Aplicaciones y soluciones de Agilent

Transcripción

1 Aplicaciones y soluciones de Agilent El camino más corto al resultado deseado Jaume C. Morales Especialista de Producto Agilent Technologies Spain Tarragona / Lleida Octubre de 2012

2 Tendencias en análisis alimentario/ambiental En los análisis de un solo compuesto se puede cuantificar directamente en MS ó MS/MS dependiendo de la matriz. En el Análisis MultiResiduo el alto numero de compuestos a determinar pueden mermar la sensibilidad por el menor tiempo dedicado en un SQ / QQQ (SIM / MRM). Los métodos de screening deben tener suficiente sensibilidad para detectar aunque NO suelen (*) ser útiles para cuantificar. (Puntos por pico) Necesidad de métodos de screening para luego cuantificar sólo los compuestos encontrados. Confirmacion y cuantificación únicamente de positivos. El conjunto de un screening previo, equipos de alta sensibilidad y herramientas de adquisición y tratamiento de datos avanzadas permiten disponer de sistemas altamente sensibles, productivos y robustos. (*) Nuevo ifunnel QTOF 6550A

3 Tendencias en análisis alimentario/ambiental Compuesto único MultiResiduo LC/GC Screening (MS) -- X TOF/GCMS Quant MS Matriz Limpia SQMS Quant MS/MS Matriz Compleja QQQ 3 Confidentiality Label November 14, 2012

4 Flujo de trabajo óptimo Intentar cuantificar TODO el listado de productos regulados de una sola vez puede comprometer la sensibilidad y robustez del sistema. Los métodos MultiResiduo tienen un límite dependiendo de la cromatografía. El barrido o screening nos permite confeccionar un listado de los compuestos que estan presentes por técnicas de IDENTIFICACIÓN. La Cuantificación y confirmación posterior de SÓLO aquellos compuestos que dieron positivo permite obtener unos resultados más sensibles, reproducibles y robustos. Screening Confirmación Cuantificación

5 Flujo de trabajo óptimo GC/SQ LC/QQQ GC/QQQ LC/TOF/QTOF Screening Confirmación Cuantificación

6 Flujo de trabajo óptimo para LC/MS 1200 Infinity LC Agilent LC/TOF/QTOF El TOF/QTOF detecta todo aquello que se ionice en la fuente Screening Los compuestos se identifican por masa exacta Cuantificción

7 Flujo de trabajo óptimo para LC/MS 1200 Infinity LC Agilent LC/TOF/QTOF 1290 Infinity UHPLC Agilent 6460B LC/QQQ El TOF/QTOF detecta todo aquello que se ionice en la fuente Screening Confirmación Los compuestos se identifican por masa exacta Cuantificción Cuantificación

8 Flujo de trabajo óptimo para GC/MS Agilent 5973C GC/SQ El GC/MSD detecta todo aquello que se ionice en la fuente Los compuestos se identifican por espectro EI Screening

9 Flujo de trabajo óptimo para GC/MS Agilent 5973C GC/SQ El GC/MSD detecta todo aquello que se ionice en la fuente Los compuestos se identifican por espectro EI Screening

10 Flujo de trabajo óptimo para GC/MS Agilent 7000B GC/QQQ Screening Confirmación Cuantificación

11 Screening genérico con sistemas de Tiempo de Vuelo Page 11

12 Aportación de los sistemas de Tiempo de Vuelo El TOF es un cronómetro que mide el tiempo que tardan los diferentes iones en llegar al detector desde que se disparan en el PULSER. Los iones más ligeros llegan antes y los más pesados, más tarde. Ese tiempo se contrasta con una calibración del equipo t <-> m/z y sabemos con exactitud la m/z del ión. Genéricamente se entiende por masa exacta cuando el error en la medida es menor de 5 ppm. Los sistemas basados en SQ/QQQ suelen mostrar un error de masa > 150ppm. Error en la medida = (Masa Medida - Masa Calculada) X Masa Calculada = ppm 12

13 Cálculo de la Masa exacta y el Error en la Masa Medida Atom Mass of Atom # of Atoms Sum Hydrogen Carbon Nitrogen Oxygen Total Plus H Total Minus e O CH 3 N H H O H O N CH 3 O CH 3 O H O CH 3 O CH 3 O O CH 3 Calculated = exact or theoretical Reserpine (C 33 H 40 N 2 O 9 ) ( ) x Error si se omite el e- = ppm Ión Reserpina + H Ión = Reserpina + H + H + = H 1e -

14 Aportación de los sistemas de Tiempo de Vuelo TOF TOF Adquisición de todo el espectro (Full Scan) Tiapride 0.8 ppm QTOF QTOF Adquisición de todo el espectro (Full Scan) Adquisición del espectro MS/MS: Tiapride 0.8 ppm

15 Aportación de los sistemas de Tiempo de Vuelo Scoring basado en Masa Monoisotópica (varia en ppm) Distribucion Isotópica (varia en %) Isotope spacing (varia en ppm) El análisis por LC/MS TOF/QTOF de compuestos DESCONOCIDOS tiene como objetivo identificar ésos compuestos a través de : masa exacta perfil isotópico espectro MS/MS (QTOF) Además, el cromatograma Full Scan permite el análisis retrospectivo. 15

16 Molecular Feature Extractor (MFE) Desde la complejidad de los datos iniciales a la obtención de la informacion más relevante 2D 3D

17 Compuestos encontrados en extracto de espinaca Búsqueda por masa exacta en Base de datos An Application Kit for Multi-Residue Screening of Pesticides using LC/TOF or Q-TOF with a Pesticide Personal Compound Database August 5, 2009, EN Page 17

18 Agilent Personal Compound Database Bases de Datos de masa exacta (PCDL,.xls,.csv) Scoring basado en Masa Monoisotópica (varia en ppm) Distribucion Isotópica (varia en %) Isotope spacing (varia en ppm) Contienen 1600 Pesticidas y 7300 Compuestos Toxicilógicos recopilados de 5 laboratorios de control regional en Europa y Asia Scoring basado en masas monoisotopicas, isotope spacing/distribution Links a Chemspider y otras webs Customizable, abiertas a nuevos datos de ususario

19 Resultados del Screening usando MFE + PCDB de pesticidas COMPUESTOS TARGET - RTs conocidos Estándares inyectados COMPUESTOS NO TARGET - RTs desconocidos pero presentes en la DB Estándares no inyectados

20 TOF : Análisis Retrospectivo TIC of +TOF MS: from Sample 3 (Aceite MSPD 10 ppb) of Aceite MSPD calibration.wiff Max. 5.9e6 cps. 5.9e e6 5.6e6 5.4e6 5.2e6 5.0e6 4.8e6 4.6e6 4.4e6 4.2e6 4.0e6 Muestra analizada buscando 15 pesticidas solicitados (El Diuron no se encontraba en la lista ) 3.8e6 Intensity, cps 3.6e6 3.4e6 3.2e6 3.0e6 2.8e6 3 meses después, el cliente tiene problemas con Diuron. 2.6e6 2.4e6 2.2e6 2.0e6 1.8e6 Contenían las muestras Diuron hace 3 meses? e6 1.4e e6 1.0e e5 6.0e5 4.0e5 2.0e Time, min 20

21 TOF : Análisis Retrospectivo DIURON Fórmula empírica: C9H10Cl2N2O Masa Exacta : (El software incluye una calculadora de masas) Max. 1.4e4 cps. Intensity, cps 1.4e4 1.4e4 1.4e4 1.3e4 1.3e4 1.2e4 1.2e4 1.1e4 1.1e4 1.0e XIC diuron Time, min 21

22 Agilent Quick Start Application Kits El camino más rápido a la productividad Disponibles para GC, GC/MS, LC y LC/MS para: Análisis alimentario Análisis ambiental Análisis Forense/Toxicológico Análisis petroquímico Todo lo necesario para el éxito de su aplicación: Configuración ideal de instrumento + Bases de Datos & Software Consumibles específicos para la aplicación Documentación específica para la aplicación Muestras de test específicas para la aplicación Método en CD Herramientas de entrenamiento en video Chequeo opcional en fábrica Chequeo opcional de la aplicacion on-site

23 Flujo de trabajo óptimo para LC/MS 1200 Infinity LC Agilent LC/TOF/QTOF 1290 Infinity UHPLC Agilent 6460B LC/QQQ El TOF/QTOF detecta todo aquello que se ionice en la fuente Screening Confirmación Los compuestos se identifican por masa exacta Cuantificción Cuantificación

24 Características del diseño Cuadrupolo Simple Único Cuadrupolo Capilar dielectrico frio Cuadrupolos hiperbolicos Guía de iones octopolar 1º Cuadrupolo Guía de iones octopolar Espectro con iones del fondo (API: ESI, APCI, ) 210 SQ sólo deja pasar el ión Detector

25 Características del diseño Cuadrupolo Triple Cuadrupolo Simple Capilar dielectrico frio Cuadrupolos hiperbolicos Guía de iones octopolar

26 Características del diseño Triple Cuadrupolo 1º Cuadrupolo Capilar dielectrico frio Cuadrupolos hiperbolicos Guía de iones octopolar Celda de colision hexapolar Detección Off-axis Una bomba turbo 3 º Cuadrupolo Guía de iones octopolar Celda de colisión (hexapolo) Detector Espectro con iones del fondo (API: ESI, APCI, ) 210 Q1 sólo deja pasar el ión precursor 210 pass 210 Celda Colisión rompe el ión 210 (y sus productos) Q3 monitoriza sólo los fragmentos 158 y 191 característicos del ión 210 para cuantificar y cualificar con máx. sensibilidad TRANSICIONES (MRM) : 210 -> 158 (Quant) y 210 -> 191 (Qual)

27 Cuándo usar MS/MS? SQ ó QQQ? Cuando la Matriz es compleja se pueden producir Interferencias por coincidencia de los iones de cuantificación del analito con los de la matriz Permite la cuantificación selectiva de compuestos CONOCIDOS en muestras que presentan un elevado fondo químico Muestra Mejor S/N en matrices complejas que el que puede obtenerse por tecnologías que trabajan en Scan o SIM. Las exigencias de las normativas más actuales resultan más fáciles de cumplir gracias al poder de la confirmación MS/MS 14/11/2012

28 MS/MS: 283.8:213.9 Single MS: SIM Es más sensible MS/MS? 100 fg HCB Matriz Limpia 300 fg HCB - Diesel S/N=26:1 RMS S/N=6:1 RMS S/N=37:1 RMS S/N=86:1 RMS 14/11/ AITEX

29 Es más sensible MS/MS? SIM - EIC (246) MRM (246->176,175) Manzana S/N = 448 Col S/N = 241 Ginseng S/N = 446 Naranja S/N = 456 Espinaca S/N = 260

30 Rendimiento La última tecnología en LC Triple Quads Agilent ha desarrollado un nuevo LC Triple Quad cada año desde Triple Triple Quad Quad 6490 Triple Quad Tecnología ifunnel Triple Quad Triple Quad 6430 Cuantificación Rutinaria Análisis de Ultratrazas y alta 6460 velocidad Análisis de trazas en rutina Easy Choice Rango medio

31 Escalabilidad. S/N x Triple Quad LC/MS 6430 Triple Quad LC/MS x Triple Quad LC/MS 31 EMEAI CMS WebEx Training 7/22/2011

32 MRM dinámico (DMRM) Mejora de la sensibilidad basado en la especificidad de la transición a su tiempo Optimizer Si no se dispone de Kits de Agilent permite buscar los valores de adquisición óptimos para la cuantificación tmrm Confirmación espectral de los target sin barrido ni perdida de sensibilidad Page 32

33 Análisis por segmentos vs. MRM dinámico x Segmento 1 Segmento 2 Segmento 3 Segmento MRM Dinámico: No hay segmentos de tiempo Counts vs. Acquisition Time (min) La lista de MRM se confecciona de modo dinámico basándose en el RT de los compuestos de interés Menor tiempo de ciclo/mejor definición de pico

34 MRM dinámico Rt Tiempo de Ciclo Nº de Transiciones Concurrentes = x3 x4 x4 x3 x4 x2 x1 Selección de 24 transiciones de analitos Para ilustrar la eficacia de los Tiempos de Ciclo usando dynamic MRMs.

35 MRM dinámico Tiempo de Ciclo Nº de Transiciones Concurrentes = x3 x4 x4 x3 x4 x2 x1 Selección de 24 transiciones de analitos Para ilustrar la eficacia de los Tiempos de Ciclo usando dynamic MRMs.

36 Abundance >>> MRM dinámico - Simulación Concurrent Compounds Time >>>

37 Principios de funcionamiento de Dynamic MRM Time Segment 1 Time Segment 2 Time Segment 3 Time Segment 4 Time (min) MRM Compounds (10/block) Cycle Time (sec) Dynamic MRM Max Coincident Cycle Time (sec) Ciclos 2 x menores permiten manejar picos cromatográficos más estrechos, más analitos y dwell times mayores por compuesto

38 QQQ Analyte Optimizer: Máxima Sensibilidad Cuando NO se dispone de una Base de Datos de Fragmentor ni MRM Optimización Automática de 2 Settings clave Fragmentor Voltage Collision Energy

39 Triggered MRM (tmrm) Data Dependent : ~ Scan Especifico con la Sensibilidad y Rapidez de un MRM 1 MRM de monitorización por compuesto dispara hasta 8 MRM de confirmación de cada uno de los compuestos detectados Cuantificar e Identificar con la sensibilidad y rapidez de un MRM Secondary MRM Transitions are Triggered Triggered cycle (above threshold) Primary cycle (below threshold) Threshold Muy útil para cuantificación y confirmación masiva de analitos con Triple Cuadrupolo: análisis multiresiduos, metabolitos Página 39

40 tmrm Product Ion Spectrum x x > > > > > x x x x > 132 x > x > 147 x > x tmrm Product Ion Spectrum

41 tmrm Library Searching Tebufenpyrad Standard 50 ppb Library match score: 96.75

42 Control de 300 Pesticidas en matriz de manzana niveles de ppb cuantificados en 15 min con 1290 LC/6460 QQQ Residuos de Pesticidas La mayor parte de frutas y verduras en nuestras bolsas de la compra se cultivan con la ayuda de productos químicos que previene la presencia de insectos y malas hierbas. Los sistemas de salud pública controlan de modo regular los pesticidas presentes en aguas y alimentos.

43 Analysis of 300 Pesticides in 15 min. Agilent 1290 Infinity LC A Triple Quad with Agilent Jet Stream Technology ~600 Dynamic MRM Transitions 9 replicates analyzed at 200 pg level Mean area %RSD = 3.2, Mean height %RSD= 3.6 Agilent MassHunter Workstation Page 43 February-2009

44 Sistema Agilent LC-QQQ para el análisis en rutina de herbicidas neutros en aguas potables Enriquecimiento En-Linea

45 Requisitos de la directiva Europea Límites de detección de 10 ng/litro (10 ppt) por herbicida. Métodos NO ms tradicionales e.g lc-dad Extración de 5 litros en cartuchos SPE consume tiempo, disolventes y fungibles. Problemas de falsos positivos. Métodos Single Quad MS Mayior sensibilidad que los tradicionales pero pueden surgir interferencias en algún tipo de muestras (matriz compleja)

46 Pasos de operación 1. Carga de 900 ul de muestra de agua en el cartucho de enriquecimiento. 2. Giro de válvula, backflush desorbe mediante gradiente HPLC. 3. Separación en columna análitica y MRM QQQ. 4. Recondicionamiento del cartucho de enriquecimiento durante el análisis. 5. Listo para el siguiente análisis después de ~ 20 minutes.

47 Cartucho pequeño pero MUY importante 1. Mayor ahorro en costes. 2. Ayuda amortización. 3. Coste ~4 Euro/cartucho 4. Re-utilizable. 5. Bajo coste/muestra. 6. Material polimerico Styrene di-vinil benzeno. 7. Otros materiales SPE para diferentes compuestos.

48 Esquema del sistema enrichment columns high pressure gradient pump high pressure sampler column compartment with analytical column enrichment autosampler with 900ul head optional stream selection valve quaternary loading pump

49 Flujo de trabajo óptimo para GC/MS Agilent 7000B GC/QQQ Screening Confirmación Cuantificación

50 Y si las interferencias de matriz son muy graves: Posibilidad de MSMS 100 fg HCB AGILENT GCMS Ion Trap 220/240 AGILENT GCQQQ 7000B

51 Agilent 7000B Triple Quadrupole GC/MS Especificaciones Parámetros Especificaciones Agilent 7000B EI MRM Sensibilidad EI Scan Sensibilidad Resolución de masas MRM Velocidad de scan (transitions/sec) Minimo dwell time en MRM 100 fg OFN > 1500:1 RMS S/N, pg OFN scan desde 50 a 300 amu para ion 272 > 300:1 S/N Limite de detección instrumental IDL 12 fg Unidad de masas ajustable por tune, 0.7 a 2.5 Daltons ms Rango dinámico 10 6 Rango de masas (m/z) Velocidad de scan Celda de colisión 10 a 1050 Hasta 6,250 µ/s Hexapolo lineal con aceleración lineal

52 Precisión IUPAC USP Gold Book United States Limite de org/l03540.html detección Pharmacopeia instrumental 30 UE Method Validation And Quality Control Procedures For Pesticide Residues Analysis In Food And Feed. Document No. Sanco/10684/2009 IDL 12 fg EPA Analytical Detection Limit Guidance, 1996 Laboratory Guide for Determining Method Detection Limits Exactitud Desviación estandar

53 El limite de detección como un cálculo estadistico LD = t * SD LD es el limite de dtección t es el valor de la t de student (t=2.988 al 99% y 8 iny) SD e la desviacion estandar SD % RSD x100 x DL (area) = 2.988* SD (area) IDL conc t RSD 100 fg x 100 fg % RSD (2.988) (4) (100 fg) IDL conc 12 fg 100

54 IDL especifación basada en la reprodubilidad de la medida Caso real en un cliente en España 8 ínyecciones consecutivas, 1 μl, 100fg/μl OFN MS/MS transition of m/z Area precision: 2.0 % RSD IDLconc = (t * RSD * concentration)/100 (t para el 99% de confianza, n-1 grados de libertad=2.988) IDLconc = 6 fg

55 Inerte, fuente de alta temperatura (Igual que 5975) Analizador GC-MS/MS Lineal Dos cuadrupolos de cuarzo, monolitico, hipoerbólico recubierto de oro (igual que 5975) Detector de Triple eje (igual que 5975) Bomba Turbo Edwards Nuevo desarrollo, Celda de colisión hexapolar patentada He quenching

56

57 Técnicas básicas para los analizadores GCMS -Nuevo Inyector Multimodo para alto contenido en matriz (MMI) -Tecnologia de flujo capilar (CFT) -Bases de datos RTL -Sistemas cuadrupolo (SIM/SCAN) y Triple Cuadrupolo (MRM) -Material necesario para preparación muestra (QuEChERS)

58 La más completa base de datos MRMs con la máxima flexibilidad Contiene 7000 MRMs optimizados de 1000 pesticidas -- basados en más de 1000 inyecciones Máxima Flexibilidad permitiendo la optimización de métodos Promedio de 7 transiciones MRM por componente con sus intensidades relativas -- Muy util para evitar interferencias proveniente de la matriz Clasificado por compuestos, numero CAS etc. En formato excel -- Permite busquedas y ordenación fácil para realizar métodos Tres métodos cromatográficos con RTs y RI -- Permite máxima liberta para seguir flujo de trabajo del cliente Intensidades absolutas por cada transición MRM -- Permite una semi- cuantificación sin el uso de estandares

59 Analyzer 2.0 Update No sólo pesticidas Hasta 1100 compuestos con mas de 8000 transiciones MRM Pesticidas Ftalatos PBDEs PAHs PCB congeneres EPA 8270 target compounds Industrias Target: Alimentación y Medioambiente

60 Flexibilidad: 7 transiciones; clasificaciones; 3 RTs y RIs Base de datos con RTs (y RIs) para ser usado con hasta tres metodos de GC diferentes(cp, CF-target, and CF-screening). Peso molecular promedio y masa exacta Cada pesticida es clasificad con hasta dos categorias

61 The Flexibility: Excel format, relative and absolute intensity Excel MassHunter Format Las intensidades absolutas y relativas (Color Scales): Red denotes strong intensity and blue denotes weak intensity among ALL transitions. Un Ion de Cuantificacion y varios cualificadores por compuesto 61

62 62 Click para ordenar, esconder y mostrar los cualificadores

63 63 Ordenar para rápidamente seleccionar un Quant (Q0) y seleccionar los tres cualificadores (construccion sencilla de metodos)!

64 64 Click en el boton de ordenacion para seleccionar/mostrar los compuestos que serán añadidos al metodo de adquisición.

65 BARRIDO CON LCMS MASA EXACTA CUANTIFICACION CON LCMS QQQ OK PERO COMO?

66 Existe nueva tecnología que puede ayudarle a ser más productivo Implementarlo, requiere tiempo y personal cualificado? Agilent tiene la solución Page 66

67 Aportando las nuevas tecnologías justo a la línea de SALIDA Nuevos Analizadores y Kits de Agilent

68 Analizadores y Kits Trabajar mejor y más rápido, Con resultados de mayor confianza

69 Kits LCMS de Pesticidas Agilent Rápida puesta a punto Última tecnología para el análisis de multiresiduos Fácil adaptación Soluciones para sus NECESIDADES

70 Soluciones disponibles para Pesticidas HOY Pesticide Solution Suite #SP GC/MSD Pesticide DRS Screening Analyzer #SP GC/MSD Japanese Positive list Analyzer #SP GC/MS/FPD/uECD Pesticide DRS Screening analyzer #SP GC/MS/MS Pesticides CP Analyzer #SP GC/MS/MS Pesticides CF Analyzer G6854AA LC/(Q)TOF Pesticide Personal Compound Database kit G1733AA LC/QQQ Pesticides Dynamic MRM Database Kit

71 Iníciese rápidamente Application kit Columnas, consumibles y mezcla test Nota de aplicación y Guía de inicio rápida CD con los parámetros del método Bases de datos LCMS/PCDL para el rápido cribado

72 Application Kits para Target Screenning 72

73 Application Kits para Untarget Screening 73

74 CL LE E A RLY LY BE ET T TE E R MS S SSO OL LU UT TI OI ON NS S Preguntas? Mass Spectrometry Technology Products Solutions NEW NEW NEW