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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : G02B 21/00 G01J 3/36 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 knúmero de solicitud europea: k Fecha de presentación: k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Sistema de microscopio óptico de barrido confocal. k Prioridad: GB k 73 Titular/es: MEDICAL RESEARCH COUNCIL Laboratory of Molecular Biology Park Crescent London W1N 4AL, GB k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Amos, William Bradshaw k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Dávila Baz, Angel ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 1 ES T3 2 DESCRIPCION Sistema de microscopio óptico de barrido confocal. Campo de la invención Esta invención se relaciona con un sistema de microscopio óptico de barrido confocal. Antecedentes de la invención El microscopio óptico de barrido confocal se está utilizando ahora de forma profusa. En esencia, consiste en un medio para focalizar un haz de luz en un pequeño punto de una muestra y medios para recoger la emisión emitida o reflejada de dicho punto con el fin de formar una imagen mediante barrido sistemático del punto sobre una muestra. Una característica que define el instrumento confocal es la presencia de una abertura limitadora del haz en parte frontal del detector, que sirve para limitar la detección de la luz emitida a aquella que emerge de la proximidad inmediata del foco de iluminación. White, en la Patente US.032.7, describe el uso de un iris variable como dicha abertura, lo que permite buscar un compromiso entre la mejor discriminación de profundidad óptica, la cual se obtiene con la abertura cerrada por completo, y una alta intensidad de señal, la cual se obtiene cuando la abertura está abierta. Un análisis de esta ventaja ha sido publicado por Sandison et al, pp 39-1 en Handbook of Biological Confocal Microscopy, llnd Edn., Plenum Press, New York y London, 199. White describe también la división de la luz emitida en un microscopio confocal en más de un haz según la longitud de onda, por medio de reflectores cromáticos. Este principio ha resultado tener muchas aplicaciones, principalmente en la formación de imágenes de una pluralidad de manchas fluorescentes presentes de forma simultánea en la misma muestra. En una forma comercial ampliamente utilizada del instrumento de White, existen dos o tres de tales haces, cada uno de los cuales pasa luz a un iris variable separado, es decir, existen dos o tres aberturas confocales limitadoras del haz. El valor derivado de disponer de más de una abertura es que el diámetro puede ser ajustado de manera diferente en cada una de ellas. Esto es importante debido a que el compromiso antes mencionado se puede buscar de acuerdo con el brillo de cada mancha individual. Igualmente, el ancho óptimo teóricodelaaberturavariaconlalon- gitud de onda, de manera que un solo diámetro nunca puede ser óptimo de forma precisa para todas las longitudes de onda (van der voort, H.T. M. & Brakenhoff, G.J. (1990), J. Microscopy 18, pp 43-4). En el microscopio de White, la separación de los haces se consigue mediante el uso de reflectores cromáticos y además la separación de colores se consigue por medio de filtros de tipo barrera. Dado que ha sido considerado conveniente el hecho de poder distinguir colores, el uso de un espectrómetro en el recorrido de emisión de un microscopio confocal constituye un desarrollo evidente. Brakenhoff, en un diagrama publicado en la página 189 de Confocal Microscopy, editado por T. Wilson, Academic Press 1990, mostró como podía utilizarse un espectrómetro. La Fi gura 1 de los dibujos adjuntos ha sido construida a partir de la figura de Brakenhoff y sirve para clarificar la posición de los componentes en un microscopio confocal. En la Figura 1, la luz procedente de un láser 11 se pasa a través de una lente 12 y de una primera abertura, consistente en un orificio muy pequeño 13, desde la cual la luz emerge como un haz en expansión que se hace paralelo mediante la lente 14. Desde la lente 14 la luz es reflejada por el reflector cromático 1 de manera que pasa al interior de una lente 16 del objetivo del microscopio y es llevada hacia un foco, normalmente como un punto de difracción limitada sobre una muestra en 17. Parte de la luz emitida desde la muestra pasa al interior de la lente 16 y el comportamiento cromático del reflector 1 se elige de manera que la luz emitida sea transmitida por este reflector 1 en lugar de ser reflejada. El haz transmitido pasa a través de un filtro de barrera 18, el cual absorbe la luz lasérica indeseada, y es focalizado por la lente 19 sobre una abertura confocal en. Para el funcionamiento adecuado de un microscopio confocal es esencial que esta abertura se encuentre en una posición ópticamente conjugada con respecto al foco sobre la muestra; en otras palabras, la muestra es focalizada sobre esta abertura. En la terminología óptica convencional, la abertura confocal es un diafragma del plano de imagen. La Figura 1 muestra como la luz que ha pasado a través de la abertura confocal en es pasada, en el esquema de Brakenhoff, a través de un medio de dispersión espectral, tal como un monocromador 21, y la luz emitida es pasada finalmente a un detector unitario tal como un tubo fotomultiplicador 22. La corriente fotoeléctrica del tubo fotomultiplicador 22 se emplea como una medida de la intensidad de la luz en la gama de longitudes de onda seleccionadas por el monocromador21ypermitelaconstrucción de una imagen en memoria de ordenador en el caso de que el punto de luz sea barrido sistemáticamente sobre la muestra. Para poder registrar imágenes procedentes del espectrómetro (tubo fotomultiplicador 22) en más de una longitud de onda simultáneamente, un posible desarrollo del sistema propuesto por Brakenhoff es que el espectrómetro sea del tipo multicanal. Esto ha sido propuesto de forma explícita por Engelhardt en la Solicitud PCT WO 9/ Esta combinaciónde latécnica conocida de espectrometría con un aparato conocido para microscopía confocal funciona bien y presenta la ventaja de ser más flexible que el diseño de reflector fijo descrito por White. Sin embargo, es inferior al diseño de White ya que no se puede utilizar una pluralidad de aberturas confocales, cada una de ellas para una gama de longitud de onda diferente. Dado que toda la luz detectada es pasada a través de una sola abertura confocal, se pierden así las ventajas antes indicadas derivadas del uso de múltiples aberturas. La presente invención está dirigida a solucionar esta dificultad, permitiendo el uso de múltiples aberturas confocales en combinación con la detección espectral multicanal. De hecho cosiste en una forma de espectrómetro formador

3 3 ES T3 4 de imágenes que es de construcción simple y que puede integrarse fácilmente en un microscopio óptico de barrido confocal. En PAJ se describe un sistema de barrido en donde las aberturas limitadoras del haz no se encuentran en cada uno de los planos secundarios. La invención De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un microscopio de barrido confocal según la reivindicación 1. Otras modalidades quedan definidas en las reivindicaciones dependientes. Con preferencia, la región o zona restringida de la muestra es representada como una imagen en una imagen primaria. Descripción de la modalidad En los dibujos adjuntos: La Figura 1 es ilustrativa del estado de la técnica. La Figura 2 ilustra una modalidad de microscopio óptico de barrido confocal de acuerdo con la presente invención. De acuerdo con la invención, se proporciona una modificación del diseño convencional de un microscopio óptico de barrido confocal. Las partes conocidas y convencionales corresponden a aquellas partes del camino de luz mostrado en la Figura 1 hasta el punto en donde la luz emitida de la muestra entra en la lente 19. La modificación semuestraenlafigura2. En la Figura 2, se muestra la luz procedente de la muestra entrando en la lente 23, la cual ocupa una posición en el microscopio confocal equivalente a la posición ocupada por la lente 19 en la Figura 1. La lente 23 focaliza la luz desde un punto de la muestra a un punto situado en un plano de imagen 24 a un punto situado en plano de imagen 24 (el plano de imagen primaria). Desde el plano 24, la luz pasa al interior de otra lente 2 de distancia focal más corta que la lente 23, la cual retransmite una imagen aumentada del foco puntiforme en el plano 24 a un plano 27 que es conjugado con el plano del foco dentro de la muestra y que se encuentra en la abertura de la lente 26. Desde la lente 26 la luz pasa a través de un medio dispersor, consistente en un prisma, prisma compuesto o prismas múltiples o rejilla de difracción, simbolizado en el diagrama por el prisma 28. La referencia 29 representa un reflector opcional o una pluralidad de reflectores opcionales, que podrían utilizarse en cualquier punto del camino de luz para producir un plegado del haz conveniente para introducir el aparato en un pequeño espacio. La luz pasa entonces hacia la lente y, dentro de esta lente o en proximidad inmediata a la misma, se produce un espectro óptico, consistente en una dispersión lineal de imágenes del haz en la abertura de la lente 2, por medio de la acción focalizadora de la lente 26 junto con la acción dispersante del medio dispersor 28. En la Figura 2, las imágenes múltiples vienen indicadas por las pequeñas flechas verticales en 31 y se muestran como separadas; en realidad, la luz estará compuesta normalmente por una gama continua de longitudes de onda, de manera que las imágenes serían infinitas en cuanto a su número y cualquier punto individual de la serie en 31 se iluminaría mediante imágenes superpuestas. Como es bien conocido en el campo de la espectroscopia, la resolución de este espectro proyectado es más grande cuanto más pequeña sea la extensión angular de una imagen monocromática con respecto a la dispersión angular de acuerdo con la longitud de onda. Cerca del plano de las imágenes en 31 (es decir, los planos del foco espectral) se encuentra un medio separador del haz, ajustable, representado por un deflector opaco 32 y un reflector plano 33. La luz de longitudes de onda correspondientes a uno de los extremos del espectro cae sobre el deflector 32 y es absorbida. La luz de la región intermedia del espectro pasa entre el deflector 32 y el reflector 33 y es llevada a un foco de plano de imagen en una abertura 34 que contienen un plano de imagen secundaria. El plano de esta abertura contiene una imagen focalizada de la muestra y la abertura 34 funciona por tanto como una abertura confocal que controla el paso de luz hacia el detector 3. La luz del otro extremo del espectro es reflejada por el reflector 33 y es llevada a una foco en una abertura 36 que contiene un plano de imagen secundaria, la cual es una segunda abertura confocal que controla el paso de luz hacia el detector 37. En la abertura 36 se forma una imagen de la muestra similar a la formada en la abertura 34, excepto que está constituida por diferentes colores, de acuerdo con la gama de longitud de onda seleccionada, a través de la alteración de la posición del reflector 33 y del deflector 32. Las aberturas 34 y 36 están situadas en focos conjugados entre sí yconelfocoprimarioenelplanode imagen 24. Alternativa o adicionalmente, se pueden incorporar filtros ópticos 38 en los caminos de luz que conducen a las aberturas 34 y 36. Quedan contempladas modalidades de la invención en donde se utilizan reflectores para subdividir el espectro de otras formas, por ejemplo en más de dos segmentos, los cuales mediante el uso de deflectores adicionales, pueden ser delimitados adicionalmente y pueden hacerse no contiguos. Igualmente, quedan contempladas aquellas modalidades que contienen más de dos detectores confocales, cada uno de ellos con su propia abertura independientemente variable. En una construcción particular de la modalidad de la Figura 2, el haz que entra en la lente 23 tiene un diámetro máximo de 2 mm, dependiendo del diámetro de la pupila de salida de la lente usada en el objetivo. La relación de distancias focales de las lentes 23 a las lentes 2 fue de 18:1, con el resultado de que el diámetro del haz en la abertura de la lente 2 era nominalmente de 2/18 o 0,11 mm. La lente 26 consistió enun doblete acromático de 0 mm de distancia focal utilizado para producir una imagen de la abertura de la lente 2 con un aumento unitario en el plano del espectro 31. Esta imagen, en el caso de que seformeconluzmonocromática, tenía un tamaño nominal de 0,11 mm. El medio dispersor 28 consistió en un prisma equilateral de cristal de sílex de alta dispersión que proporcionó un espectro que se extiende en 2 mm desde violeta ( nm) a rojo ( nm). La resolución nominal en este espectro, despreciando los defectos de difracción 3

4 ES T3 6 y el astigmatismo, es de 0,9 nm, lo cual es más que suficiente para la separación de los colorantes fluorescentes actualmente utilizados. Cuando el reflector 33 y el deflector 32 se retiraron del sistema, toda la luz transmitida por la lenta fue pasada hacia la abertura 34. Cuando se pasó entonces luz blanca procedente de una fuente de tungsteno-halógeno al interior del microscopio, la imagen de la región característica de la muestra en la abertura 34 fue de color blanco. Cuando el reflector 33 se insertó trasladándolo en el plano de la superficie reflectante, apareció, en el plano de la abertura confocal en 36, una imagen de la misma regióndelamuestracomolaobservada en la abertura 34, pero de un color rojo relativamente uniforme, siendo este el color de la porción del espectro reflejado por el reflector 33. Al mismo tiempo, la imagen en la abertura 34 asumió la tonalidad complementaria (azul-verde) debido a que recibió todas las longitudes de onda menos la de color rojo

5 7 ES T3 8 REIVINDICACIONES 1. Un sistema de microscopio óptico de barrido confocal que comprende un microscopio óptico de barrido confocal que produce un haz de luz que forma una imagen de una región restringida de una muestra en un plano de imagen primaria (24), un medio óptico dispersivo (28) que recibe el haz procedente de dicho plano de imagen primaria y que produce un despliegue espectral linealmente dispersado de la luz formadora de imágenes, medios focalizadores () para formar imágenes secundarias de la misma región de la muestra, de diferentes regiones de dicho despliegue espectral de la luz formadora de imágenes, caracterizado porque comprende una abertura limitadora del haz (34, 36) en cada plano de imagen secundaria y una pluralidad de detectores (3, 37) que reciben luz a través de las respectivas aberturas limitadoras del haz (34, 36). 2. Un sistema según la reivindicación 1, caracterizado porque cada abertura limitadora del haz (34, 36) es de tamaño ajustable. 3. Un sistema según la reivindicación 2, caracterizado porque cada abertura limitadora del haz (34, 36) comprende un diafragma de iris variable. 4. Un sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el medio óptico dispersivo (28) comprende al menos un prisma óptico.. Un sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque una pri mera lente (2) reproduce la imagen en el plano de imagen primaria (24) en el plano de abertura de una segunda lente (26), con lo que el despliegue linealmente dispersado de luz formadora de imágenes se genera en una posición más allá del medio óptico dispersivo (28). 6. Un sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 a, caracterizado porque incluye un medio óptico separador del haz (32, 33) para dirigir la luz focalizada desde diferentes puntos del despliegue de imágenes espectralmente diferentes a las aberturas limitadoras del haz (34, 36) en las cuales se forma una serie de imágenes, espacialmente desplegadas, del plano de imagen primaria, cada una de ellas confinada a una gama de longitud de onda diferente a la gama de longitud de onda en las otras aberturas limitadoras del haz (34, 36). 7. Un sistema según la reivindicación 6, caracterizado porque el medio separador del haz (32, 33) es ajustable para permitir la variación de la gama de longitud de onda de la imagen en cada abertura limitadora del haz (34, 36). 8. Un sistema según la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque incluye medios de filtración óptica (38) en al menos uno de los caminos de luz que forman la serie de imágenes desplegadas espacialmente. 9. Un sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó8,caracterizado porque un medio de redirección óptica (29) actúa para plegar el camino o caminos de luz entre el plano de imagen primaria y los detectores NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluída en la mencionada reserva.

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