Injected IDL = t SD = t (%RSD / 100) cantidad medida Moving RSD inj peak Area peak Ht peak Area peak Ht % #DIV/0! % #DIV/0! % #DIV/0! % #DIV/0! % #DIV/0! Min RSD-> 4.3% IDL-> 25.9-fg
31 Calibración de E2-TMS (5 replicas consecutives) ng/ml E2-TMS, 1 ul injected (50-10,000 fg) R^2 =
32 Cromatogramas E2-TMS a 0, 0.05, y 0.5 ng/ml Blanco de reactivo 50 fg 500 fg
33 E1-TMS calibración (ESTD) 50 fg on column
34 E1-TMS calibración (ESTD) ng/ml E1-TMS, 1 ul injected (50-10,000 fg) R^2 =
35 DHT-TMS calibración 5 pg en columna (ESTD)
36 DHT-TMS calibración (ESTD) 1-10 ng/ml DHT-TMS, 1 ul injected (1-10 pg) R^2 =
37 Agilent 7010 Análisis de Dioxinas, Furanos y PCBs
38 Colaboraciones realizadas para Análisis de Dioxinas Agilent 7010 J.F. Focant Universidad de Lieja Validation of GC-MS/MS confirmatory method for the European official control of levels of dioxins, furans, and dioxin-like PCBs in foodstuffs P. Fürst CVUA-MEL (Alemania) A New Evaluation of Triple Quadrupole GC/MS for Dioxin Analysis in Food Samples Using a Novel Source Technology
39 Condiciones cromatograficas y de detección Agilent 7010 Gas Chromatograph Agilent 7890B Columns (1) 60 m x 0.25mm ID x 0.25 um DB-5ms Ultra Inert ( UI) Inlet Front MMI Inlet He, outlet 7010 Carrier gas Helium Carrier gas mode Constant flow Column Flow 1.0 ml/min Injection Port MMI Auto-sampler Agilent 7693A Injection mode Solvent Vent Injection Dispense Speed 69 μl/min 75 C (0.02)-720 C/min to 3250 C (5) Vent Flow : 100 ml/min per min Vent Pressure 10 psi Until 0.02 min Injection volumen 2.5 μl Injection port liner Oven program deg C (min) 120 C (5)-25 C/min to 250 C (5)-3 C/min to 285 C (0) Run Time min Mass Spectrometer Agilent7010 MS/MS MS Interface 280ºC MS Source 250ºC MS Quad 150ºC
40 Cromatograma TIC (Dioxinas+Furanos+PCBs)
41 2378-TCDD (41 fg/μl; 2 μl inyectado)
42 Especificaciones para análisis de Dioxinas 2,3,7,8-TCDD a nivel de 5 fg/ul 2,3,7,8-TCDD 5 fg/ul; 2 ul inyectado 10 fg en columna
43 6 inyecciones consecutives de muestra grasa (0.79 pg-teq/g grasa) RSD promedio: 6.7%
44 Resumen 1. Plataforma de MSMS completa. 7000C, 7010 y 7200B 2. Inversión continua de Agilent en desarrollo de todos sus sistemas de MS, para cumplir con las más rigurosas normativas. 3. Política de Agilent de proteger la inversión al poder ser actualizables equipos antiguos hasta los últimos modelos. 4. Alta sensibilidad no solo implica mejores LD, también menor mantenimiento o mejores RSD 5. Sistemas de Alta sensibilidad para aplicaciones tradicionales de alta robustez y alto rendimiento.(7000c) 6. Sistemas de Ultra alta sensibilidad en EI para aplicaciones especiales: Dioxinas, PCBs, Hormonas (7010)
45 José Juan Rivero Marabé Agilent Technologies, Spain
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