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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : A61K 3/74 A61K 9/00 A61P 1/02 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 knúmero de solicitud europea: k Fecha de presentación: k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Composiciones farmacéuticas que contienen Lactobacillus brevis y Lactobacillus salivarius para el tratamiento de infecciones vaginales. k 73 Titular/es: Renata Maria Anna Cavaliere Vesely Via S. Orsola 11 I-123 Milano, IT Claudio de Simone k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Cavaliere Vesely, Renata Maria Anna y Simone, Claudio de k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Elzaburu Márquez, Alberto ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 ES T3 DESCRIPCION Composiciones farmacéuticas que contienen Lactobacillus brevis y Lactobacillus salivarius para el tratamiento de infecciones vaginales La presente invención se refiere al uso de especies particulares de lactobacilos para preparar composiciones farmacéuticas para el tratamiento de infecciones vaginales, así como a las composiciones farmacéuticas así preparadas. La vagina normal y el cuello del útero normal albergan una variedad de bacterias semejantes a las del sistema gastrointestinal. Estas bacterias están implicadas frecuentemente en las infecciones no gonocócicas del sistema genital femenino (tales como, por ejemplo: abscesos vulvovaginales y abscesos de la glándula de Bartholin(o vestibular mayor), endometritis, salpingitis, abscesos ováricos y peritonitis pélvica). En el curso de las enfermedades pélvicas inflamatorias de naturaleza no venérea, a menudo se encuentra una mezcla de bacterias anaerobias y aerobias; tal abanico de bacterias puede ser responsable de infecciones después de operaciones ginecológicas, partos, abortos, y se ha correlacionado con el uso de dispositivos intrauterinos para impedir la implantación (DIU). La vaginosis bacteriana es la consecuencia de una interacción bacteriana responsable de la sustitución, en la región de la vagina, de un gran número de bacterias anaerobias que incluyen Bacteroides, Peptostreptococcus, Peptococcus, Mobiluncus G. vaginalis, por lactobacilos. Este síndrome se caracteriza por una secreción maloliente aunque no particularmente irritante. Sólo hay un ligero picor y la dispareunia es excepcionalmente poco común. Las vaginosis bacterianas se diagnostican comúnmente entre mujeres que tienen trastornos vaginales, aunque el 0 % de las mujeres que responden a los criterios de diagnóstico de las vaginosis bacterianas son asintomáticas. Las vaginosis bacterianas se asocian con la actividad sexual y aumentan según aumenta el número de parejas sexuales; sin embargo, esta afección no se considera como una enfermedad de transmisión exclusivamente sexual. Aunque la vaginosis bacteriana es molesta de forma ligera, puede predisponer al desarrollo de infecciones más serias del sistema genital, en particular durante el embarazo. Se da un diagnóstico de vaginosis bacteriana cuando se encuentran tres de los cuatro síntomas que siguen: (1) una secreción vaginal no inflamatoria homogénea, que se adhiere a las paredes de la vagina; (2) un fluido vaginal que tiene un ph mayor que 4,; 4 0 (3) células indicadoras; y (4) un olor nauseabundo de la secreción vaginal antes o después de la adición de hidróxido potásico al % (Prueba de Whiff). La vaginitis, por el contrario, se caracteriza por una secreción vaginal anormal, irritación local y picor vulvar. Los anteriores son síntomas de una infección local debida a T. vaginalis, oacandida (todo lo anterior a Candida albicans). La vaginosis y la vaginitis sintomática se asocian a diabetes, insuficiencia paratiroidea, defensas alteradas del organismo hospedador, tratamiento corticosteroide, tratamiento antibiótico de amplio espectro, fármacos contraceptivos orales y gestación. El picor y la secreción son lo principales síntomas de la vaginitis debida a Candida. La dispareunia ocasionalmente ocurre. Se puede apreciar eritema de la vulva y aftas vulvovaginales. Para un diagnóstico de la vaginitis debida a Candida se requiere la presencia de síntomas locales ya que las mujeres pueden tener usualmentecandida en la vagina sin mostrar ningún trastorno. Los resultados de estudios recientes han fomentado la aceptación del importante papel llevado a cabo por los lactobacilos en el mantenimiento de un equilibrio bacteriano normal dentro de ecosistemas dinámicos tales como la vagina, y en la prevención de las infecciones genitales causadas por organismos patógenos. Se conoce bien que muchos lactobacilos colonizan la vagina de mujeres adultas sanas. Éstos de propagan usando como fuente de energía el glucógeno secretado a partir de la membrana mucosa vaginal y compiten por éste con los agentes patógenos, de manera que mantienen el lumen vaginal defendido del ataque de otras bacterias. Las sulfonamidas, antibióticos y fármacos desinfectantes, principalmente, se han usado para el tratamiento de las enfermedades anteriormente mencionadas (vaginitis no específica, va- 2

3 ES T3 ginosis y picor vulvar, por ejemplo). En particular, en los años más recientes, con el desarrollo de muchos antibióticos, se han administrado a menudo a las pacientes preparaciones antibióticas. Los lactobacilos presentes en la vagina pueden sucumbir por la administraciónde estos antibióticos. Desafortunadamente, las bacterias patógenas (Staphylococcus, por ejemplo) pueden adquirir una resistencia a los antibióticos y hacer difícil de este modo el tratamiento de estas enfermedades mediante administración de antibióticos. En la patente US-A se ha propuesto el uso de lactobacilos en ginecología para tratamiento de infecciones vaginales. 1 2 Este documento se refiere a las siguientes bacterias: Lactobacillus casei, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus casei subs. pseudoplantarum y Lactobacillus crispatus, y sugiere concentraciones de bacterias de 3 a UFC/g, preferiblemente de alrededor de 6 UFC/g. Sin embargo, todas las composiciones ejemplificadas en este documento contienen Lactobacillus casei y/o Lactobacillus fermentum como componentes esenciales, a unas concentraciones de 1x 6 UFC/g. Por tanto, este documento enseña prácticamente que Lactobacillus casei y/o Lactobacillus fermentum son componentes esenciales para preparar composiciones farmacéuticas para tratamiento de infecciones vaginales y que estas composiciones son eficientes a unas concentraciones de bacterias de 1x 6 UFC/g (la abreviatura UFC significa unidad formadora de colonia ). Las composiciones farmacéuticas de la técnica conocida, hechas en forma de óvulos vaginales o comprimidos para uso vaginal, que contienen lactobacilos, no son suficientemente eficientes para restablecer la colonización de la vagina. Hay que indicar además que una importante proporción de las células bacterianas mueren como resultado del impacto físico dado en el momento de la preparación de los óvulos vaginales y su número se reduce más cuando difunden en el lumen de la vagina y debe empezar su propagación. Por tanto, hay una necesidad de disponer de especies apropiadas de lactobacilos, o mezclas de los mismos, y de composiciones farmacéuticas que los contienen, las cuales están libres de los inconvenientes de las composiciones de la técnica conocida. En particular, hay una necesidad de composiciones farmacéuticas para uso vaginal que tienen tan buenas cualidades que la administración de las mismas a una paciente es realmente beneficiosa Además, las realizaciones de la composición farmacéutica deben ser capaces de mantener constante el número de lactobacilos a ser propagados, y asegurar una acción de dichos lactobacilos constante y continua en el tiempo, durante la difusión de los mismos en el lumen vaginal. Los solicitantes han encontrado que se pueden obtener composiciones farmacéuticas a base de lactobacilos altamente eficaces para tratamiento de infecciones vaginales, proporcionados los siguientes aspectos se pueden encontrar al más alto grado posible: (a) la cepa de lactobacilos seleccionada debe tener una afinidad alta por el epitelio vaginal, es decir, una capacidad alta de adherirse a las células epiteliales de la vagina, en que esta propiedad permite la interacción de las bacterias con la mucosa de la vagina tanto bajo condiciones fisiológicas como patológicas (llevando a cabo de este modo una acción competitiva con los microorganismos patógenos en los sitios receptores epiteliales) y el restablecimiento de la microflora y de las condiciones óptimas de ph; (b) al menos una cepa de lactobacilos seleccionada debe tener una capacidad alta para producir peróxido de hidrógeno que lleve a cabo una acción inhibidora dirigida a los microorganismos patógenos; y (c) al menos una cepa de lactobacilos seleccionada debe caracterizarse por una capacidad alta para interferir de manera competitiva con la adhesión de la Candida albicans a células HeLa. Por tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar composiciones farmacéuticas a base de lactobacilos que reúnen los aspectos anteriores al más alto grado posible, y por tanto, adaptadas a ser empleadas eficientemente para el tratamiento de infecciones vaginales tales como la vaginitis y vaginosis, por ejemplo. En esta relación los solicitantes han encontrado que los lactobacilos de las especies Lactobacillus brevis y Lactobacillus salivarius subs. salicinius reúnen el conjunto de los tres aspectos anteriores en un grado mucho más alto que otras especies de lactobacilo. 3

4 ES T3 1 2 Otro objeto de la presente invención es proporcionar composiciones farmacéuticas adaptadas a la administración vaginal que comprenden lactobacilos fabricados en forma de: composiciones líquidas, composiciones en forma de crema o ungüento y composiciones sólidas, en particular en forma de óvulos vaginales y comprimidos. Un objeto más de la invención es proporcionar composiciones farmacéuticas sólidas capaces de liberar lactobacilos vehiculizados en las mismas de manera diferenciada en el tiempo. Los objetos anteriores y más, que llegarán a ser aparentes en el progreso de la siguiente descripción detallada, se consiguen mediante la presente invención, el objeto de la cual es, en su primer aspecto, proporcionar el uso de una asociación de lactobacilos de las especies Lactobacillus brevis y Lactobacillus salivarius subs. salicinius, paralapreparación de una composición farmacéutica a emplear mediante administración vaginal para el tratamiento de infecciones vaginales tales como la vaginitis y vaginosis, por ejemplo. En otro aspecto, es un objeto de la presente invención proporcionar dicha composición farmacéutica. En las realizaciones particulares de la presente invención se pueden usar bacterias de las especies Lactobacillus brevis y Lactobacillus salivarius subs. salicinius, en combinación con una o más especies de lactobacilos seleccionadas de Lactobacillus salivarius subs. salivarius, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus catenaforme, Lactobacillus minutus y Lactobacillus gasseri. Preferiblemente, la asociación de bacterias usada en la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención comprende o consiste en Lactobacillus brevis, Lactobacillus salivarius subs. salicinius y Lactobacillus gasseri. Son ejemplos particulares de lactobacilos a usar: - Lactobacillus brevis ATCC 06 y ATCC Lactobacillus salivarius subs. salicinius ATCC Lactobacillus gasseri ATCC Se entiende por ATCC: American Type Culture Collection, 121 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 82, Estados Unidos. Preferiblemente, en la asociación de bacterias empleada en concordancia con la presente invención la concentración de bacterias es 7 a 13 UFC/g, más preferiblemente 8 a 12 UFC/g, más preferiblemente más que 9 a 12 UFC/g. Preferiblemente, en dicha asociación de bacterias, cada especie está presente a una concentración de 8 a 12 UFC/g. Los cultivos bacterianos están preferiblemente en forma liofilizada. 4 0 Para el uso práctico, las composiciones farmacéuticas de la invención se preparan en forma líquida (soluciones para lavados), en forma de cremas o ungüentos, o en forma sólida, es decir, como óvulos vaginales o comprimidos vaginales, sobres y similares. Las composiciones farmacéuticas fabricadas en forma de comprimidos pueden ser de una sola capa, o dos o más capas que tienen tiempos de liberación diferenciados. En particular, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden preparar en forma de comprimidos que comprenden al menos dos capas, conteniendo ambas especies de lactobacilos, unidos con los excipientes y aditivos usuales, de manera que la velocidad de liberación de las bacterias de la capa más externa es mayor que la velocidad de liberación de las bacterias de la capa más interna. A modo de ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden preparar en forma de comprimidos fabricados en dos capas. Dichas dos capas se pueden fabricar de manera que las bacterias de la capa más externa se liberan en un periodo de tiempo de -2 minutos, alrededor de 1- minutos por ejemplo, mientras que las bacterias de la capa más interna se liberan subsiguientemente en un periodo de tiempo de 2-0 minutos, alrededor de - minutos por ejemplo. En una realización preferida de la presente invención, las composiciones farmacéuticas también con- 4

5 ES T3 1 2 tienen un agente tampón capaz de mantener un ph intravaginal estabilizado en un intervalo incluido entre 3 y,, durante algunas horas después de la administración. El agente tampón es un sistema de tampón que consiste en un ácido débil seleccionado de cualquier ácido débil orgánico o inorgánico farmacéuticamente aceptable, tal como el ácido bórico, ácido láctico, ácido ascórbico, ácido cítrico, o ácido acético por ejemplo, en combinación con la sal sódica respectiva u otra sal farmacéuticamente aceptable de la base conjugada del ácido débil usado. Preferiblemente, el ph se tampona en un intervalo de 4,2 a 4, y preferiblemente, como agente tampón se usa un sistema de tampón hecho de: ácido láctico y lactato sódico o ácido ascórbico y ascorbato sódico. Más componentes o ingredientes que se pueden incluir posiblemente en las preparaciones de la presente invención son los aromas, mentol, esencia de eucalipto, metilsalicilato o salicilatos como agentes refrescantes tópicos, hidrocortisona u otros esteroides antiinflamatorios (0,01 a 00 mg/g), fármacos antiflogísticos, agentes humidificadores y antimicrobianos (EDTA, monolaurato de dodecaetilen-glicol, etc.), estriol (0,001 a 1 mg/g) y/o otras sustancias hormonales o sustancias que llevan a cabo una actividad hormonal, almidón de maíz o almidón de patata, vitaminas, antioxidantes, enzimas (hialuronidasa), heparinoides, lidocaína y otros anestésicos tópicos, extractos de plantas (Belladona), zinc, calcio y bismuto. Para la preparación de formulaciones acuosas para lavados e irrigaciones se usan botellas pequeñas que se proporcionan con reservorios que contienen los microorganismos liofilizados a disolver antes del uso en un medio líquido apropiado, contenidos separadamente en las botellas pequeñas. Las composiciones de la invención están prácticamente libres de cualquier carácter tóxico y no dan lugar a ninguna absorción sistémica, de forma que también se permite la administración a pacientes gestantes, así como en caso de una alergia a fármacos antimicóticos y antibacterianos. De acuerdo con la experiencia clínica adquirida hasta ahora se considera como particularmente apropiado y eficiente un horario de tratamiento que comprende la administración de la composición de la invención en forma de comprimidos, cremas y óvulos vaginales a administrar antes de acostarse, seguido de un lavado a la mañana siguiente. Después de describir la presente invención de una manera general, se entenderá mejor la misma refiriéndola a algunos ejemplos específicos dados de aquí en adelante con fines sólo ilustrativos, los cuales no tienen la intención de un sentido limitante. Ejemplos 3 Ejemplo 1 Adhesión de los Lactobacilos a células HeLa 4 0 Mediante este ensayo se examinó la capacidad de diferentes cepas de Lactobacilli de the American Type Culture Collection (abreviadamente ATCC) de adherirse a las células HeLa, una línea celular originaria de un carcinoma humano de cuello de útero. Las células HeLa se mantuvieron en monocapa en frascos de cultivo de tejido en MEM (Medio esencial mínimo), con adición de % (volumen/volumen) de suero fetal bovino (abreviadamente FBS). La reacción de adhesión se llevó a cabo en una placa de cultivo para tejidos de múltiples pocillos, que contiene una lámina cobertora (24x24 mm) en cada pocillo. En cada pocillo se sembró 1 ml de suspensión de células HeLa a una concentración de 1,2X células/ml y se incubaron las placas durante 24 horas a 37 C en una atmósfera de CO 2 al %. Antes del ensayo de adhesión se pusieron todas las cepas bacterianas en un subcultivo de caldo MRS (Difco). Después de una incubación de 24 horas a 37 C bajo condiciones anaerobias (1 % de CO 2 ) se reforzaron las bacterias en un caldo nuevo y después se incubaron durante una noche bajo las mismas condiciones experimentales. Se obtuvo un ambiente anaerobio incubando las bacterias en una jarra que contiene bolsas específicas de AnaeroGen (Oxoid). Para los ensayos de adhesión se incubaron en MEM diferentes diluciones de la suspensión bacteriana en monocapas de células durante una hora a 37 C bajo condiciones microaerofílicas. Después de varios lavados en PBS para retirar los microorganismos que no se adhirieron, las células se dispusieron en 0,4 ml de solución May Grumwald por pocillo durante 4 minutos, se lavaron con solución Giemsa diluida en agua durante 1 minutos antes del examen con un microscopio óptico. Las concentraciones de procesamiento se seleccionaron basándose en el porcentaje de células que tienen bacterias adheridas y el número de bacterias/célula. La adhesión máxima se obtuvo a concentraciones de x 9 bacterias/ml. Los resultados obtenidos, indicados en la Tabla 1, muestran que los lactobacilos analizados fueron capaces de adherirse a las células HeLa, mostrando diferentes grados de adhesión a las células hospedadoras. Los grados de adhesión más altos se encontraron en las especies Lactobacillus brevis y Lactobacillus

6 ES T3 salivarius subs. salicinius. Lactobacillus casei, además de tener un grado de adhesión bajo, es invasivo, y por tanto, no se adapta para la preparación de la composición farmacéutica de la presente invención. TABLA 1 Adhesión de diferentes cepas de Lactobacillus acélulas HeLa Lactobacilos Adhesión bacteriana N de bacterias %decélulas Invasividad adheridas/célula con bacterias (a) adheridas A) L. salivarius 1 - subs. Salicinius (ATCC 11742) B) L. brevis (ATCC 06) C) L. brevis (ATCC 14869) D) L. crispatus 4 +/- (ATCC 33197) E) L. gasseri 16 - (ATCC 987) F) L. casei (ATCC 8) La adhesión bacteriana cuantitativa se expresa como un porcentaje de 0 células seleccionadas al azar con bacterias adheridas y como un número medio de bacterias adheridas por célula. a) + = invasiva; +/- = ligeramente invasiva; - = no invasiva. Ejemplo Efecto anti-candida de los Lactobacilos Se examinó la capacidad de interferir de una manera competitiva con la adhesión a células HeLa de la Candida albicans (y por tanto, en la infectividad de la Candida albicans) de diversas especies de lactobacilo. Con el fin de evaluar la influencia del lactobacilo en el nivel de adhesión de los micetos (C. Albicans) acélulas hospedadoras, se inocularon células HeLa en monocapa, cultivadas en placas de 24 pocillos que contienen láminas cobertoras estériles, con 0,1 ml de una mezcla de lactobacilos y C. Albicans (dos muestras clínicas aisladas a partir de una vagina humana, denominadas en este estudio CA2 y CA3, respectivamente) diluida en PBS a una concentración final de x 9 bacterias/ml y x 8 micetos/ml, respectivamente. Después de un ahora de incubación a 37 C bajo condiciones microaerofílicas, se lavaron las células cinco veces en PBS preparado con May Grunwald y Giemsa. Después se observaron las preparaciones con un microscopio óptico (a 1.000X aumentos) y se evaluó el nivel de microorganismos adheridos a las células HeLa. Los resultados obtenidos, indicados en la Tabla 2, muestran que todos los lactobacilos analizados son capaces de reducir la adhesión de C. albicans acélulas HeLa, siendo mostrado por L. brevis ATCC 06 el grado más alto de actividad inhibitoria, el cual produjo una reducción de alrededor del 0 % en el número de células con Candida adherida y redujo el número de micetos/célula hasta alrededor de la mitad del número testigo. 6

7 ES T3 TABLA 2 Exclusión competitiva por lactobacilos de la adhesión de C. albicans a células HeLa Microorganismo %decélulas con Número medio de microorganismos/célula micetos bacterias micetos bacterias CA2 68 CA A) L. salivarius 4 subs. Salicinius (ATCC 11742) B) L. brevis 9 (ATCC 06) C) L. gasseri 1 6 (ATCC 987) D) L. casei 13 8 (ATCC 8) CA2 + A 2 3 CA3 + A CA2 +B CA3 + B CA2 + C CA3 + C CA2 + D CA3 + D Para el ensayo de exclusión competitiva se usaron lactobacilos y micetos a una concentración final de x 9 /pocillo y x 9 /pocillo respectivamente. Ejemplo 3 Producción de peróxido de hidrógeno por los Lactobacilos Se examinó la capacidad de producir H 2 O 2 de cinco especies de lactobacilos. Las bacterias se situaron para el cultivo en una placa de agar-agar con tetrametilbencidina. Después de tres días de incubación a 37 C en una jarra bajo condiciones anaerobias se expusieron al aire las placas de agar-agar. De esta forma, la peroxidasa presente en el medio de cultivo reacciona con el H 2 O 2 producido por los lactobacilos. La subsiguiente oxidación de la tetrametilbencidina se revela mediante una pigmentación azul de las colonias productoras de H 2 O 2. 7

8 ES T3 Los resultados obtenidos, indicados en la Tabla 3, muestran que el L. salivarius subs. salicinius ATCC y el L. gasseri ATCC 987 fueron positivos al H 2 O 2. L. casei ATCC 8 no mostró ninguna positividad. Las otras cepas analizadas estaban desprovistas de cualquier reacción. Estos resultados muestran que no existe correlación entre la producción de H 2 O 2 por los lactobacilos y la exclusión competitiva de la adhesión de C. albicans acélulas HeLa por las bacterias. TABLA 3 Producción de peróxido de hidrógeno por los lactobacilos 1 2 Lactobacilos Producción de H 2 O 2 A) L. salivarius subs. Salicinius + (ATCC 11742) B) L. brevis (ATCC 06) - B) L. brevis (ATCC 14869) - C) L. gasseri (ATCC 987) + D) L. casei (ATCC 8) - + = pigmentación azul de todas las colonias de bacterias. +/- = ligera pigmentación azul. - = ninguna colonia pigmentada. 3 Para fines ilustrativos, pero no en un sentido limitante, algunos ejemplos de las composiciones farmacéuticas preferidas se reproducen de aquí en adelante, dichas composiciones están destinadas a la preparación de comprimidos, óvulos vaginales, cremas y soluciones líquidas para administración vaginal de un producto liofilizado de cultivo microbiano que consiste en una asociación de varias especies microbianas. Ejemplos de preparaciones vaginales Ejemplo Composición unitaria para preparar comprimidos ligeramente efervescentes de rápida liberación que contienen vehículos y un producto liofilizado de cultivo microbiano (1x UFC/g) que consiste en una asociación de L. brevis ATCC 06 y L. salivarius subs. salicinius ATCC (en una relación 1:1): Producto liofilizado de cultivo microbiano 00 mg Lactosa mg Almidón de maíz 0 mg Ácido adípico 67 mg Bicarbonato sódico 67 mg Estearato de magnesio 11 mg Ácido esteárico 3 mg Sílice coloidal 2 mg Para la preparación de comprimidos que tienen la composición anterior se requiere una preparación previa de un granulado o de pelets. Los pelets lubricados se añaden después a 00,0 g de dicho producto liofilizado de cultivo microbiano previamente tamizado en una malla de 0 µm, y se mezcla otra vez durante 1 minutos. Los pelets 8

9 ES T3 obtenidos de este modo se someten a la subsiguiente operación de compresión usando una máquina compresora rotatoria provista de punzones tallados de forma oval, de manera que los comprimidos de uso vaginal se obtienen con un peso medio de 1.0 mg. Los comprimidos obtenidos tienen un tiempo de disgregación de alrededor de 1 minutos mediante el uso de el aparato descritos en la Farmacopea Ufficiale Italiana. Ejemplo Composición unitaria para preparar comprimidos de liberación lenta que contienen vehículos y el mismo producto liofilizado de cultivo microbiano que en el Ejemplo 4: Producto liofilizado de cultivo microbiano 00 mg Manitol mg Hidroxipropil-metilcelulosa 80 mg Talco 18 mg Estearato de magnesio 19 mg Sílice coloidal 3 mg El producto liofilizado de cultivo microbiano se calibra forzando la masa esponjosa dentro de una malla de 270 µm; el producto tamizado se añade a manitol, previamente tamizado en una malla de 279 µm, hidroxipropil-metilceluosa, talco, estearato de magnesio y sílice coloidal. La masa completa se mezcla durante minutos en un mezclador de tipo T2A Turbula para polvos. La mezcla obtenida de este modo se somete a la subsiguiente operación de compresión usando una máquina compresora rotatoria provista de punzones tallados de forma oval, obteniendo de este modo los comprimidos de uso vaginal con un peso medio de 1.0 mg. Los comprimidos obtenidos tienen un tiempo de disgregación de alrededor de minutos mediante el uso de el aparato descritos en la Farmacopea Ufficiale Italiana. Ejemplo 6 Preparación de comprimidos de dos capas (una capa de liberación rápida y una capa de liberación lenta) que contienen vehículos y el mismo producto liofilizado de cultivo microbiano que en el Ejemplo 4: Composición unitaria para la preparación de la capa de liberación rápida (ésta es una capa ligeramente efervescente): Producto liofilizado de cultivo microbiano mg Lactosa 2 mg Almidón de maíz 41 mg Ácido adípico mg Bicarbonato sódico mg Estearato de magnesio 6 mg Ácido esteárico 2 mg Sílice coloidal 1 mg Composiciónunitariaparalapreparación de la capa de liberación lenta: Producto liofilizado de cultivo microbiano mg Manitol 280 mg Hidroxipropil-metilcelulosa 0 mg Talco 9 mg Estearato de magnesio mg Sílice coloidal 1 mg Los pelets a usar para la capa de liberación rápida se preparan siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 4; la mezcla a usar para la capa de liberación lenta se prepara siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo. Los pelets descritos para la capa de liberación rápida y la mezcla descrita para la preparación de la 9

10 ES T3 capa de liberación lenta se cargan en dos cubas de carga distintas de una máquina compresora apropiada, adaptada para producir comprimidos de dos capas (de tipo Manesty Layer Press) provista de punzones de forma oval curvada. La máquina se ajusta de modo que los comprimidos de dos capas se obtienen con un peso medio de 1.0 mg, consistiendo en 2 capas de 0 mg cada una y conteniendo cada una mg del producto liofilizado de cultivo microbiano. Los comprimidos de dos capas obtenidos, sometidos a un ensayo de disgregación usando el aparato descrito en la Farmacopea Ufficiale Italiana, tienen un tiempo de disgregación de alrededor de 1 minutos para la capa de liberación rápida y - minutos para la capa de liberación lenta. Ejemplo Ingrediente activo: 1 gramo del mismo producto liofilizado de cultivo microbiano que en el Ejemplo Excipientes: 2, gramos de glicéridos semisintéticos y almidón de patata. Ejemplo 8 Crema vaginal (tubo de gramos) 2 4. Ingrediente activo: 1 gramo del mismo producto liofilizado de cultivo microbiano que en el Ejemplo Excipientes: lanolina hidrogenada (2 g), aceite de vaselina (2 g), dimetil-polisiloxano (3 g), SiO 2 (4 g). Ejemplo 9 Botellas pequeñas con reservorio Cada botella pequeña contiene: 3 a) Reservorio: 2 gramos del mismo producto liofilizado de cultivo microbiano que en el Ejemplo 4. b) Botella pequeña ( ml):glicerol (3 g) y agua en una cantidad suficiente hasta ml. 4 Ejemplos al 1 Los ejemplos 4 a 9 se repitieron siguiendo las mismas modalidades según se especifica en dichos Ejemplos respectivamente, con la única diferencia de que se usó un producto liofilizado de cultivo microbiano (concentración 1x UFC/g) que consistió en las especies L. brevis ATCC 14869, L. salivarius subs. salicinius ATCC y L. gasseri ATCC 987 en una relación 1:1:1. Todas la preparaciones farmacéuticas obtenidas en los Ejemplo 4 al 1 se ha comprobado que son muy eficientes al tratar pacientes que sufren vaginosis y vaginitis. 0

11 ES T3 REIVINDICACIONES Uso de una asociación de lactobacilos de las especies Lactobacillus brevis y Lactobacillus salivarius subs. salicinius para preparación de una composición farmacéutica a emplear mediante administración vaginal para tratamiento de vaginosis y vaginitis. 2. Un uso según la reivindicación 1, en el que dicha asociación de lactobacilos comprende una o más especies de lactobacilos seleccionadas de Lactobacillus salivarius subs. salicinius, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus catenaforme, Lactobacillus minutus y Lactobacillus gasseri. 3. Un uso según la reivindicación 1, en el que dicha asociación de lactobacilos consiste en las especies Lactobacillus brevis, Lactobacillus salivarius subs. salicinius, ylactobacillus gasseri. 4. Un uso según una o más de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha asociación de lactobacilos se emplea a una concentración de 7 a 13 UFC/g.. Un uso según una o más de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición farmacéutica se prepara en forma líquida, en forma de cremas o ungüentos, o en forma sólida, como óvulo vaginal o comprimidos vaginales. 6. Un uso según la reivindicación, en el que la composición farmacéutica se prepara en forma de comprimidos que constan de al menos dos capas, conteniendo ambas dichas especies de lactobacilos, unidas con los excipientes y aditivos usuales, de forma que la velocidad de liberación de las bacterias de la capa más externa sea mayor que la velocidad de liberación de las bacterias de la capa más interna. 7. Una composición farmacéutica a usar mediante administración vaginal para tratamiento de infecciones vaginales, que comprende una asociación de lactobacilos de las especies Lactobacillus brevis y Lactobacillus salivarius subs. salicinius. 8. Una composición según la reivindicación 7, en la que dicha asociación de lactobacilos también comprende una o más especies de lactobacilos seleccionados de Lactobacillus salivarius subs. salivarius, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus catenaforme, Lactobacillus minutus y Lactobacillus gasseri. 9. Una composición según la reivindicación 7, en la que dicha asociación de lactobacilos consiste en las especies Lactobacillus brevis, Lactobacillus salivarius subs. salicinius, y Lactobacillus gasseri.. Una composición según una o más de las reivindicaciones 7 a 9, en la que dicha asociación de lactobacilos se emplea a una concentración de 7 a 13 UFC/g Una composición según una o más de las reivindicaciones 7 a, en una forma líquida, en forma de cremas o ungüentos, o en forma sólida, como óvulo vaginal o comprimidos vaginales. 12. Una composición según la reivindicación 11, en forma de comprimidos que constan de al menos dos capas, conteniendo ambas dichas especies de lactobacilos, unidas con los excipientes y aditivos usuales, de forma que la velocidad de liberación de las bacterias de la capa más externa es mayor que la velocidad de liberación de las bacterias de la capa más interna. 0 NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté onoincluída en la mencionada reserva. 11