Análisis de residuos de medicamentos zoosanitarios: Nuevas herramientas analíticas, nuevas perspectivas.
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- Mario Acosta Ortiz de Zárate
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1 Análisis de residuos de medicamentos zoosanitarios: Nuevas herramientas analíticas, nuevas perspectivas. JORNADAS DE REFERENCIA 14 ANÁLISIS DE ALIMENTOS Madrid, 1 de junio de 14 Antoni Rúbies Servei de Química, Àrea d anàlisi orgànica Laboratori Agència Salut Pública Barcelona ÍNDICE 1. Situación actual del análisis de residuos zoosanitarios 2. Actualización de criterios en otros ámbitos 3. Nuevas propuestas de confirmación 4. Resultados de la aplicación
2 1. Situación actual: Uso de espectrometría de masas: obligatorio en el caso del grupo A de residuos LRMS IONES PRODUCTO HRMS SECTOR MAGNÉTICO ACOPLAMIENTO LC-HRMS?
3 Criterios para la identificación y confirmación: 657/2/UE -Criterio de tiempo de retención: ±.5% trr (GC) ±2.5% trr(hplc) -Criterio de ion ratio: según abundancia de las transiciones: Criterios actuales UE: márgenes muy amplios. 1. Tiempo retención: (Ronidazol-Ronidazol-D 3 ) RRT (%) 2.5% 1% Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4 Sample 5 Sample 6 Sample 7 Sample 8 Sample 9 Sample 1 Sample 11 Sample 12 Sample 13 Sample 14 Sample 15 Sample 16 Sample 17 Sample 18 Sample 19 Sample Tiempo de retención relativo: UHPLC, objetivo 1% alcanzable
4 2. Ion ratio: Casuística usando criterios vigentes Nitroimidazol: Ronidazol (MW: Da) Ion ratio medio de las ME: 3.72 (26.9%) Tr: 4.38 min Márgenes entre -5%: ± 25% [ ] Tr: 4.38 min! IR muestra= 4.6! Confirmación por HRMS: Ronidazol Error de masa permitido: 5 ppm Error de masa permitido: ppm C:\AgSP_BCN\...\Data\ /7/12 2:8:14 PM Cal Level: Sample ID: 12_3755 Inj Vol: 5. Mass Tolerance 5. ppm RT: NL: 1.16E m/z= F: FTMS + p ESI Full ms 8 [5.-5.] MS Relative Abundance RT: 4.23 AA: Time (min) NL: 2.64E5 m/z= F: FTMS + p ESI Full ms2 275.@hcd35. [5.-5.] MS NL: 1.91E6 m/z= F: FTMS + p ESI Full ms [5.-5.] MS Genesis C:\AgSP_BCN\...\Data\ /7/12 2:8:14 PM Cal Level: Sample ID: 12_3755 Inj Vol: 5. Mass Tolerance.5 amu RT: RT: 4.32 NL: 1.27E7 MA: m/z= F: 4.35 FTMS + p ESI Full ms [5.-5.] MS Relative Abundance Time (min) 6.82 RT: MA: RT: 4.22 MA: NL: 5.46E6 m/z= F: FTMS + p ESI Full ms2 275.@hcd35. [5.-5.] MS NL: 3.9E6 m/z= F: FTMS + p ESI Full ms [5.-5.] MS Da 14 Da Ronidazol confirmado a ±.5 Da Patrón interno Ronidazol? [ ]
5 Robenidina: Error permitido: 5 ppm? Ion Precursor Iones Producto QqQ-LRMS HRMS Semicarbacida: Error permitido: 5 ppm Quantification transition Confirmation transition Labeled internal standard Precursor ion Product ion 1 Product ion 2 LRMS HRMS
6 Propuestas de aspectos a revisar para evitar errores Márgenes de tiempo retención menores: ± 1% Márgenes de ion ratio menores: Intensidad relativa Margen permitido pico base > 5% ±1% -5% ± 15% 1-% ± % <1% ± 25% RRT (%) Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4 Sample 5 Sample 6 Sample 7 Sample 8 Sample 9 Sample 1 Sample 11 Sample 12 Sample 13 Sample 14 Sample 15 Sample 16 Sample 17 Sample 18 Sample 19 Sample 2.5% 1% 2. Actualización criterios en otros àmbitos: Documento SANCO plaguicidas (13)
7 Actualización con las nuevas técnicas de espectrometria de masas de última generación: Criterios mínimos Nuevos criterios para los ion ratio: desligados de las abundancias Criterio único
8 Los nuevos criterios se están implementando en los diferentes organismos internacionales Codex alimentarius (draft mayo 12): Ion ratio según abundancias WADA TD3IDCR (dopaje): RRT ± 1%. Ion ratio según abundancias SANCO (13) (plaguicidas): RT ±.2 min. Ion ratio fijo al 3% FDA (animal drug residues): RT ± 5%. Ion ratio absoluto (1%) Comité CODEX para residuos veterinarios, ª sesión, Mayo 12 Considera los diferentes tipos de espectrómetros de HRMS: TOF, Orbitrap Atribuye el mismo valor que 657/2/CE a las transiciones en LRMS y HRMS. Incluye definiciones métodos muy usados actualmente: Rectas de calibración: SCC: standard calibration curve: recta externa MSCC: matrix matched standard calibration curve: recta sobre matriz extraida MMSCC: method matrix matched standard calibration curve: recta dopada sobrematriz antes de la extracción.
9 Considera CCα y CCβ, asimilados a LD, LC No incluye criterio de variación de tr Incluye criterios de confirmación HRMS: error de masa < 5 ppm Define la portabilidad de los métodos: características de los métodos analíticos a considerar para ser transferidos de un lugar a otro sin pérdida de eficacia. Incluye una lista de matrices diana a testar según el tipo de analitos (solubles en agua/ insolubles) para el análisis de carne, leche, crustáceos, etc:
10 3. Criterios actuales descritos en los procedimientos de análisis de residuos del laboratorio ASPB: LRMS: Restricción de los criterios habituales: - Variación tr: ± 1% - Restricción de los márgenes de IR a la mitad Intensidad relativa pico base Margen permitido > 5% ±1% -5% ± 15% 1-% ± % <1% ± 25% HRMS: Error de masa < 5 ppm (.1 Da a m/z=) Resolución: Monitorización de ratios Variación ion ratio < % Necesidad de confirmación (LRMS HRMS) -Tr coincidente e ion ratio diferente: posible interferencia de matriz -Presencia de las transiciones con tr diferente -Presencia de compuestos prohibidos en torno al Ccα -Ausencia de 1 de las 2 transiciones -Moléculas que no fragmentan
11 Ejemplos gráficos de los criterios adoptados en el laboratorio ASPB Error de masa < 5 ppm (.1 Da): taleranol en extracto de orina? Relative Abundance RT: RT: Extraction 9 window: 85 8 ppm Time (min) RT: RT: Extraction 9 window: ppm Time (min) Relative Abundance RT: Extraction 9 window: 5ppm Time (min) Relative Abundance Resolución: : extracto de agua potable analizado por GC-MS/MS QqQ: Metalaxil??? dilución? Relative Abundance : interferencia isobárica : metalaxil standard m=.58 Da m/z
12 Monitorización de ratios: zeranol en extracto de orina Ratios: 1º= ( )% 2º= (-32.8)% 4. Resultados de la aplicación A. Métodos de análisis de residuos zoosanitarios implementados MÉTODOS DE ANÁLISIS DE RESIDUOS Antibióticos Beta-agonistas Coccidiostáticos Toltrazuril Metabolitos de Nitrofuranos Corticosteroides Cloranfenicol Nitroimidazoles Aminoglucósidos Tireostáticos Benzodiacepinas y tranquilizantes Avermectinas Hormonas Colorantes sudan Colorantes malaquita
13 B. Conclusiones del estudio - El análisis de muestras con LRMS (QqQ) es una herramienta muy útil y robusta. Sin embargo, en ocasiones puede llevar a resultados erróneos. - El uso de nuevas tecnologías permite resolver las dudas planteadas por el análisis LRMS. - La legislación europea en el campo de zoonitarios debe actualizarse para incluir las novedades de instrumentación. - La instrumentación HRMS usada permite llegar a límites similares a los de LRMS. Euroresiduos Gante, junio 14
14 Muchas gracias!
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