Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y Validación de Biomarcadores en Proteómica y Metabolómica y su Impacto en Rutas Metabólicas.

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1 Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y Validación de Biomarcadores en Proteómica y Metabolómica y su Impacto en Rutas Metabólicas. Jornada sobre Posibilidades de la Espectrometría de Masas en Laboratorios de Investigación. El poder del análisis comparativo de muestras en Alimentación, Proteómica y Metabolómica. Organizado por: Miguel Angel Martínez e Inmaculada Álvarez ICTAN-CSIC Madrid, 5 de Julio del :30-11:15 PCiTAL - UDL Isidro Masana Especialista Productos LC/MS Agilent Technologies Página 1

2 Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y Validación de Biomarcadores en Proteómica y Metabolómica y su Impacto en Rutas Metabólicas. Programa: 1.- Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y Validación de Biomarcadores en Metabolómica. 2.-Estrategias en el Descubrimiento de Biomarcadores en Proteómica. 3.- Estrategía de Biología Integrada: Análisis Multi-ómicos. 4.- Bases de datos y Bibliotecas de Espectros para la identificación de Metabolitos. 5.- Conclusiones Página 2 Página 2

3 La Importancia del Metaboloma RNA GENÓMICA Metabolómica: es el estudio DNA sistemático de las pequeñas moléculas orgánicas (metabolitos) presentes en un sistema biológico TRANSCRIPTÓMICA Proteinas PROTEÓMICA METABOLÓMICA CH 2 OH Metabolitos Metaboloma ~ Expresión final de las -omicas Página 3

4 La Importancia del Metaboloma y la Alimentación Genoma Proteoma El estudio de cambios en rutas metabólicas generados por agentes internos/externos permite: Conocer mejor la biología del organismo Prevenir futuras enfermedades. Prever efectos indeseados /deseados de fármacos, dietas, Mejorar la salud... Página 4

5 2 Tipos de Estudios Comparativos Metabolómicos: Genéricos y Específicos LC/MS-QTOF GC/MS-QTOF LC/MS-QqQ GC/MS-QqQ Comparación de Perfiles Genéricos del Metaboloma (metabolitos conocidos + desconocidos) Se trabajará con MS (TOF/QTOF) en modo espectral con masa exacta Típico para Descubrimiento de Nuevos Biomarcadores 5-40m Página 5 Comparación de Perfiles Específicos (metabolitos concretos) Se trabajará con QTOF/QqQ en modo MS/MS o en MS en modo selectivo Típico para Validación de Biomarcadores y diagnóstico Evaluar cambios en ciclos concretos del metabolismo

6 Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Metabolómicos de Perfilado Genérico (Descubrimiento/ Un-Targeted Metabolomics ) MS m/z exacta PCA GC-QTOF GC-MSD Página 6 Soft. Deconvolución: MFE Extraer automáticamente la información para cuantificar relativamente MILES de compuestos desconocidos El mismo flujo de trabajo puede aplicarse a Proteómica (excepto GC/MS y soft. Identificación)

7 La Clave para una Buena Comparación de la Composición de las Muestras Se debe asegurar la comparación de respuestas de los mismos compuestos entre las diversas poblaciones comparadas Página 7 04 de julio de 2012 Aplicaciones no -ómicas

8 Exactitud Masa (ppm) Fase Comparación Perfiles: Selectividad Cuantitativa de Cromatogramas de Iones con Masa Exacta. Nº posibles fórmulas empíricas Tecnología 165 ppm 209 QUAD/TRAP 10ppm 13 5 ppm 7 2 ppm 2 TOF /Q-TOF Comp.: Reserpina (C33H40N2O9). [M+H] + : m/z Ejemplo: 2ng/ml (2ppb) Clenbuterol en Orina IC: m/z - Ventana Extración 1 Da Clenbuterol S/N = 14 Rango extracción típico Cuadrupolo LC/MS-TOF Agilent 6210 IC: m/z - Ventana Extración Da S/N = 102 Qué masas extraer en un análisis NO dirigido? +/- 30ppm Página 8

9 Deconvolución Cromatográfica (3-D) con AMDIS (GC/MS) y Mass Hunter Molecular Feature Extractor (LC/MS) En muestras complejas 1 pico (TIC) suele estar formado por varios compuestos no resueltos y algunos del propio fondo TIC (suma de los 3) Componente 1 Componente 2 TIC & Espectro Picos deconvolucionados y espectros [M+H] + [M+Na] + Componente 1 Componente 3 Deconvolución E.C.C.: Suma de intensidades de sus iones específicos Componente 2 [M+H] + [M+Na] + [2M+H] + Componente 3 [M+H] m Página 9

10 Avanzado Algoritmo de Deconvolución LC/MS Mass Hunter Molecular Feature Extractor para obtener por la Masa Exacta de todos los Compuestos Ionizados en la Muestra Espectros Deconvolucionados Forma parte del soft. de TOF y Q-TOF Para cada analito exporta MPP: m/z, Tr, Intensidad 0 TIC ECC s Página 10

11 Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Metabolómicos de Perfilado Genérico ( Un-Targeted Metabolomics ) Buscar Correlaciones entre Grupos de Complejos Datos Espectrales MS m/z exacta Normalizar datos. ANOVA GC-QTOF PCA Página 11

12 Mass Profiler Profesional: Herramientas de Comparación Estadística de Conjuntos de Muestras Análisis Estadístico Admite Experimentos: Estudios simples (A vs. B) Estudios en función del tiempo, de condiciones múltiples, de dosificaciones varias,. Clasificación (/ Autentificación) de muestras, Proporciona Muy Potentes Herramientas Estadísticas y de Visualización Comparación: Filtrado simple (test de frecuencia) Test de relevancia (t-test, ANOVA 1 o 2 vías) Análisis de Componentes Principales (PCA) Agrupación ( Clustering K-means, SOM, QT clustering), Predicción de Clases (K-nearest neighbors / SVM) Árboles jerárquicos Complete, average and single linkage (w. bootstrapping) Gráficos Volcano, Diagramas de Venn, Incluye Herramientas de visualización de datos (cromatogramas, espectros, ),.. Con MS Agilent facilita reaprovechar la información obtenida (gran cantidad de datos) para mejorar la calidad de los resultados, p.e.: Flujos de trabajo recursivos para reinterrogar muestras con la información obtenida de otras (análisis NO dirigido Dirigido). Exportar la programación en el tiempo de los MS/MS de los compuestos relevantes para facilitar su identificación con Q-TOF s de Agilent... Página 12

13 Mass Profiler Profesional : Ejemplo combinación de Análisis de PCA con ANOVA LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/mta ANOVA replicados 564 estadísticamente fiables Proporciona una mucha mejor diferenciación de clases 2 3-INF 7-INF 5 6-RES 2 3-INF 7-INF 5 6-RES INF 3 Ensayos con Arroz salvaje 4 Ensayos con Arroz transgénico Página RES 7-INF +info: Nota de Aplicación Metabolomic Profiling of Bacterial Leaf Blight in Rice: EN 16-29m Permitiría evaluar si un tratamiento tiene un claro impacto en la composición de una muestra sin tratar control bacteria salvaje mod. genet.

14 Flujo de Trabajo RECURSIVO de Agilent en Estudios Comparativos Perfilado Genérico Específico Flujo Trab. RECUR- SIVO MS m/z exacta Interpretación Resultados PCA GC-QTOF Target Flujo Trabajo RECURSIVO Untarget Identificación metabolitos relevantes Ver sección 4 Página 14

15 Pathway Analysis Showing Differential Abundances For Three Metabolites In The Arginase Pathway In Malaria Infected Erythrocytes L-arginine [IRBC_pH9] avg :Raw [NRBC_pH9] avg :Raw L-ornithine [IRBC_pH9] avg :Raw [NRBC_pH9] avg :Raw citrulline [IRBC_pH9] avg :Raw [NRBC_pH9] avg :Raw Arginine Ornithine Citrulline Ciclo de la Urea Ver en que rutas metabolicas están involucrados los metabolitos relevantes del estudio diferencial Células sangre Infectada L-Arg Ornit. Citrul L-ornithine [IRBC_pH9] avg :Raw [NRBC_pH9] avg :Raw No infectados Nota de Aplicación An LC/MS Metabolomics Discovery Workfl ow for Malaria- Infected Red Blood Cells Using MPP & LC/QqQ MRM Confirmation EN Página 15

16 2 Tipos de Estudios Comparativos Metabolómicos: Genéricos y Específicos LC/MS-QTOF GC/MS-QTOF LC/MS-QqQ GC/MS-QqQ Comparación de Perfiles Genéricos del Metaboloma (metabolitos conocidos + desconocidos) Se trabajará con MS (TOF/QTOF) en modo espectral con masa exacta Típico para Descubrimiento de Nuevos Biomarcadores Comparación de Perfiles Específicos (metabolitos concretos) Se trabajará con QTOF/QqQ en modo MS/MS o en MS en modo selectivo Típico para Validación de Biomarcadores y diagnóstico Evaluar cambios en ciclos concretos del metabolismo Página 16

17 Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Metabolómicos de Perfilado Especifico ( Targeted Metabolomics ) LC-QqQ GC-QqQ Página 17

18 Pathway to Database Tool Convierte la información de los metabolitos involucrados en las rutas seleccionadas en una Agilent Personal Compound Database (PCDB). Ésta se utiliza para cuantificar relativamente esos metabolitos en un conjunto de muestras adquiridas con masa exacta (modo MS): Permite seleccionar las rutas metabólicas de interés. Elimina metabolitos redundantes. Búsqueda en la web información adicional de los metabolitos: CAS ID, Nombre IUPAC, Estructura Página 18

19 Seguimiento de Cambios de Expresión en Rutas Metabólicas en Perfilado Especifico ( Targeted Metabolomics ) Sin cambios de concentración Cambios de concentración entre las 2 poblaciones comparadas Página 19

20 Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y Validación de Biomarcadores en Proteómica y Metabolómica y su Impacto en Rutas Metabólicas. Programa: 1.- Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y Validación de Biomarcadores en Metabolómica. 2.-Estrategias en el Descubrimiento de Biomarcadores en Proteómica. 3.- Estrategía de Biología Integrada: Análisis Multi-ómico. 4.- Bases de datos y Bibliotecas de Espectros para la identificación de Metabolitos. 5.- Conclusiones 23-22m Página

21 Estrategia Metabolómica para el Descubrimiento de Biomarcadores en Proteómica Sano Off-Gel Electroforesis HPLC MS:QTOF Digestión Tríptica Enfermo Fraccionar por pi Análisis por LC/MS con masa exacta Identificación Proteínas Relevantes con Bases de datos + motor de Búsqueda Página 21 HPLC MS:QTOF Target LC-MS/MS con masa exacta Péptidos Relevantes Deconvolución cromatográfica de los datos masas Análisis Estadístico Multivariante / PCA entre las diversas poblaciones de muestras

22 Estrategia Clásica para Descubrir Biomarcadores: Proteómica Comparativa Geles-2D + MALDI TOF (TOF/TOF) : Gel 2D Separan Proteínas Intactas por Peso Molecular y pi Sano Huella Dactilar del Mapa Proteico 1. Digestión Tríptica in-gel Espectro MS -TOF: huella péptídica de 1 mancha (/proteína) Enfermo 2. MALDI-TOF: mapa masas péptidos Se analizan las manchas (spots) que muestran diferencias entre los 2 geles Opción 2D-DIGE: permitirá en 1 Gel combinar varias muestras etiquetadas con distinto colorante fluorescente. Identificación Proteínas mediante Bases de datos + motor de Búsqueda. Página 22

23 305 Cuantificación Relativa Multiplexada de Proteínas mediante LC/MS con Etiquetado Isotópico La estructura semejante de los péptidos permite etiquetar X muestras con distintas etiquetas isotópicas para poder analizarlas conjuntamente y cuantificarlas relativamente con 1 solo análisis (multiplexado). Técnicas de cuantificación relativa: Por metabolización SILAC (MS), Etiquetado antes digestión: ICAT (C13, D) (MS) (ver ejemplo en aptdo. 3) Después de la digestión: itraq (MS/MS), O 16/18 (MS),.. ITRAQ plex8: Mta 1 Mta 2 Mta 3 Mta 4 Pep-NH2 Pep-NH2 Pep-NH2 Pep-NH2 Mta 8 Pep-NH2 HPLC-Chip/QTOF Balance masa Reporter Ion * Agilent Spectrum Mill software. Permite cuantificar relativamente con cualquier tipo de etiquetado MS/MS plex 4 Página 23

24 Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y Validación de Biomarcadores en Proteómica y Metabolómica y su Impacto en Rutas Metabólicas. Programa: 1.- Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y Validación de Biomarcadores en Metabolómica. 2.-Estrategias en el Descubrimiento de Biomarcadores en Proteómica. 3.- Estrategía de Biología Integrada: Análisis Multi-ómico. 4.- Bases de datos y Bibliotecas de Espectros para la identificación de Metabolitos. 5.- Conclusiones 30-15m Página 24

25 Razones y Aportaciones de la Biología Integrada Extrema complejidad y variabilidad de los procesos biológicos. La inhibición de una ruta metabólica es habitual que genere la activación de otras vías alternativas. Mutaciones, defectos en la transcripción, modificaciones postraduccionales,.. La Integración de datos experimentales de las diferentes ómicas permitirá validar los resultados experimentales a través de una coherente interpretación biológica de los cambios de expresión observados entre distintas las distintas poblaciones de individuos/ tratamientos/ enfermedades/. comparadas en el estudio. Alternativa a validación biológica: la validación mono-ómica de biomarcadores requiere efectuarla con unos miles de individuos de cada población. Página 25

26 Mass Profiler Profesional 12: Muy potente Integración de Datos de Múltiples Plataformas para su Análisis Estadístico: Genómica, Proteómica y Metabolómica (LC-GC-CE/MS, ICP/MS),.. Incluyendo plataformas No Agilent. Proyectos Microarray-based, Q-PCR, NSG, Datos Genómica Experimentos de MS: datos de abundancia de compuestos medidas por MS (LC/MS, GC/MS, CE/MS, ICP/MS), Rutas Metabólicas Pathways : el nexo de union entre experimentos: transcriptómica / proteómica/ metabolómica Página 26

27 Estrategía de Biología Integrada: Análisis Multi-ómico Integrado de Rutas Metabólicas mediante Mass Profiler Professional (o GeneSpring GX). 1. Análisis NO Dirigidos de: 1. Transcriptoma (p.e. mediante µ-arrays mrna) 2. Metaboloma (mediante LC-GC/MS mayoritarios y minoritarios RMN sólo mayoritarios) 2. Reextraer los datos de TODOS los metabolitos involucrados en las rutas metabólicas involucradas. 3. Identificar las proteínas involucradas y realizar los ensayos dirigidos (típico LC/QQQ) para analizar estadísticamente los cambios cuantitativos del proteoma. MPP (o GeneSpring) Análisis NO dirigidos Correlacionar metaboloma con transcriptoma Análisis DIRIGIDO del proteoma Nuevo MPP 12 permite integrar datos de transcriptómica, metabolómica y proteómica Página 27

28 Análisis Multi-ómico en Mass Profiler Professional 12-IB: Cambios expresión representados en las propias rutas Gene Product Data Overlay Metabolite Data Overlay Enrichment Analysis on curated pathways (Wikipaths, KEGG,.) and computationally derived networks Página 28

29 Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y Validación de Biomarcadores en Proteómica y Metabolómica y su Impacto en Rutas Metabólicas. Programa: 1.- Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y Validación de Biomarcadores en Metabolómica. 2.-Estrategias en el Descubrimiento de Biomarcadores en Proteómica. 3.- Estrategía de Biología Integrada: Análisis Multi-ómico. 4.- Bases de datos y Bibliotecas de Espectros para la identificación de Metabolitos. 5.- Conclusiones 36-9m Página 29

30 Identificación de Metabolitos GC/MS Se realiza por búsquedas en bibliotecas universales de espectros de MS obtenidos por Impacto Electrónico (EI: técnica de ionización). Genéricas: Wiley ( espectros/ compuestos), NIST ( espectros y compuestos) Especificas de Metabolitos: Fiehn Metabolomics GC/MS RTL Library que incluye los espectros y Tiempos de Retención ( metabolitos volátiles algunos previa derivatización: aminoácidos, azúcares, ácidos orgánicos,...). Utiliza unas condiciones analíticas concretas. LC/MS No existen bibliotecas universales de espectros de MS o MS/MS. Se realiza por búsquedas en bases de datos de masa exacta/fórmulas empíricas; algunas contienen Tiempos de Retención de algunos metabolitos (para unas condiciones analíticas concretas). METLIN DB: incluye metabolitos endógenos (unos lípidos). Incluye ~700RT s METLIN DL: incluye DB + biblioteca de 9,000 espectros de MS/MS de ~2.300 metabolitos. (en unas determinadas condiciones de fragmentación con Agilent QTOF). Página 30

31 Ejemplo Resultados de Búsqueda en Biblioteca Universal de Espectros de GC/MS* *ionización por Impacto electrónico (EI) Página 31

32 LC/MS: Base de Datos METLIN Batch Search: La importancia del Tiempo de Retención Algunos metabolitos tienen la misma fórmula empírica se requiere su Tiempo de retención o espectros de MS/MS para poder diferenciar entre ellos. Load file for batch search Active metabolite structure Active mass Active mass search results Página 32

33 MS/MS y Tiempo de Retención: Una Valiosa Herramienta para la Identificación de Metabolitos RT= RT= Página 33

34 No identificados: Asignación Estructuras Moleculares Mass Structural Correlation (MSC) 2.-Propuesta Estructuras 1.-Iones Espectro MS/MS 3-Representación de la parte de la estructura propuesta que corresponde al ión remarcado 1.- MSC busca en internet posibles estructuras asociadas a la fórmula molecular. (p.e. Chemspider 30millones estructuras) 2.- MSC clasificará las estructuras según el nº de enlaces que hay que romper de la estructura del ión precursor, para encajar con la fórmula de cada uno de los iones producto. La probabilidad será mayor cuanto: menor sea el nº de enlaces a romper. menor nº de dobles enlaces a romper. Requiere la rotura de más enlaces mayor penalización Página 34

35 Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y Validación de Biomarcadores en Proteómica y Metabolómica y su Impacto en Rutas Metabólicas. Programa: 1.- Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y Validación de Biomarcadores en Metabolómica. 2.-Estrategias en el Descubrimiento de Biomarcadores en Proteómica. 3.- Estrategía de Biología Integrada: Análisis Multi-ómico. 4.- Bases de datos y Bibliotecas de Espectros para la identificación de Metabolitos. 5.- Conclusiones Página 35 Página 35

36 Conclusiones El estudio de cambios en el metaboloma permite evaluar el impacto sobre un organismo, tanto de factores internos (genoma/ proteoma/ enfermedades/ ) como externos (fármacos/ dieta, medio ambiente/ ). El metaboloma/proteoma es una excelente fuente de biomarcadores para diagnóstico, seguimiento de enfermedades, clasificación de pacientes, y estudios de impacto nutricional. La espectrometria de masas acoplada a cromatografía (LC/MS y GC/MS) y combinada con Bioinformática constituyen hoy en día la herramienta analítica más potente para proporcionar: PERFILES MASIVOS DE CIENTOS/MILES DE METABOLITOS/PEPTIDOS y correlacionarlos con diversas poblaciones de individuos/ pacientes Ya están disponibles comercialmente en el mercado: Cromatógrafos, Espectrómetros de Masas y Software para pasar: de IONES a RUTAS METABOLICAS Instrumentos y Software bioinformático con una visión multi-omica para abordar un enfoque de Biología Integrada (/Biologia de Sistemas). Página 36

37 Página 37

38 Preguntas? Estamos a su disposición en: customercare_spain@agilent.com Tel Isidre Masana Especialista de Productos LC//MS AGILENT TECHNOLOGIES isidre_masana@agilent.com Mass Spec/tacular Página 38