11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : C12Q 1/04. Número de solicitud europea: kfecha de presentación:

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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : C12Q 1/04 C12Q 1/00 C12Q 1/02 G01N 1/00 A61L 17/00 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 k Número de solicitud europea: kfecha de presentación: k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Procedimiento mejorado para la tinción Gram de tres reactivos y equipo para llevarlo a cabo. kprioridad: US k Titular/es: DIFCO LABORATORIES 1180 Ellsworth Road Ann Arbor, Michigan 488, US k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Meszaros, Amy Taylor y Strenkoski, Leon F. ES T3 k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: Aviso: k 74 Agente: Carpintero López, Francisco En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCION Procedimiento mejorado para la tinción Gram de tres reactivos y equipo para llevarlo a cabo La presente invención se refiere a un reactivo y a un procedimiento de tinción para bacterias. Más particularmente, la presente invención se refiere a un reactivo para tinción Gram que combina un decolorante y un tinte complementario y un procedimiento de tinción Gram de tres reactivos. La tinción Gram es una técnica microbiológica bien conocida y ampliamente usada para la clasificación e identificación de bacterias. En hospitales y laboratorios clínicos, la tinción Gram es una de las pruebas que más frecuentemente se llevan a cabo para el diagnóstico microbiológico. Esencialmente, la tinción Gram divide el mundo de las bacterias en dos clasificaciones distintas: bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas. La separación entre estas dos clases se basa en las diferencias en la estructura de las paredes bacterianas. El procedimiento convencional y más comúnmente utilizado de la técnica de tinción Gram requiere el uso de cuatro reactivos por separado. Los reactivos consisten en una primera disolución de tinción que normalmente contiene un tinte violeta cristal, una disolución de mordiente que normalmente contiene una disolución de yoduro yodo-potásico, un reactivo decolorante, normalmente una disolución de acetona y alcohol, y una disolución de un tinte complementario que normalmente contiene safranina. El procedimiento convencional implica las siguientes etapas: (1) se trata un portamuestras que tiene las bacterias fijadas sobre el mismo con el tinte principal, esperando de a segundos; (2) se enjuaga el portamuestras con agua; (3) se trata el portamuestras con la disolución de mordiente, esperando de a segundos; (4) se enjuaga el portamuestras con agua; () se decolora el portamuestras con una disolución de acetona y alcohol, esperando de a segundos; (6) se enjuaga el portamuestras con agua; (7) tinción complementaria del portamuestras con una disolución de safranina o fucsina durante - segundos y (8) se enjuaga el portamuestras con agua. Sólo cuando se han completado estas etapas pueden observarse y analizarse las bacterias fijadas al portamuestras para determinar su estado Gram. Típicamente, las bacterias Gram positivas aparecen con color morado, mientras que las bacterias Gram negativas aparecen de color rosa-rojizo. Resulta obvio, a partir de la descripción anterior del procedimiento convencional de tinción Gram, que el procedimiento convencional de tinción Gram es un procedimiento muy enrevesado, consume mucho tiempo y requiere un gran esfuerzo. Cada etapa adicional introduce la posibilidad de un error que puede conducir a una identificación incorrecta o no concluyente de la bacteria. Una tinción Gram que da como resultado una identificación no concluyente o incorrecta de una muestra bacteriana debe repetirse o deben realizarse otras pruebas de diagnóstico para identificar más fehacientemente la muestra bacteriana. En cualquier caso, cuando no se obtiene una identificación concluyente se retrasa el inicio de un tratamiento efectivo. Durante años, los técnicos que utilizan el procedimiento convencional de tinción Gram han quedado insatisfechos por estos resultados inconsistentes. La mayor parte de la inconsistencia es directamente atribuible al propio procedimiento convencional. Por ejemplo, la etapa de decoloración es problemática porque es difícil conseguir la cantidad apropiada de decoloración de la bacteria. En otras palabras, la decoloración, la etapa en la que se retira el tinte violeta cristal fijado a los organismos Gram negativos, es propensa a la inconsistencia. La inconsistencia es producto de las dificultades asociadas con la cantidad de disolvente decolorante aplicado a las bacterias y con la cantidad de tiempo durante el que se permite el contacto entre el disolvente decolorante y la bacteria. Si el disolvente decolorante se aplica en grandes volúmenes o se aplica demasiado vigorosamente, las bacterias de la muestra pueden quedar poco teñidas, y pueden dar un resultado potencialmente inconsistente o incorrecto, esto es, una bacteria Gram positiva verdadera puede parecer que es una bacteria Gram negativa. Si, por otra parte, una muestra de bacterias no se decolora adecuadamente, las bacterias de la muestra pueden quedar demasiado teñidas, y pueden dar un resultado potencialmente inconsistente o incorrecto, esto es, una bacteria Gram negativa verdadera puede parecer que es una bacteria Gram positiva. Utilizando el método convencional de tinción Gram de cuatro reactivos, ciertas bacterias puede parecer que son tanto Gram positivas como Gram negativas. Se hace referencia en la técnica a estas bacterias como bacterias Gram variables. Las bacterias Gram variables presentan un único desafío para el técnico porque el resultado de una tinción Gram puede dar tanto bacterias Gram positivas como Gram negativas o las bacterias pueden teñirse de tal manera que es imposible determinar el estado Gram de las bacterias. En lugar de aparecer de color morado las bacterias Gram positivas y de color rosa-rojizo las Gram negativas, las bacterias aparecen de color morado amarronado o simplemente marrones. Un resultado como este hace difícil la identificación y clasificación de una muestra de bacterias, como se describe más adelante. 2

3 1 2 3 Además de la inconsistencia, el procedimiento convencional de tinción Gram necesita más tiempo para llevarse a cabo, esto es, un reactivo adicional añade al menos otro periodo de aplicación de un minuto y agua adicional para el lavado. Además, el procedimiento convencional de tinción Gram es más costoso, ya que los costes se incrementan típicamente cuando más reactivos se utilicen y hay un coste asociado con un técnico o una máquina que lleve a cabo las manipulaciones adicionales relacionadas con el reactivo adicional. La patente de Estados Unidos número de Reuben describe un procedimiento para la tinción de bacilos acidorresistentes en el que se utiliza una disolución decolorante con tinte complementario que contiene azul de metileno, alcohol etílico, hidróxido potásico, glicerol, ácido acético y polivinilpirrolidona. Sin embargo, la disolución decolorante con tinte complementario y el procedimiento para su uso descrito en la patente de Reuben son para llevar a cabo una tinción acidorresistente y no para una tinción Gram. A diferencia de la tinción Gram, la tinción acidorresistente depende de los lípidos que contienen las paredes de las células de Micobacterias y está dirigido principalmente para su uso con estos bacilos acidorresistentes. Ha habido otros intentos para hacer más eficiente el procedimiento convencional de tincióngram y los reactivos. En la patente de Estados Unidos número de Di Ianni se describe un procedimiento de tinción Gram en el que el número de reactivos individuales se reduce combinando el mordiente y el decolorante en un único reactivo compuesto por una sal compleja de yoduro de yodo y un alcohol disolvente. La patente Di Ianni trata de hacer más eficiente tanto el procedimiento de tinción Gram como también proporcionar una disolución de mordiente más estable y duradera. Desafortunadamente, este procedimiento proporciona resultados inadecuados y, además, no tiene utilidad real, como se describe en detalle más adelante. Por lo tanto, se deduce que simplemente la combinación de reactivos del procedimiento convencional de tinción Gram no da como resultado necesariamente un procedimiento mejorado o resultados inesperados. Además, la mera combinación del tinte complementario y el decolorante sin ajustar el ph a aproximadamente 4, no proporciona una mejora pronunciada sobre los procedimientos de tinción Gram de la técnica anterior. La presente invención no sólo hace más eficiente el procedimiento de tinción Gram, sino que aporta los beneficios añadidos de precisión mejorada y se lleva a cabo eliminando los problemas que vienen de antiguo como demasida/poca decoloración y variabilidad. Según la presente invención se proporciona un procedimiento para la tinción Gram de una muestra que contiene bacterias. Dicho método comprende las siguientes etapas: (a) tinción de las bacterias Gram positivas en la muestra; 4 (b) fijación del tinte a las bacterias Gram positivas; y (c) decoloración y tinción complementaria simultáneamente de bacterias Gram negativas en la muestra en una disolución que tiene un ph entre 1 y 6. Se reconocen fácilmente otras ventajas de la presente invención cuando las mismas se entienden mejor, haciendo referencia a la siguiente descripción detallada cuando se considera en conexión con los dibujos que la acompañan: La FIG.1 es una fotografía de un de Bacillus megaterium ATCC 1481, un organismo Gram positivo, quesehateñido por el procedimiento Gram tradicional de cuatro etapas. 0 La FIG.2 es una fotografía de un de Bacillus megaterium ATCC 1481, un organismo Gram positivo, que se ha teñido por el procedimiento Gram de tres etapas de la presente invención. La presente invención proporciona un procedimiento para la tinción Gram de muestras que contienen bacterias y otras células. Antes de comenzar el procedimiento de tinción Gram que se trata, en primer lugar se obtiene una muestra bacteriana y se fija a una estructura de soporte. Las bacterias pueden obtenerse de cualquier fuente adecuada como cultivos puros, la supuración de una herida, una mancha de sangre, una muestra de esputo o similares. Las bacterias se fijan a la estructura de soporte (que puede ser un portamuestras de cristal para microscopio) por calentamiento, tratamiento con alcohol u otro medio adecuado para la fijación conocido de la técnica. La primera etapa en el procedimiento que se trata es la tinción de las bacterias fijadas en el portamuestras con una disolución reactiva que contiene un tinte primario capaz de teñir bacterias Gram 3

4 positivas. El tinte primario preferido para teñir las bacterias Gram positivas es el violeta cristal, al cual a veces se hace referencia como violeta genciana. Se disuelve el tinte violeta cristal en un disolvente que típicamente es agua o un alcohol como etanol o isopropanol. La disolución de violeta cristal puede incluir algunos componentes minoritarios, como fenol o anilina, que se añaden para incrementar la solubilidad y estabilidad del violeta cristal en la disolución. La tinción de las bacterias fijadas al portamuestras incluye la aplicación de la disolución de violeta cristal a las bacterias fijadas al portamuestras utilizando cualquier medio adecuado como una botella comprimible, un cuentagotas o cualquier otro medio adecuado para aplicar la disolución. La etapa de tinción también incluye un periodo de aplicación durante el cual se permite a la disolución de violeta cristal incubar o contactar con las bacterias durante un periodo de tiempo, típicamente un minuto. Después del periodo de aplicación, las bacterias fijadas al portamuestras se lavan abundantemente con agua para eliminar cualquier exceso de la disolución de violeta cristal. Después de la etapa de tinción, se aplica a las bacterias una disolución de mordiente para fijar el tinte primario a las bacterias. La disolución de mordiente forma compuestos insolubles con el tinte primario, es decir, el tinte violeta cristal presente en las bacterias se altera de manera que sólo permanece retenido por las bacterias Gram positivas. La disolución de mordiente típicamente contiene una sal compleja de yoduro de yodo disuelta en un disolvente, como por ejemplo agua. El yoduro que contiene la sal compleja de yoduro de yodo generalmente es yodo cristalizado. La sal de yoduro puede ser cualquier sal de yodo pero generalmente es una de las siguientes: yoduro potásico, yoduro sódico, yoduro magnésico, yoduro de aluminio, yoduro de zinc y yoduro ferroso. Adicionalmente, la disolución de mordiente puede contener yodo complejado con polivinilpirrolidona. La disolución de mordiente puede estar compuesta también por una preparación de yodo concentrado/diluido. La preparación de yodo concentrado/diluido proporciona un medio más estable para el transporte y adición durante el tiempo que la disolución puede conservarse sin que se deteriore. La fijación del tinte violeta cristal a las bacterias se lleva a cabo mediante la aplicación de la disolución de mordiente a las bacterias fijadas al portamuestras utilizando cualquier medio adecuado como una botella comprimible un cuentagotas, o cualquier otro medio adecuado para la aplicación de la disolución. La etapa de fijación también incluye un periodo de aplicación durante el cual se permite a la disolución de mordiente incubar o contactar con las bacterias durante un periodo de tiempo, típicamente un minuto. Después del periodo de aplicación, las bacterias que se han fijado al portamuestras y se han tratado previamente con la disolución de mordiente se lavan abundantemente con una disolución que combina un decolorante y un tinte complementario para eliminar cualquier exceso de la disolución de mordiente. Esta etapa final en el procedimiento de tinción Gram que se trata decolora y tiñe complementariamente de manera simultánea las bacterias tratadas previamente fijadas al portamuestras. La etapa de decoloración ytinción complementaria simultáneas de las bacterias fijadas al portamuestras permite la eliminación de cualquier tinte violeta cristal fijado a las bacterias Gram negativas (decoloración), lo cual, debido a la estructura de sus paredes bacterianas, no retiene el tinte violeta cristal fijado, y al mismo tiempo tiñe las bacterias con un segundo tinte capaz de teñir las bacterias Gram negativas (tinción complementaria). En la etapa final del procedimiento que se trata, se aplica un tinte complementario a las bacterias para teñir las bacterias Gram negativas con un tinte diferenciador para permitir la identificación de las bacterias Gram negativas. En otras palabras, se aplica una disolución a las bacterias que elimina el tinte violeta cristal fijado a cualquier bacteria Gram negativa presente en la muestra bacteriana mientras que simultáneamente se introduce un segundo tinte en las mismas bacterias Gram negativas para permitir la diferenciación de las bacterias Gram positivas y las Gram negativas. La etapa de decoloración y tinción complementaria simultáneas de las bacterias Gram negativas se lleva a cabo aplicando una disolución que combina un decolorante y un tinte complementario a las bacterias fijadas al portamuestras. La disolución que combina un decolorante y un tinte complementario incluye un disolvente para la eliminación del tinte violeta cristal fijado a las bacterias Gram negativas un tinte complementario para teñir las bacterias Gram negativas y una disolución tampón. En la realización preferida, el disolvente es etanol, pero puede ser metanol, isopropanol, cloroformo o acetona. Adicionalmente, en el disolvente puede incluir agua en concentraciones dentro del intervalo 0-2 %, preferiblemente alrededor de un %. La disolución que combina un decolorante y un reactivo para la tinción complementaria incluye también un tinte capaz de teñir bacterias Gram negativas. El tinte puede ser cualquier tinte complementario como fucsina o safranina en concentraciones de 0,02 % a 0,0% y 0, % a 0,80 % respectivamente. En la realización preferida, el tinte complementario es una mezcla de safranina y fucsina básica, pero puede ser sustituido por cualquier otro tinte adecuado como tinte complementario adicional para el uso combi- 4

5 nado con safranina como fucsina ácida o tinte rojo neutro. En la realización preferida, la concentración de safranina en la disolución reactiva para la decoloración y tinción complementaria simultáneas de las bacterias Gram negativas puede variar entre 0, % y 0,80 %. La concentración preferida de safranina está alrededor del %. La concentración del tinte complementario adicional, que en la realización preferida es fucsina básica, puede variar entre 0,02 % y 0,0% aproximadamente. La concentración preferida de fucsina básica es de aproximadamente el %. La concentración de etanol en la disolución reactiva para la para la decoloración y tinción complementaria simultáneas de las bacterias Gram negativas puede variar entre 7 % y 0 % aproximadamente, y preferiblemente es del 90 %. Para potenciar la calidad de la tinción de la muestra, puede añadirse un mordiente a la disolución que combina un decolorante y un tinte complementario. La adición de un mordiente en esta etapa actúa potenciando el resultado de la tinción fijando el tinte complementario en aquellas células en las que los tintes complementarios se agarran. Es decir, justo cuando el mordiente aplicado durante la etapa de fijación se compleja con el tinte Gram positivo para prevenir que el tinte se lave de las células Gram positivas, el mordiente aplicado durante la etapa de etapa de decoloración y tinción complementaria simultáneas trabaja para fijar el tinte Gram negativo a las células Gram negativas. Entre los mordientes adecuados se incluyen fenol, anilina, formalina o mordientes similares. En la realización preferida, el mordiente es fenol. La concentración del mordiente puede variar entre 1 % y %; sin embargo, en la realización preferida la concentración del mordiente, esto es, fenol, es de aproximadamente un %. Además de los constituyentes que comprende la disolución que combina un decolorante y un tinte complementario, también el ph de la disolución es crítico para la presente invención. El intervalo de ph óptimo para la disolución que combina un decolorante y un tinte complementario se encuentra en el intervalo ácido entre ph=1 y ph=6. El ph preferido para la disolución es aproximadamente ph=4,. La acidificación es crítica para resolver y diferenciar las células de mamíferos que pueden estar presentes en una muestra clínica. Si no se ajusta el ph de la disolución que combina un decolorante y un tinte complementario en este intervalo, son difíciles de distinguir y resolver las células de mamíferos como los leucocitos polimorfonucleares (PMN s), células mononucleares, células epiteliales y células de similar tipo de un portamuestras con bacterias teñidas por el procedimiento Gram. Estas otras células pueden ser de gran ayuda en el diagnóstico y tipificación de bacterias ya que son indicadores importantes de la inflamación y la calidad de la muestra. La manipulación del ph de la disolución causa efectos directos sobre los resultados de la tinción Gram de bacterias y células de mamíferos. Sin el ph adecuado, las bacterias demasiado decoloradas y las células de mamíferos no se tiñen en absoluto. La disolución que combina un decolorante y un tinte complementario de la presente invención puede usarse también para teñir específicamente células de mamíferos, como leucocitos polimorfonucleares, en una muestra que adicionalmente puede contener bacterias o no. Es decir, a este ph crítico las células de mamíferos pueden teñirse y, por tanto, visualizarse. En otras palabras, los reactivos y las etapas del presente procedimiento de tinción Gram pueden utilizarse no sólo para visualizar e identificar células bacterianas presentes en una muestra sino que adicionalmente puede utilizarse para teñir, visualizar e identificar células de mamíferos presentes en una muestra. Puede ajustarse el ph de la disolución que combina un decolorante y un tinte complementario para compensar las variaciones de ph causadas por la formulación particular de la disolución. Es decir, dependiendo de los constituyentes que forman la disolución que combina un decolorante y un tinte complementario, puede que sea necesario ajustar el ph hacia arriba (añadiendo base) o hacia abajo (añadiendo ácido) para obtener el ph óptimo, esto es, aproximadamente ph 4,. Puede disminuirse el ph de la disolución (acidificación) mediante la adición de ácidos como ácido acético glacial o ácido hidroclórico. El ph de la disolución puede elevarse (hacerlo más básico) mediante la adición de bases como hidróxido sódico. Otro procedimiento para ajustar el ph de la disolución es mediante tampones. El tampón en la disolución que combina un decolorante y un tinte complementario puede ser cualquier número de reactivos tamponadores diferentes pero generalmente es acetato, TRIS u otros tampones adecuados conocidos de los descritos en la técnica. Hay muchos tampones que pueden ser adecuados, ya que son solubles en la disolución y poseen una capacidad tamponadora similar en el intervalo preferido de ph. El tampón preferido es un tampón de acetato cuya concentración varía entre 0,01M y 1M. La concentración preferida del tampón de acetato es 0,1M. El tamponamiento de la disolución que combina un decolorante y un tinte complementario es crucial para la tinción de las células de mamíferos presentes en las muestras que se deben analizar.

6 1 2 La etapa de decoloración y tinción complementaria simultáneas se lleva a cabo enjuagando el mordiente del portamuestras utilizando la disolución que combina un decolorante y un tinte complementario y aplicando después la disolución que combina un decolorante y un tinte complementario a las bacterias fijadas al portamuestras utilizando cualquier medio adecuado como una botella comprimible un cuentagotas o cualquier otro medio adecuado para la aplicación de la disolución. Adicionalmente, el uso de la etapa de decoloración y tinción complementaria simultáneas elimina una etapa de lavado con agua del procedimiento convencional de tinción Gram. La etapa de decoloración y tinción complementaria simultáneas incluye también un periodo de aplicación en el cual se permite a la disolución que combina un decolorante y un tinte complementario incubar o contactar con las bacterias durante un periodo de tiempo, típicamente -0 segundos. Después del periodo de aplicación, las bacterias fijadas al portamuestras se lavan abundantemente con agua para eliminar cualquier exceso de la disolución decolorante y de tinción complementaria. En este punto, las bacterias fijadas al portamuestras están en condiciones adecuadas para el análisis microscópico para determinar si las bacterias son Gram positivas, Gram negativas o una combinación de ambas. La presente invención también incluye un conjunto que contiene los reactivos para la tinción Gram incluyendo un primer medio reactivo para la tinción de bacterias Gram positivas; un segundo medio reactivo para la fijación del tinte a las bacterias Gram positivas; y un tercer medio reactivo para la decoloración y tinción complementaria simultáneas de bacterias Gram negativas, tiendo este tercer reactivo un ph en el intervalo entre 1 y 6. El tercer medio reactivo comprende preferiblemente una disolución que consiste en al menos un tinte complementario (preferiblemente uno o más de safranina, fucsina básica y tinte rojo natural) y un disolvente decolorante. El ph de la disolución se ajusta típicamente de manera que el ph de la disolución está en el intervalo de 1 a 6. La presente invención también incluye un reactivo de tinción Gram para la decoloración y tinción complementaria simultáneas de las bacterias fijadas al portamuestras. El reactivo comprende un disolvente decolorante y al menos un tinte complementario y tiene ph ajustado de manera que el ph del reactivo varía en el rango de 1 a 6. Ejemplo Materiales y Procedimientos Se fijan muestras de microorganismos que incluyen muestras bacterianas y levaduras (véase Tabla 1) sobre portamuestras de vidrio para microscopio y se tratan por el procedimiento convencional de tinción Gram con cuatro reactivos compuesto por una disolución acuosa de tinción principal que contiene 0,38 % de violeta cristal, 0,44 % de fenol; una disolución de mordiente que contiene 0,33 % de cristales de yodo, 0,66% de yoduro potásico; una disolución decolorante que contiene acetona e isopropanol en relación 1:3 respectivamente; y una disolución de tinción complementaria que contiene 0,4 % de safranina y % de etanol. Utilizando el procedimiento convencional de tinción Gram se somete a los microorganismos a las siguientes etapas: (1) se tratan con la disolución principal de tinción durante - segundos; (2) se enjuagan con agua; (3) se tratan con la disolución de mordiente durante - segundos; (4) se enjuagan con agua; () se tratan con la disolución decolorante durante - segundos; (6) se enjuagan con agua; (7) se tratan con la disolución de tinción complementaria durante - segundos y; (8) se enjuagan con agua. Después de estas etapas, los microorganismos se analizan microscópicamente y los resultados se muestran en la Tabla 1. Por el procedimiento de tres reactivos de la presente invención, se fijan muestras idénticas de microorganismos, incluidos muestras bacterianas y levaduras, sobre portamuestras de vidrio para microscopio, y se tratan con una disolución principal de tinción que contiene 38 % de violeta cristal, 0,44 % de fenol; una disolución de mordiente que contiene % de yoduro de polivinilpirrolidona, 1,9 % de yoduro potásico; y una disolución combinada de un decolorante y un tinte complementario. que contiene 0, % de safranina, 90 % de etanol, y % de agua en tampón de acetato 0,1M, ph 4,. Utilizando el procedimiento de tinción Gram con tres reactivos de la presente invención, las muestras de microorganismosse someten a las siguientes etapas: (1) se tratan con la disolución principal de tinción durante - segundos; (2) se enjuagan con agua; (3) se tratan con la disolución de mordiente durante - segundos; (4) se enjuagan con la disolución combinada de un decolorante y un tinte complementario; () se tratan con la disolución 6

7 combinada de un decolorante y un tinte complementario durante -0 segundos; y (6) se enjuagan con agua. Después de estas etapas, las muestras de microorganismos se analizan microscópicamente y los resultados se muestran en la Tabla 1. Resultados 1 Con referencia a las Figuras 1 y 2, se llevan a cabo pruebas para comparar el procedimiento de tinción Gram con tres reactivos de la presente invención con el procedimiento convencional de tinción Gram con cuatro reactivos. Los solicitantes han encontrado que para ciertos Bacillus sp. el procedimiento y reactivos de los que se trata en la presente invención dan unos resultados de tinción Gram consistentes y fácilmente interpretables, mientras que el procedimiento de tinción Gram y reactivos convencionales dan unos resultados no concluyentes. Con referencia a la Figura 1 las bacterias teñidas por el procedimiento convencional de tinción Gram de cuatro etapas aparecen de color amarillento, lo cual es inconsistente con el color morado que indica organismos Gram positivos y el color rosáceo que indica organismos Gram negativos. Sin embargo, con referencia a la Figura 2, las bacterias teñidas por el procedimiento de tres etapas de que trata esta invención son de color morado, indicando claramente que el organismo es Gram positivo. Ejemplo 2 Materiales y Procedimientos Por el procedimiento de tres reactivos de la presente invención, se fijan muestras clínicas sobre portamuestras de vidrio para microscopio y se tratan con una disolución principal de tinción que contiene 0,38% de violeta cristal, 0,44 % de fenol; una disolución de mordiente que contiene % de cristales de yoduro de polivinilpirrolidona, 1,9 % de yoduro potásico; y una disolución combinada de un decolorante y un tinte complementario. que contiene 0,% de safranina, 90 % de etanol, y % de agua en tampón de acetato 0,1M, ph 4,. Utilizando el procedimiento de tinción Gram con tres reactivos de la presente invención, las muestras de microorganismos se someten a las siguientes etapas: (1) se tratan con la disolución principal de tinción durante - segundos; (2) se enjuagan con agua; (3) se tratan con la disolución de mordiente durante - segundos; (4) se enjuagan con la disolución combinada de un decolorante y un tinte complementario; () se tratan con la disolución combinada de un decolorante y un tinte complementario durante - segundos; y (6) se enjuagan con agua. Después de estas etapas, las muestras de microorganismos se analizan microscópicamente y los resultados se muestran en la Tabla 2. Resultados Se llevan a cabo pruebas sobre muestras clínicas utilizando el procedimiento de tres reactivos de la presente invención. Los solicitantes han encontrado que el procedimiento de tres reactivos de la presente invención da unos resultados de tinción Gram consistentes y fácilmente interpretables para una variedad de muestras clínicas aisladas. El procedimiento de tres reactivos proporciona resultados precisos, consistentes y fácilmente interpretables para una variedad de muestras clínicas típicas aisladas. Estos resultados ilustran los beneficios obtenidos ajustando el ph de la disolución que combina un decolorante y un tinte complementario. Adicionalmente, estos resultados demuestran que es crítico el tamponar y acidificar el ph de la disolución que combina un decolorante y un tinte complementario para teñir las células de mamíferos presentes en las muestras. Si no se ajusta el ph ni se tampona la disolución, las células de mamíferos no son suficientemente diferenciables y, por tanto, no pueden utilizarse para ayudar en la identificación o diagnósticos. Los leucocitos polimorfonucleares (PMN s), células mononucleares, células epiteliales y células de similar tipo se distinguen fácilmente utilizando el método de tinción Gram de la presente invención y ayudan en la interpretación de muestras clínicas. Ejemplo 3 Materiales y Procedimientos Se fijan muestras de microorganismos que incluyen muestras bacterianas y levaduras (véase Tabla 3) sobre portamuestras de vidrio para microscopio y se tratan con el procedimiento de Di Ianni de tinción Gram con tres reactivos compuesto por una disolución principal de tinción que contiene 1,2 gramos de 7

8 1 2 3 tinte violeta cristal, 2 gramos de anilina, y % (V/V) de isopropanol en un volumen final de 0ml; una disolución que combina un mordiente y un decolorante que contiene un 0,66 % de yoduro potásico, 0,33 % de cristales de yodo, y 9 % de etanol; y una disolución de tinción complementaria que contienen un 1 % de safranina en una disolución acuosa. Utilizando el procedimiento de tinción Gram con tres reactivos de la patente Di Ianni , las muestras de microorganismos se someten a las siguientes etapas: (1) se tratan con la disolución principal de tinción durante un minuto; (2) se enjuagan con agua; (3) se tratan con la disolución que combina un mordiente y un decolorante durante un minuto; (4) se enjuagan con la disolución combinada de un decolorante y un tinte complementario; () se tratan con la disolución de tinción complementaria durante - segundos; y (6) se enjuagan con agua. Después de estas etapas, las muestras de microorganismos se analizan microscópicamente y los resultados se muestran en la Tabla 3. Por el procedimiento de tres reactivos de la presente invención, se fijan muestras bacterianas idénticas sobre portamuestras de vidrio para microscopio y se tratan con una disolución principal de tinción que contiene 0,38% de violeta cristal, 0,44 % de fenol; una disolución de mordiente que contiene % de cristales de yoduro de polivinilpirrolidona, 1,9 % de yoduro potásico; y una disolución combinada de un decolorante y un tinte complementario. que contiene 0, % de safranina, 90 % de etanol, y % de agua en tampón de acetato 0,1M, ph 4, como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1. Resultados Se llevan a cabo pruebas para comparar el procedimiento de tinción Gram con tres reactivos de la presente invención con el procedimiento de tinción Gram con tres reactivos de la patente Di Ianni descrita anteriormente. Los solicitantes han encontrado que tanto para los organismos del grupo Gram positivo como para los del grupo Gram negativo, el reactivo de combinación de decoloración y tinción complementaria y procedimiento de la presente invención da unos resultados de tinción Gram consistentes y fácilmente interpretables, mientras que el procedimiento de tinción Gram con tres reactivos de la patente Di Ianni da unos resultados no concluyentes y a veces incorrectos. Por ejemplo, para Staphylococcus aureus ATCC 48, Staphylococcus xylosis ATCC 29971, Bacillus cereus ATCC E-1479, Bacillus megaterium ATCC 1481, y Bacillus subtilis ATCC 11774, el reactivo y el procedimiento de Di Ianni dan determinaciones Gram tanto incorrectas como no concluyentes, mientras que el procedimiento de tres reactivos de la presente invención da resultados consistentemente precisos y fácilmente interpretables, para los mismos organismos. Ejemplo 4 Materiales y Procedimientos 4 0 Se fijan muestras de microorganismos que incluyen muestras clínicas que contienen muestras bacterianas y levaduras (véase Tabla 4) sobre portamuestras de vidrio para microscopio y se tratan por el procedimiento convencional de tinción Gram con cuatro reactivos compuesto por una disolución acuosa de tinción principal que contiene 0,% de violeta cristal; una disolución de mordiente que contiene 13 % de un complejo de yoduro de polivinilpirrolidona; una disolución decolorante que contiene acetona e isopropanol en relación 1:3 respectivamente; y una disolución de tinción complementaria que contiene 0,2% de safranina y % de etanol. Utilizando un dispositivo automático de tinción (EMDS Midas II, EM Science, Gibbstown, NJ) para aplicar el procedimiento convencional de tinción Gram, los microorganismos fueron sometidos a las siguientes etapas: (1) se tratan con la disolución principal de tinción durante segundos; (2) se enjuagan con agua; (3) se tratan con la disolución de mordiente durante segundos; (4) se enjuagan con la disolución combinada de un decolorante y un tinte complementario; () se tratan con la disolución decolorante durante 7 segundos; (6) se enjuagan con agua; (7) se tratan con la disolución de tinción complementaria durante segundos y; (8) se enjuagan con agua. Después de estas etapas, los microorganismos se analizan microscópicamente y los resultados se muestran en la Tabla 4. Para el procedimiento de tres reactivos de la presente invención se fijan muestras idénticas de microorganismos que incluyen muestras clínicas que contienen especímenes bacterianos y levaduras sobre portamuestras de vidrio para microscopio y se tratan con una disolución principal de tinción que contiene 0,38 % de violeta cristal, 0,44 % de fenol; una disolución de mordiente que contiene % de yodopolivinilpirrolidona, 1,9 % de yoduro de potasio; y una disolución que combina un decolorante y un tinte complementario que contiene 0, % de safranina, 0,% de fucsina básica, 90 % de etanol, % de agua 8

9 y se acidifica a ph 4,. Utilizando el procedimiento de tinción Gram de tres reactivos de la presente invención, las muestras de microorganismos fueron sometidas a las siguientes etapas: (1) se tratan con la disolución principal de tinción durante - segundos; (2) se enjuagan con agua; (3) se tratan con la disolución de mordiente durante - segundos; (4) se enjuagan con la disolución combinada de un decolorante y un tinte complementario; () se tratan con la disolución combinada de un decolorante y un tinte complementario durante -0 segundos; y (6) se enjuagan con agua. Después de estas etapas, los microorganismos se analizan microscópicamente y los resultados se muestran en la Tabla 4. Resultados Con referencia a la Tabla 4, se llevan a cabo pruebas para comparar el procedimiento de tinción Gram con tres reactivos de la presente invención con el procedimiento convencional de tinción Gram con cuatro reactivos. Los solicitantes han encontrado que para muestras de bacterias y levaduras el procedimiento de 3 etapas de la presente invención es comparable con el procedimiento estándar de 4 etapas. Sin embargo, los datos muestran que en algunos casos, para células no bacterianas (células de mamíferos, células del sistema inmunológico) el procedimiento de 3 reactivos de la presente invención da mejores resultados que el procedimiento estándar de 4 etapas en la tinción y visualización de células no bacterianas. Ejemplo Materiales y Procedimientos Se fijan muestras clínicas que contienen microorganismos (véase Tabla ) sobre portamuestras de vidrio para microscopio y se tratan por el procedimiento convencional de tinción Gram de cuatro reactivos que comprende una disolución principal acuosa de tinción que contiene 0,38% de violeta cristal, 0,44 % de fenol; una disolución de mordiente que contiene 0,33 % de cristales de yoduro, 0,66 % de yoduro potásico; una disolución decolorante que contiene acetona y alcohol etílico en proporción 1:1, respectivamente; y una disolución de tinción complementaria que contiene 0,4 % de safranina y % de etanol. Utilizando el procedimiento convencional de tinción Gram, los microorganismos fueron sometidos a las siguientes etapas: (1) se tratan con la disolución principal de tinción durante segundos; (2) se enjuagan con agua; (3) se tratan con la disolución de mordiente durante segundos; (4) se enjuagan con agua; () se tratan con la disolución decolorante hasta que no salga más color del portamuestras; (6) se enjuagan con agua; (7) se tratan con la disolución de tinción complementaria durante segundos y; (8) se enjuagan con agua. Después de estas etapas, los microorganismos se analizan microscópicamente y los resultados se muestran en la Tabla 4. Para el procedimiento de tres reactivos de la presente invención, se fijan muestras clínicas idénticas que contienen microorganismos a portamuestras de vidrio para microscopio y se tratan con una disolución principal de tinción que contiene 0,38 % de violeta cristal, 0,44 % de fenol, una disolución de mordiente que contiene 0,33 % de cristales de yodo, 0,66% de yoduro potásico; y una disolución que combina un decolorante y un tinte complementario que contiene 0,38 % de safranina, 0,28 % de fucsina básica, 90 % de etanol, % de fenol, % de agua, y se acidifica a ph 4,. Utilizando el procedimiento de tinción Gram de tres reactivos, las muestras de microorganismos fueron sometidas a las siguientes etapas: (1) se tratan con la disolución principal de tinción durante - segundos; (2) se enjuagan con agua; (3) se tratan con la disolución de mordiente durante - segundos; (4) se enjuagan con la disolución combinada de un decolorante y un tinte complementario; () se tratan con la disolución combinada de un decolorante y un tinte complementario durante -0 segundos; y (6) se enjuagan con agua. Después de estas etapas, los microorganismos se analizan microscópicamente y los resultados se muestran en la Tabla. Resultados Con referencia a la Tabla, se llevan a cabo pruebas para comparar el procedimiento de tinción Gram con tres reactivos de la presente invención con el procedimiento convencional de tinción Gram con cuatro reactivos. Los solicitantes han encontrado que el procedimiento de 3 etapas que utiliza la disolución combinada de un decolorante y un tinte complementario es superior al procedimiento estándar de tinción Gram de 4 etapas a la hora de discernir tanto células microbiológicas como células de mamíferos de un espécimen humano real. Los resultados representados en la Tabla muestran que el procedimiento de 3 etapas y la disolución combinada de un decolorante y un tinte complementario de la presente invención no solo dan mejores resultados que el procedimiento estándar en la identificación y clasificación de células bacterianas, el procedimiento de 3 etapas y la disolución combinada de un decolorante y un tinte complementario de la presente invención dan mucho mejores resultados en la tinción e identificación de células 9

10 de mamíferos como leucocitos polimorfonucleares. Se ha descrito la invención de manera ilustrativa, y debe entenderse que la terminología que se ha utilizado tiene intención de ser más descriptiva que limitante. Obviamente, son posibles muchas modificaciones y variaciones a la luz de las enseñanzas anteriores. Debe entenderse, por lo tanto, que dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la invención puede practicarse de una manera diferente a la descrita específicamente. TABLA 1 1 Microorganismo Procedimiento Procedimiento de tinción convencional de tinción Gram de tres reactivos de Gram de cuatro reactivos la presente invención Corynebacterium xerosis ATCC 9016 g+ g+ 2 Pseudomonas aeruginosa ATCC 14 g- g- Candida albicans ATCC 231 g+ g+ Candida tropicalis ATCC 117 g+ g+ Staphylococcus aureus ATCC 2923 g+ g+ Staphylococcus aureus CDC 48 g+ g+ Staphylococcus xylosis ATCC g+ g+ Micrococcus sp. IMC 7223 g+ g+ 3 Klebsiella pneumoniae BMC 3292 g- g- Klebsiella pneumoniae ATCC g- g- Klebsiella oxytoca ATCC 8724-A g- g- Escherichia coli CDC g- g- 4 Bacillus cereus ATCC 1479 g+ g+ Bacillus megaterium ATCC 1481 g+ g+ 0 Bacillus subtilis ATCC 6633 g+ (morado, amarronado) g+ (todo morado) Bacillus subtilis ATCC g+, g- (amarronado) g+

11 TABLA 2 Espécimen Resultado: procedimiento de 3 reactivos 1 2 Sangre A Sangre B Sangre C Sangre D Herida A Herida B Esputo A Vagina A Garganta A g+, cocos g-, rod; PMN s g-, rod g+, cocos; PMN s g+, cocos; g-, diplococos (bacilo bipolar) g+, cocos g+, cocos; g- rods; PMN s células epiteliales g+, cocobacilos, células escamosas TABLA 3 3 Microorganismo Procedimiento de Di Procedimiento de tinción Ianni 061 de tinción Gram de tres reactivos de Gram de tres etapas la presente invención Staphylococcus aureus ATCC 48 g- g+ Staphylococcus xylosis ATCC rosa-marrón g+ Bacillus cereus ATCC E-1479 g+, g- g+ Bacillus megaterium ATCC 1481 g+, g- g+ 4 Klebsiella pneumoniae BMC 3292 g- g- Escherichia coli CDC g- g- 0 Bacillus subtilis ATCC 6633 g+ g+ Bacillus subtilis ATCC g- g+ 11

12 Tinción Gram bacteriana / Morfología TABLA 4 Características de tinción no bacterianas Tipo de muestra 4etapas 3etapas 4etapas 3etapas Comentarios ocultivo estándar estándar N. Comparable Comparable Comparable Comparable Fondo más oscuro gonorrohoeae en 3 etapas H. influenzae Comparable Comparable Comparable Comparable 3etapasmás intenso S. aureus Comparable Comparable Comparable Comparable Equivalente 1 Vagina 1 S. epidermidis S. epidermidis Comparable Comparable Equivalente Vagina 2 Bacilo S. Bacilo S. Comparable Comparable Equivalente epidermidis epidermidis Esputo 3 S. epidermidis S. epidermidis Comparable Comparable 3etapasmás mezclado mezclado intenso Esputo 2 PMN, PMN, Comparable Comparable Equivalente levadura Coco levadura Coco 2 Sangre 1 Bacilo G+ Bacilo G+ Comparable Comparable Equivalente Sangre 2 Bacilo G- Bacilo G- Comparable Comparable Equivalente Tinción Gram bacteriana / Morfología TABLA Características de tinción no bacterianas Tipo de muestra 4etapas 3etapas 4etapas 3etapas Comentarios ocultivo estándar estándar Leucocitos Difícil ver bacilos Se destacan Rosa apenas Se destacan 3 etapas mejor para fecales Gram negativos las bacterias visible PMN s PMN s y bacterias GPB O.K. mancha clara Leucocitos No se ven Se destacan PMN s rosa PMN s rosa Se destacan PMN s fecales bacterias los bacilos tenue oscuro en 3 etapas, faltan Gram negativos bacilos Gram negativos en estándar Orina Coco Gram Bien Coco PMN s PMN s Bacilos Gram positivos O.K. Gram positivos tenue bien negativos potenciados Bacilos Gram y bacilos en 3 etapas y negativos tenue Gram negativos PMN s bien CSF Coco Gram Coco Gram PMN s PMN s No hay positivos positivos bien bien diferencias CSF Coco Gram Coco Gram PMN PMN s Se tiñen mejor las positivos positivos tenue excelente células (PMN s) en 3 divididos en divididos en etapas. Identificación grandes trozos grandes trozos más fácil Hueso Coco Gram Coco Gram PMN PMN s Más fácil ver células positivos positivos tenue bien y bacterias en 3 escasos escasos etapas, especialmente porque son escasas 12

13 REIVINDICACIONES Un procedimiento de tinción Gram de una muestra que contiene bacterias, dicho procedimiento comprende: (a) tinción de las bacterias Gram positivas de la muestra; (b) fijación del tinte a las bacterias Gram positivas; y (c) decoloración y tinción complementaria simultáneas de bacterias Gram negativas en la muestra en una disolución que tiene un ph en el intervalo de 1 a Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha disolución de la etapa (c) comprende un disolvente decolorante y al menos un tinte complementario, dicha disolución tiene el ph ajustado, de manera que el ph de la disolución está en el intervalo mencionado. 3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicha disolución incluye un mordiente. 4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en el que dicho tinte complementario comprende uno o más de entre safranina, fucsina básica, y tinte rojo neutro.. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en el que dicho tinte complementario comprende una mezcla de safranina y un tinte complementario adicional seleccionado entre fucsina básica, o tinte rojo neutro. 6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha disolución de la etapa (c) comprende un disolvente decolorante y un tinte complementario, dicho tinte complementario comprende una mezcla de al menos un tinte complementario y un tinte complementario adicional, seleccionándose el tinte complementario y el tinte complementario adicional entre safranina, fucsina básica, y tinte rojo neutro. 7. Un equipo para tinción Gram que contiene reactivos que comprende: un primer medio reactivo para tinción de bacterias Gram positivas; un segundo medio reactivo para fijar el tinte a las bacterias Gram positivas; y un tercer medio reactivo para la decoloración y tinción complementaria simultáneas de bacterias Gram negativas, dicho tercer reactivo tiene un ph en el intervalo de 1 a Un equipo de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho tercer reactivo comprende una disolución que consiste en al menos un tinte complementario y un disolvente decolorante, la disolución tiene el ph ajustado, de manera que el ph de la disolución está en el intervalo mencionado. 9. Un equipo de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicho tinte complementario comprende uno o más de entre safranina, fucsina básica y tinte rojo neutro.. Un reactivo de tinción Gram para la decoloración y tinción complementario simultáneas de bacterias fijadas a un portamuestras, dicho reactivo comprende un disolvente decolorante y al menos un tinte complementario, el reactivo tiene el ph ajustado de manera que el ph del reactivo está en el intervalo de 1a6. 0 NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté onoincluída en la mencionada reserva. 13

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