Trucos y consejos en el desarrollo de metodos multicomponentes por GCMSMS

Transcripción

1 Trucos y consejos en el desarrollo de metodos multicomponentes por GCMSMS José Juan Rivero Marabé Especialista de producto GC y GCMS Agilent Technologies, Spain 6 de marzo de 2013

2 Indice Consideraciones en el desarrollo de métodos multicomponentes Introducción Preparación de la muestra Uso de patrones internos Consideraciones cromatografía Consideraciones detección Optimizacion y desarrollo método GCMSMS Rutina y mantenimiento

3 Situación actual

4 Reto analítico Residuos: >1000 Pesticidas >300 Drogas veterinarias Contaminantes naturales: >500 Micotoxinas >500 Toxinas de plantas >100 Biotoxinas marinas >1000 Contaminanates: Medioambientales: Dioxinas, PCBs, HPAs, Retardantes de llama, PFCs, Biocidas, Disruptores endocrinos, Metales pesados >>Cientos de contaminantes de procesos y adulterantes: Acrilamida, Aminas heterocíclicas, Furanos, desinfectantes, Melamina Niveles: 0, mg/kg

5 Documento SANCO Directrices de la comision Europea

6 Documento SANCO/12571/2013 Establecer un sistema armonizado y cost-effective de aseguramiento de la calidad en la UE Asegurar la calidad y comparabilidad de los resultados analíticos Asegurar una aceptable exactitud de los resultados analíticos Asegurar la ausencia de falsos positivos/negativos en los reports Servir de apoyo para la acreditación ISO El documento es integral y complementario a los requisitos de Inicialmente está dirigido a los laboratorios de control oficial pero se ha popularizado a todos laboratorios de analisis de residuos

7 Tendencias en las estrategias del análisis de trazas de residuos en alimentación Desarrollo de estrategias eficaces mediante análisis conjunto por GC/MS/MS y LC/MS/MS y que superen las limitaciones actuales de muchas normativas(fda/epa/eu) Cuantificación, identificación y confirmación simultáneas Aumentar el número de residuos analizados Acortar los tiempos de analisis Mayor productividad, sensibilidad y calidad de resultados INCLUSO ENTRE MATRICES Desarrollo de estrategias eficaces para determinacion de residuos no target o desconocidos mediante análisis por GC/Q-TOF y LC/Q-TOF Cuantificación, identificación y confirmación simultáneas Aumentar el número de residuos analizados más allá de los conocidos. Aumentar la productividad con un software MS intuitivo y potente Revisión rápida y atomática de resultados e informes: Más datos con menos recursos Cumplimiento de las normativas Comunitaritas e Internacionales

8 Por qué MS/MS? Hoy día, MS/MS es una técnica de rutina y representa una poderosa herramienta analítica para la determinación de ultratrazas en matrices incluso complejas. Gran selectividad eliminación del fondo de la matriz. Inigualable sensibilidad Buena calidad espectral confirmación más fiable Preparación de muestra más sencilla

9 Cuándo usar MS/MS? Cuando la Matriz es compleja se pueden producir Interferencias por coincidencia de los iones de cuantificación del analito con los de la matriz Permite la cuantificación selectiva de compuestos CONOCIDOS en muestras que presentan un elevado fondo químico Mejor S/N en matrices complejas que el que puede obtenerse por tecnologías que trabajan en Scan o SIM. Las exigencias de las normativas más actuales resultan más fáciles de cumplir gracias al poder de la confirmación MS/MS

10 El MS/MS es la solución donde el MS no llega GC/MS Single Quad SIM Interf de matriz = Ruido Químico GC/MS Triple Quad SRM El sueño de todo cromatografista: Un pico con linea base limpia

11 Indice Consideraciones en el desarrollo de métodos multicomponentes Introducción Preparación de la muestra Uso de patrones internos Consideraciones cromatografía Consideraciones detección Optimizacion y desarrollo método GCMSMS Rutina y mantenimiento

12 Preparacion de la muestra Extracción L-L (Disolv inmiscible) Extracción fase sólida (SPE, Luke, Quechers, etc )

13 El método QuEChERS Consiste en una microextracción líquido-líquido El MgSO 4 ayuda a la partición de los pesticidas en la capa orgánica, gracias a que retiene el agua El solvente preferido es acetonitrilo El Acetonitrilo proporciona la extracción del más amplio rango de compuestos orgánicos sin la co-extracción de grandes cantidades de material lipofílico y es compatible con la mayoría de aplicaciones de GC/MS y LC/MS mostrando muy pocas interacciones. Seguida de un clean-up de muestra por una SPE dispersiva para eliminar la matriz no deseada con PSA Procedimiento rápido y económico en comparación con los métodos tradicionales de preparación de muestra en plaguicidas. Proceso terminado en menos de 20 minutos

14 Quechers. Historia y modificaciones Metodo original Anastassiades 2002

15 Quechers. Historia y modificaciones Problemas de estabilidad: Sensibilidad al ph (incluso de matriz) Inestabilidad en el propio disolvente.

16 Quechers. Historia y modificaciones Metodo tamponado AOAC oficial 2007

17 Quechers. Historia y modificaciones Metodo tamponado con citrato EU Estándar method EN 15662/2008

18 Proceso de Clean up MgSO4 Secado (reducir la cantidad de agua en el acetonitrilo) PSA Sorbente (reduce la cantidad de grasa, acidos orgánicos y azúcares) C18 Reduce la cantidad de compuestos lipofílicos (esteroles, ceras) GCB Absorbe compuestos con estructura planar (pigmentos, carotenoides) Ej.- Muestras de frutas y vegetales 150mg MgSO4 anh + 50 mg PSA + 50 mg C18

19 Consideraciones especiales

20 Indice Consideraciones en el desarrollo de métodos multicomponentes Introducción Preparación de la muestra Uso de patrones internos Consideraciones cromatografía Consideraciones detección Optimizacion y desarrollo método GCMSMS Rutina y mantenimiento

21 Uso de patrones internos 1. Buena practica para mejorar la precisión y la exactitud. 2. Normaliza errores volumétricos o de inyección, procesos de evaporación de extractos. 3. Se suele añadir al final del proceso de extracción inicial. El buen patrón interno debe: o Buena estabilidad y recuperación independiente de la matriz. o No presente en la muestra o Disponible puro y económico o Represente a la mayoría de los analitos presentes

22 Uso de patrones internos: QC Uso de patrones QC (controles de calidad) ISTD añadidos al principio del proceso de extracción Control de las recuperaciones de todos los pasos del proceso de extracción de compuestos problemáticos. Ojo no usar patrones planares si se usa GCB en el proceso de cleanup (TPP)

23 Uso de patrones internos: Selección

24 Indice Consideraciones en el desarrollo de métodos multicomponentes Introducción Preparación de la muestra Uso de patrones internos Consideraciones cromatografía Consideraciones detección Optimizacion y desarrollo método GCMSMS Rutina y mantenimiento

25 Selección de la columna - Convencionalmente HP5 (5% phenyl) - Cyanopropyl, cyanopropylphenyl, phenyl..50% - 30m x 0,25mm x 0,25um - 20 m (i.d.<0,2mm) 20 min análisis y pérdida de robustez Coelucciones de componentes de la matriz Afectan a todos los etapas de la cromatografía

26 Efecto matriz Efecto principal: Coelucción Aumento de la señal (GC) Supresion de señal o mejora de señal (LC/MS) Factores que afectan Puntos activos en el sistema GC Estructura química de los compuestos Concentracion del analito Tipo de muestra y concentración Tiempo de residencia Temperatura de inyección.

27 Tecnicas de inyección (S/SL) Inyeccion splitless en caliente Inyeccion splitless pulsado (mejora compuestos lábiles, discriminacion)

28 Tecnicas de inyección (MMI) Cold splitless o solvent vent omayores volúmenes de inyección, sin dañar columna por exceso de disolvente ointroduccion de los analitos en columna a la temperatura adecuada. Temp Split abierto Split cerrado Split abierto

29 Optimizacion del solvent vent Excesiva cantidad de acetonitrilo Condiciones correctas de venteo

30 Backflush. Optimizacion.

31 Backflush y análisis simultáneos: Funcionamiento Pres Alta = 0 MMI EPC Presión ALTA RESIDUAL 1.0 ml/min Flujo Constante QQQ MS-Tee

32 Backflush. Ventajas Una vez instalado, el tiempo de retroflujo trabajará para TODOS los compuestos pesados. - Los compuestos de menor peso eluyen primero Necesita 33 min adicionales y poner a 320 o C la columna para eliminar estos picos. Run se para a 42 min y el retroflujo se realiza a 280 o C durante 7 min Blanco run despues de limpieza min

33 Uso de analitos protectores (AP): Sin Backflush Mezclas de compuestos añadidos a los extractos para desactivacion en cada inyeccion del Sistema cromatográfico Fuerte Interaccion con puntos activos (grupos silanoles libres o depósitos de compuestos no volátiles de la matriz) en la columna y en el inyector Protege analitos susceptibles de adsorberse sobre puntos activos Mezclas de AP selecionadas para cubrir amplio rango de volatilidad, minimizer el efecto matriz, y mejorar la robustez Compuestos como acido L-gulonico, γ-lactona, D-sorbitol Analitos baratos, no tóxicos, y seguros para uso en sistemas de GC/MS

34 March 10,

35 Uso de los protectans: Sin Backflush March 10,

36 Indice Consideraciones en el desarrollo de métodos multicomponentes Introducción Preparación de la muestra Uso de patrones internos Consideraciones cromatografía Consideraciones detección Optimizacion y desarrollo método GCMSMS Rutina y mantenimiento

37 Optimizacion de las condiciones del MS -Temperatura de la fuente de ionización 280ºC compromiso entre buena respuesta de los últimos compuestos eluidos -Factor de ganancia vs EMV (+200v) Ganancia Optimizacion condiciones MS/MS Condiciones seleccionando 2-4 iones precursores del Full Scan con multiples energías de colision (0-60v) y seleccionando 2-3 transiciones de las mas abundantes. -Programa de segmentos de tiempo Siempre > 10 puntos por pico

38 Indice Consideraciones en el desarrollo de métodos multicomponentes Introducción Preparación de la muestra Uso de patrones internos Consideraciones cromatografía Consideraciones detección Optimizacion y desarrollo método GCMSMS Rutina y mantenimiento

39 Bases de datos publicadas Agilent: 7 transiciones; clasificaciones; 3 RTs y RIs

40 Optimizacion MSMS 1. Realizar un Full Scan para elegir el mejor ion 2. Realizar un scan de iones producto a diferentes voltajes 3. Elegir las mejores condiciones de voltaje y abundancia 4. Comprobar numero de puntos por pico 5. Comprobar transiciones con matriz: Interferencias March 10,

41 Optimizacion MSMS

42 Ciclos por segundo 3,5 ciclos/seg generan 15 puntos por pico

43 Evaluación de 6 MRMs para Atrazine en diferentes matrices

44 Metodo MRM: Segmentos de tiempo Trabajar en RTL

45 Metodo MRM: Condiciones MRM segmento

46 Indice Consideraciones en el desarrollo de métodos multicomponentes Introducción Preparación de la muestra Uso de patrones internos Consideraciones cromatografía Consideraciones detección Optimizacion y desarrollo método GCMSMS Rutina y mantenimiento

47 Rutina de mantenimiento diario (Bacth 50 muestras) -Cambio de liner. -Cambio de septum. -Realizar tune evaluation. -Revisar estado de los filtros de gases. -Revisar nivel de presión de gases. -Comprobar del primer pinchazo la resolución de picos isomèricos ( -HCH vs -HCH y/o p,p -DDD vs o,p -DDT) -Comprobar perdida de sensibilidad o forma de pico. -Comprobar el RTL

48 Requerimientos de controles de calidad Durante proceso de validación Recuperaciones, precisión al LOQ (5 replicas) recuperaciones del % En rutina Recuperaciones ± 2 veces RSD (SANCO %) repetibilidad 20% al LOQ

49 Consideraciones respecto a la Calibracion Sobre Matriz Factores de correlación R 2 > % RSD 20% Residuales < 20% (dif calc vs conc real) (80-120%)

50 Resumen Consideraciones en el desarrollo de métodos multicomponentes Preparacion de muestra Conocer bien la muestra y los compuestos a analizar Condiciones de extracción óptimas Condiciones instrumentales y metodológicas Buena introdución de la muestra Selección del uso de ISTD Selección correcta de las condiciones cromatografícas y de detección Mantenimiento en rutina Controles de calidad adecuados Planificacion de los mantenimientos diarios, semanales y mensuales March 10,

51 MUCHAS GRACIAS por su atención