Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Escuela de Química y Farmacia

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1 Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Escuela de Química y Farmacia PROFESOR PATROCINANTE: Daniel Pérez O. INSTITUCIÓN: Laboratorio Bagó de Chile S.A. PROFESOR CO-PATROCINANTE: Alejandro Jerez M. INSTITUTO: Farmacia FACULTAD: Ciencias DESARROLLO DE UN TRABAJO IN VITRO PARA BIOEXENCIÓN DE UN ESTUDIO DE BIOEQUIVALENCIA PARA ESTABLECER EQUIVALENCIA TERAPÉUTICA ENTRE DOS FORMULACIONES COMPRIMIDOS QUE CONTIENEN CICLOBENZAPRINA CLORHIDRATO 10 mg Internado presentado como parte de los requisitos para optar al Título de Químico Farmacéutico CRISTOPHER AARON HERNÁNDEZ BUSTOS VALDIVIA - CHILE 2010

2 A mis padres y hermana, por todo el apoyo brindado en cada momento de mi vida 2

3 3 AGRADECIMIENTOS Agradezco a Laboratorio Bagó de Chile S.A. por otorgarme la oportunidad de realizar mi internado en la unidad de Desarrollo y Biofarmacia. En especial, agradezco a los Químicos Farmacéuticos, Analistas y Auxiliar de Servicio de esta unidad, que amablemente me otorgaron su disposición y cooperación. A cada uno de mis profesores de la Universidad Austral de Chile, que me guiaron y acompañaron en mi proceso formativo. Finalmente, agradecer a todas las personas e instituciones que han sido parte en mi desarrollo y crecimiento como persona.

4 4 ÍNDICE 1. Resumen... Pág. 15 Summary Introducción Marco Teórico Biodisponibilidad Biofarmacia Bioequivalencia Estudio de Bioequivalencia in vitro Bioexención Sistema de Clasificación Biofarmacéutico Buenas Prácticas de Manufactura y Control de Calidad Validación Problemática a abordar Objetivo General Objetivos Específicos Materiales Metodología Resultados Discusión Conclusiones Proyección Referencias Bibliográficas

5 5 ÍNDICE DE FIGURAS Pág. Fig. 1. Sistema de Clasificación Biofarmacéutico (SCB) Fig. 2. Fórmula para obtener el factor de similitud (f2) Fig. 3. Medición del alineamiento de los ejes Fig. 4. Estructura Ciclobenzaprina Clorhidrato Fig. 5. Diseño experimental para 7 variables en un estudio de Robustez Fig. 6. Parámetros evaluados en la Robustez Fig. 7. Experimentos y sus parámetros correspondientes Fig. 8. Criterios de aceptación para la Robustez Fig. 9. Aparatos de disolución utilizados Fig. 10. Condiciones para las pruebas de disolución Fig. 11. Descripción de los productos en estudio Fig. 12. Tabla con resumen de resultados de Selectividad del medio y matriz... 71

6 6 Fig. 13. Resumen de resultados en relación al factor de respuesta Fig. 14. Resultados de Linealidad para medio HCl 0,1 N, ph 1, Fig. 15. Resultados de Linealidad para Buffer Ftalato, ph 3, Fig. 16. Resultados de Linealidad para Buffer Acetato, ph 4, Fig. 17. Resultados de Linealidad para Buffer Fosfato, ph 6, Fig. 18. Resultados de Exactitud y Precisión para el medio HCl 0,1 N, ph 1, Fig. 19. Resultados de Exactitud y Precisión para el Buffer Ftalato, ph 3, Fig. 20. Resultados de Exactitud y Precisión para el Buffer Acetato, ph 4, Fig. 21. Resultados de Exactitud y Precisión para el Buffer Fosfato, ph 6, Fig. 22. Resultado Precisión Intermedia realizada en Buffer Acetato ph 4,5 (Lote 1) Fig. 23. Resultado Precisión Intermedia realizada en Buffer Fosfato ph 6,8 (Lote 2) Fig. 24. Resultados Estabilidad para medio HCl 0,1 N, ph 1, Fig. 25. Resultados Estabilidad para Buffer Ftalato, ph 3, Fig. 26. Resultados Estabilidad para Buffer Acetato, ph 4,

7 7 Fig. 27. Resultados Estabilidad para Buffer Fosfato, ph 6, Fig. 28. Resultados Robustez para medio HCl 0,1 N, ph 1,2 (muestras con matriz) Fig. 29. Resultados Robustez para medio HCl 0,1 N, ph 1,2 (muestras sin matriz) Fig. 30. Resultados Robustez para Buffer Ftalato, ph 3,0 (muestras sin matriz) Fig. 31. Resultados Robustez para Buffer Acetato, ph 4,5 (muestras con matriz) Fig. 32. Resultados Robustez para Buffer Acetato, ph 4,5 (muestras sin matriz) Fig. 33. Resultados Robustez para Buffer Fosfato, ph 6,8 (muestras con matriz) Fig. 34. Resultados Robustez para Buffer Fosfato, ph 6,8 (muestras sin matriz) Fig. 35. Resumen resultados Influencia del Filtro para todos los medios Fig. 36. Estándar Ciclobenzaprina Clorhidrato en medio HCl 0,1 N, ph 1, Fig. 37. Cromatograma del producto en estudio, que contiene Ciclobenzaprina Clorhidrato, en medio HCl 0,1 N, ph 1, Fig. 38. Cromatograma para el blanco medio HCl 0,1 N, ph 1, Fig. 39. Cromatograma de la matriz del producto en estudio, medio HCl 0,1 N, ph 1, Fig. 40. Estándar Ciclobenzaprina Clorhidrato, Buffer Ftalato ph 3,

8 8 Fig. 41. Cromatograma para el blanco, Buffer Ftalato ph 3, Fig. 42. Estándar Ciclobenzaprina Clorhidrato Buffer Acetato ph 4, Fig. 43. Cromatograma del producto en estudio, que contiene Ciclobenzaprina Clorhidrato, Buffer Acetato ph 4, Fig. 44. Cromatograma para el blanco, Buffer Acetato ph 4, Fig. 45. Cromatograma de la matriz del producto en estudio, Buffer Acetato ph 4, Fig. 46. Estándar Ciclobenzaprina Clorhidrato, Buffer Fosfato ph 6, Fig. 47. Cromatograma del producto en estudio, que contiene Ciclobenzaprina Clorhidrato, Buffer Fosfato ph 6, Fig. 48. Cromatograma para el blanco, Buffer Fosfato ph 6, Fig. 49. Cromatograma de la matriz del producto en estudio, Buffer Fosfato ph 6, Fig. 50. Resultados de Solubilidad medio HCl 0,1 N, ph 1, Fig. 51. Resultados de Solubilidad Buffer Ftalato, ph 3, Fig. 52. Resultados de Solubilidad Buffer Acetato, ph 4, Fig. 53. Resultados de Solubilidad Buffer Fosfato ph 6, Fig. 54. Representación gráfica de los resultados de Solubilidad de Ciclobenzaprina Clorhidrato en la forma de perfil de solubilidad versus ph... 99

9 9 Fig. 55. Resultados de Permeabilidad según Software ChembiowDraw Ultra Fig. 56. Resultados permeabilidad a través de la barrera hematoencefálica en células MDCK tipo II Fig. 57. Tabla Clasificaciones de Permeabilidad para fármacos Fig. 58. Correlación de permeabilidades jejunales humanas con permeabilidades determinadas en células MDCK tipo II Fig. 59. Gráfico de correlación de permeabilidades jejunales humanas con permeabilidades determinadas en células MDCK tipo II Fig. 60. Correlación de Células MDCK con Células Caco Fig. 61. Gráfico correlación células MDCK con células Caco-2, Apical Basolateral Fig. 62. Gráfico correlación células MDCK con células Caco-2, Basolateral- Apical Fig. 63. Perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) Fig. 64. Cálculo de los valores corregidos para las pruebas de disolución realizadas en el aparato de disolución modelo Vision Elite, Hanson Research Fig. 65. Cálculo de los valores corregidos para las pruebas de disolución realizadas en los aparatos de disolución modelo SR8 Plus, Hanson Research Fig. 66. Gráfico perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) Fig. 67. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) Fig. 68. Perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 2, medio HCl 0,1 N (ph 1,2)

10 10 Fig. 69. Gráfico perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 2, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) Fig. 70. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto en estudio Lote 2, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) Fig. 71. Perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 3, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) Fig. 72. Gráfico perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 3, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) Fig. 73. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto en estudio Lote 3, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) Fig. 74. Perfil liberación-disolución producto de referencia (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) Fig. 75. Gráfico perfil liberación-disolución producto de referencia (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) Fig. 76. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto de referencia Lote 1, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) Fig. 77. Resumen resultados estudio liberación-disolución para medio HCl 0,1 N, ph 1, Fig. 78. Perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, Buffer Acetato (ph 4,5) Fig. 79. Gráfico perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, Buffer Acetato (ph 4,5) Fig. 80. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto en estudio Lote 1, Buffer Acetato (ph 4,5) Fig. 81. Perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 2, Buffer Acetato (ph 4,5) Fig. 82. Gráfico perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 2, Buffer Acetato (ph 4,5)

11 11 Fig. 83. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto en estudio Lote 2, Buffer Acetato (ph 4,5) Fig. 84. Perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 3, Buffer Acetato (ph 4,5) Fig. 85. Gráfico perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 3, Buffer Acetato (ph 4,5) Fig. 86. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto en estudio Lote 3, Buffer Acetato (ph 4,5) Fig. 87. Perfil liberación-disolución producto de referencia (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, Buffer Acetato (ph 4,5) Fig. 88. Gráfico perfil liberación-disolución producto de referencia (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, Buffer Acetato (ph 4,5) Fig. 89. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto de referencia Lote 1, Buffer Acetato (ph 4,5) Fig. 90. Resumen resultados estudio liberación-disolución para Buffer ph 4, Fig. 91. Perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, Buffer Fosfato (ph 6,8) Fig. 92. Gráfico perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, Buffer Fosfato (ph 6,8) Fig. 93. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto en estudio Lote 1, Buffer Fosfato (ph 6,8) Fig. 94. Perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 2, Buffer Fosfato (ph 6,8) Fig. 95. Gráfico perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 2, Buffer Fosfato (ph 6,8) Fig. 96. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto en estudio Lote 2, Buffer Fosfato (ph 6,8)

12 12 Fig. 97. Perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 3, Buffer Fosfato (ph 6,8) Fig. 98. Gráfico perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 3, Buffer Fosfato (ph 6,8) Fig. 99. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto en estudio Lote 3, Buffer Fosfato (ph 6,8) Fig Perfil liberación-disolución producto de referencia (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, Buffer Fosfato (ph 6,8) Fig Gráfico perfil liberación-disolución producto de referencia (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, Buffer Fosfato (ph 6,8) Fig Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto de referencia Lote 1, Buffer Fosfato (ph 6,8) Fig Resumen resultados estudio liberación-disolución para Buffer ph 6, Fig Tabla que entrega el resumen final de los resultados del estudio de liberación-disolución por lote de producto Fig Gráfico que entrega el promedio de los resultados para el estudio de liberación-disolución (medio HCl 0,1 N, ph 1,2) Fig Gráfico que entrega el promedio de los resultados para el estudio de liberación-disolución (Buffer Acetato, ph 4,5) Fig Gráfico que entrega el promedio de los resultados para el estudio de liberación-disolución (Buffer Fosfato, ph 6,8)

13 13 ÍNDICE DE ABREVIATURAS AUC: Área bajo la curva. Caco-2: Células de carcinoma de colon humano. C.máx.: Concentración máxima. Cp: Comprimido. C.V: Coeficiente de variación. EMEA: Agencia Europea de Medicamentos. FDA: Administración Federal de Alimentos y Drogas de los Estados Unidos. FFSO-LI: Formas Farmacéuticas Sólidas de Liberación Inmediata. FIP: Federación Farmacéutica Internacional. GMP: Buenas Prácticas de Manufactura. HPLC: Cromatógrafo Líquido de Alta Performance. ICH: Conferencia Internacional sobre Armonización de Requisitos Técnicos para el Registro de Medicamentos para Uso en Humanos. ISP: Instituto de Salud Pública. IVIVC: Correlación in vivo-in vitro. MAO: Monoamino oxidasa. MAX: Máximo. MDCK: Células de riñón de canino Madin-Darby. MIN: Mínimo. OPS: Organización Panamericana de la Salud. PotSt: Potencia del estándar.

14 14 PSt: Peso del estándar. Res. Ex.: Resolución Exenta. RSD: Desviación estándar relativa. SCB: Sistema de Clasificación Biofarmacéutico. SD: Desviación estándar. USP: Farmacopea de los Estados Unidos. WHO: Organización Mundial de la Salud. X: Promedio. X Recup: Promedio de recuperación. % Recup: Porcentaje de Recuperación. [St]: Concentración del estándar.

15 15 1. RESUMEN A través de un estudio in vitro de Bioequivalencia para Bioexención, se puede demostrar la intercambiabilidad entre Formas Farmacéuticas Sólidas Orales de Liberación Inmediata (FFSO-LI), cumpliendo con los criterios normativos. El Sistema de Clasificación Biofarmacéutico (SCB) es un marco científico que clasifica los principios activos sobre la base de su solubilidad y permeabilidad; estos parámetros, más la cinética de disolución del producto farmacéutico, son los factores que gobiernan la velocidad y la cuantía de la absorción del fármaco o Biodisponibilidad. Por lo tanto, basándose en la evidencia se procedió a demostrar la Equivalencia Terapéutica entre el producto en estudio y el de referencia, que corresponden a comprimidos de 10 mg de Ciclobenzaprina Clorhidrato, a través de la caracterización del principio activo y la comparación de las cinéticas entre los productos. El estudio de Equivalencia Terapéutica se basó en las recomendaciones entregadas por la Guía Técnica G-BIOF 02 de la sección de Biofarmacia del Instituto de Salud Pública (ISP). La validación analítica permitió dar validez al desarrollo de los análisis de solubilidad del activo y de liberación-disolución de los productos de referencia y de estudio, lo cual posibilitó concluir la Equivalencia Terapéutica de los productos. Con estos estudios, Laboratorio Bagó de Chile S.A. asegura la calidad, seguridad y eficacia en sus productos y se mantiene en la vanguardia de la investigación farmacéutica.

16 16 1. SUMMARY Through an in vitro study of Bioequivalence for Biowaiver, the interchangeability between Solid Pharmaceutical Oral Forms of Immediate Release can be demonstrated, fullfilling the regulatory criteria. The Biopharmaceutics Classification System (BCS) is a scientific framework that classifies subtances drug on the basis of its solubility and permeability; these parameters, plus the kinetics of dissolution of the pharmaceutical product, are the factors that govern the rate and extent of the drug absorption or Bioavailability. Therefore, based on the evidence we proceeded to demonstrate the Therapeutic Equivalence between the product in study and the one in reference, which correspond to tablets of 10 mg of Ciclobenzaprine Hydrochloride, through the characterization of the subtance drug and the comparison of the kinetics between products. The study of Therapeutic Equivalence was based on the recommendations delivered by the Technical Guide G-BIOF 02 of the section of Biopharmacy of Public Health Institute (PHI). The analytical validation helped give validity to the development of the analysis of solubility of the drug substance and liberation-dissolution of the reference products and study, which enabled to conclude the Therapeutic Equivalence of products. With these studies, Laboratory Bagó of Chile S.A. assures the quality, safety and efficiency in its products and keeps in the forefront of the pharmaceutical investigation.

17 17 2. INTRODUCCIÓN Los medicamentos en Chile juegan un rol muy importante en la salud de las personas. En nuestro país, se encuentran disponibles un gran número de medicamentos que son distribuidos ampliamente, de manera que estén disponibles para toda la población. Es por esto, que los medicamentos deben cumplir con estándares de calidad, seguridad, eficacia y equivalencia terapéutica, por parte del producto farmacéutico similar, para poder asegurar así la intercambiabilidad. En consecuencia, asegurar la calidad es uno de los puntos esenciales al momento de hablar de medicamentos, por lo que uno de los principales requisitos es que los productos farmacéuticos sean elaborados bajo Buenas Prácticas de Manufactura (también conocidas por sus siglas en inglés como GMP). Una manera de cumplir con este objetivo es a través de la Validación, que asegura de manera consistente que los productos cumplan con sus especificaciones y que se conduzca a los resultados esperados. El establecimiento de estos requisitos técnicos deben ser previos al desarrollo de un estudio de Bioequivalencia, ya que no tiene validez demostrarlo si previamente no se asegura la reproducibilidad lote a lote (FDA, 2003). Internacionalmente se reconocen una serie de métodos para establecer o demostrar Equivalencia Terapéutica entre productos farmacéuticos (ISP, 2007). Uno de los más utilizados son los estudios in vitro para optar a bioexenciones de un estudio in vivo. La norma vigente en Chile establece que dos productos son Equivalentes Terapéuticos, si son Equivalentes Farmacéuticos, rotulados y manufacturados bajo las normas GMP y si han demostrado a través de estudios apropiados, que sus efectos

18 18 respecto a eficacia y seguridad son los mismos, luego de ser administrados en la misma dosis molar (Res. Ex. Nº 727, 2005). Debido a esto, se establece que no tienen validez los estudios de Bioequivalencia de productos farmacéuticos fabricados sin cumplimiento de las normas GMP, empleando procesos de fabricación no validados adecuadamente. El desarrollo de un producto innovador demora 12 a 15 años, de cada moléculas evaluadas tan sólo una llega al mercado y cada proyecto cuesta 800 millones de dólares, de los cuales el 94% de ellos proviene de la industria. El producto genérico, en cambio, es la formulación de un producto farmacéutico distinto del innovador, aunque con igual principio activo, pero con un precio inferior, lo que es la principal justificación de su existencia (Bavestrello, 2003). Una vez caducadas las patentes, las autoridades sanitarias quedan en libertad de permitir el registro de similares o copias del original y aprobar su salida al mercado. Esta aprobación está concebida para bajar los costos de los tratamientos debido a que en la mayoría de los casos, el producto original tiene precios mayores que los medicamentos similares (Saavedra et al, 2006). Esta es la situación que actualmente se está viviendo en el mundo y nuestro país no es ajeno a ella. La Organización Panamericana de la Salud (OPS) comparó los requisitos actuales para estudios de Bioequivalencia entre los Estados Unidos, Canadá y ocho países latinoamericanos con información disponible hasta Marzo de 2004: Argentina, Brasil, Chile, Colombia, Costa Rica, Cuba, México y Venezuela. La amplia divergencia observada entre los países en sus requerimientos para estudios de Bioequivalencia, con la excepción de Estados Unidos y Canadá, los cuales son bastante similares en sus requerimientos, indica la necesidad de continuar trabajando hacia la armonización.

19 19 Chile está en el proceso de establecer requerimientos para todos los ingredientes activos que requieren estudios de Bioequivalencia dándole prioridad a los fármacos que tienen más alto riesgo de salud para la población (OPS, 2008). Las agencias de aprobación de medicamentos más desarrolladas del mundo, Administración Federal de Alimentos (FDA), Agencia Europea de Medicamentos (EMEA) y la Organización Mundial de la Salud (WHO), han emitido numerosas declaraciones y guías de orientación para la aprobación de la intercambiabilidad terapéutica, tanto para sus propios países como para los países con menor desarrollo farmacológico (Saavedra et al, 2006). Nuestro país, desde el año 2004, ha ido desarrollando modificaciones a normas, programas de capacitación y guías técnicas tendientes a avanzar en el tema de equivalencia terapéutica (ISP, 2007). El Ministerio de Salud de Chile, a través del Instituto de Salud Pública (ISP), ha elaborado un trabajo conjunto para poder introducir modificaciones al Reglamento del Sistema Nacional de Control de Productos Farmacéuticos, tendientes a avanzar en el tema de Equivalencia Terapéutica, las que fueron publicadas en el Diario Oficial en febrero de Paralelamente, la Sección de Biofarmacia del Departamento de Control Nacional del ISP, elaboró la Norma que Define Criterios para Establecer Equivalencia Terapéutica a Productos Farmacéuticos en Chile, la cual fue editada por el Ministerio de Salud y publicada en el diario oficial junto con las Listas de principios activos contenidos en productos farmacéuticos, a los cuales se les deberá exigir estudios de Bioequivalencia in vivo o estudios in vitro (ISP, 2007). Con el propósito de implementar la exigencia reguladora de la Equivalencia Terapéutica en Chile, durante el año 2007 la Sección de Biofarmacia del ISP, elaboró

20 20 toda la documentación técnica indispensable con el objetivo de realizar los estudios necesarios para demostrar intercambiabilidad entre productos farmacéuticos. Dentro de los documentos incluidos se encuentra la Guía Técnica G-BIOF 02 denominada Bioexención de los estudios de Biodisponibilidad/Bioequivalencia para establecer Equivalencia Terapéutica de Formas Farmacéuticas Sólidas Orales, que entrega recomendaciones para las solicitudes de exención de los estudios de Biodisponibilidad y/o Bioequivalencia in vivo para formas farmacéuticas sólidas orales de liberación inmediata (FFSO-LI) en base al Sistema de Clasificación Biofarmacéutico (SCB) y para formulaciones sólidas orales proporcionalmente similares a otro producto cuya Equivalencia Terapéutica haya sido demostrada mediante un estudio in vivo (ISP, 2007). En Chile, los estudios de Bioequivalencia deben hacerse en centros autorizados por el ISP. Existen dos tipos de centros autorizados: los centros para estudios de Bioequivalencia en voluntarios sanos (estudios in vivo), y centros para estudios biofarmacéuticos con fines de Bioexención de los estudios de Bioequivalencia in vivo (estudios in vitro). Hasta el momento, Chile cuenta con nueve centros de estudios biofarmacéuticos autorizados y veintisiete centros para estudios de Bioequivalencia in vivo, uno en Chile, dos en Argentina y veinticuatro en Brasil (ISP, 2010). Cabe destacar que existen principios activos definidos por el Ministerio de Salud para los cuales es obligatorio la demostración de Bioequivalencia por medio de estudios in vivo o in vitro, pero también existe la alternativa que laboratorios presenten protocolos de estudios de Bioequivalencia de productos que no aparezcan en los listados oficiales o presenten informes de resultados de estudios realizados fuera de Chile, siempre y

21 21 cuando éstos hayan sido previamente autorizados por agencias regulatorias internacionales de prestigio, que menciona la Norma Chilena de Bioequivalencia (ISP, 2010). El SCB simplifica los estudios de Bioequivalencia ya que se realizan pruebas in vitro, sin requerir estudios en humanos por lo que son de menor costo y de mayor rapidez. Aunque los estudios de Bioequivalencia in vivo han sido el estándar aceptado internacionalmente para demostrar la seguridad y eficacia de los medicamentos, actualmente se están aceptando los estudios de Bioequivalencia in vitro y cada vez toman más fuerza para demostrar la intercambiabilidad de aquellos medicamentos que pertenecen a la Clase I según el SCB, es decir, que presenten alta solubilidad y alta permeabilidad (Medina, 2009). Así mismo, recientemente, la WHO extendió la Bioexención a los productos formulados con principios activos de la Clase 2 y 3, los cuales deben cumplir con ciertos criterios durante la evaluación (ISP, 2007). A partir de estos antecedentes, Laboratorio Bagó de Chile S.A. ha querido estar a la vanguardia de la investigación, el cumplimiento de las normativas y de las políticas públicas de salud, incorporando a sus investigaciones, la realización de estudios de Bioequivalencia in vitro, autorización que fue otorgada el año 2008 por el ISP a través de la Resolución N 7449, que otorga la certificación como Laboratorio autorizado para la realización de estudios in vitro para optar a Bioexención. Laboratorio Bagó de Chile S.A., en un permanente interés por estar a la vanguardia farmacéutica, considera un deber garantizar la calidad, seguridad y eficacia de sus productos farmacéuticos comercializados, por lo que han implementado todas las herramientas necesarias para ratificar que sus productos son alternativas viables que mantienen el mismo nivel de

22 22 calidad requerido, lo que pretenden demostrar a través de estudios de Bioequivalencia in vitro.

23 23 Historia del Laboratorio Laboratorios Bagó, empresa líder de la Organización Bagó, fue fundado en 1934 por Don Sebastián Bagó, en Argentina. Desde 1960, Laboratorios Bagó S.A. comienza a afianzarse como una de las empresas líderes argentinas con una fuerte presencia en Latinoamérica, lo que le permite extender su exitosa gestión a través de sus 18 filiales en países de la región. A mediados de los años ochenta, la Organización Bagó se consolida constituyendo un conjunto de empresas que le permite no sólo llevar los beneficios de sus productos a otras naciones, sino favorecer el desarrollo científico de la región a través del intercambio profesional y la apertura de lazos de comunicación y cooperación científica y tecnológica. Laboratorio Bagó S.A. de Chile, ocupa una posición de liderazgo dentro del mercado farmacéutico chileno, tanto en unidades como en valores, ubicándose entre las cinco empresas más importantes del sector farmacéutico chileno. La Planta Farmacéutica está certificada por el Instituto de Salud Pública de Chile bajo las estrictas normas GMP, conforme a las prácticas de manufactura recomendadas por la Organización Mundial de la Salud. El laboratorio de Control de Calidad, está reconocido y autorizado también por el ISP, como Laboratorio de Control Externo de Calidad, desde el año Laboratorio Bagó S.A. de Chile además de producir medicamentos para el mercado nacional, también exporta a las filiales de la Compañía en Bolivia, Ecuador, Paraguay y Perú.

24 24 3. MARCO TEÓRICO 3.1. Biodisponibilidad La Biodisponibilidad se refiere a la velocidad y cantidad en que un fármaco es absorbido a partir de una forma farmacéutica para alcanzar la circulación sistémica. Existen una serie de factores que van a influir directa o indirectamente en la Biodisponibilidad de un principio activo (Aulton, 2004). En primer lugar, tenemos el tipo de forma farmacéutica y los excipientes utilizados, que deben entregar el principio activo en forma eficiente, disolverse en el medio biológico en el que se encuentra y absorberse para luego llegar a la circulación sistémica. El segundo factor que también está relacionado es el mecanismo de absorción, que se refiere a como el principio activo es transportado desde el lumen hacia la circulación sistémica a través de un transporte activo, difusión simple, difusión facilitada, filtración, pinocitosis o transporte por pares iónicos. El tercer factor son las características propias del sistema gastrointestinal y el tiempo de tránsito que varía desde la ingesta de la forma farmacéutica hasta su llegada al colón. El cuarto factor son las características fisicoquímicas del fármaco que afectan la absorción, como el coeficiente de partición, constantes de disociación, ph, pka, etc. Finalmente, tenemos el quinto factor que corresponde a la eliminación presistémica a nivel intestinal y hepática que está dado por el sistema enzimático del citocromo P450 o transportadores de flujo presentes en el intestino delgado, que pueden disminuir la biodisponibilidad de ciertos fármacos impidiendo en un cierto grado la absorción del principio activo (Aulton, 2004).

25 25 Por lo tanto, para que un principio activo se pueda absorber, debe liberarse desde la forma farmacéutica, disolverse en condiciones fisiológicas y ser permeable a través de la barrera gastrointestinal, para posteriormente alcanzar la circulación sistémica. La velocidad de disolución va a depender de factores relacionados con el medio de disolución como el ph, temperatura, viscosidad, tensión superficial e intensidad de la agitación. Otro factor asociado es con respecto al sólido que se va a disolver, (su naturaleza química, el tamaño de partícula y el polimorfismo). Por último, tenemos a los factores que dependen de la forma farmacéutica como la vía de administración y los excipientes utilizados (Aulton, 2004). La Biodisponibilidad absoluta de un medicamento es una medida de la eficacia de la vía de administración. La vía intravenosa es la referencia absoluta ya que cuando se inyecta un fármaco por esta vía, ingresa a la circulación sistémica el 100% de la dosis. Por lo tanto, para evaluar la Biodisponibilidad absoluta se debe administrar el mismo principio activo primero en una forma farmacéutica de uso intravenoso y luego en otra forma farmacéutica preparada para administrar por la vía que se quiere estudiar (Estévez, 2000). En cambio, la Biodisponibilidad relativa es aquella en la que se compara la Biodisponibilidad de un fármaco administrado en la forma farmacéutica de prueba con la del mismo fármaco administrado mediante la forma farmacéutica convencional (Aulton, 2004). Por lo tanto, la Biodisponibilidad relativa es una medida de la eficacia de la absorción de un mismo principio activo desde dos formas farmacéuticas similares (Estévez, 2000).

26 Biofarmacia La Biofarmacia puede definirse como el estudio de la influencia de las propiedades fisicoquímicas de los fármacos, su presentación y sus vías de administración sobre la velocidad y magnitud de su absorción. Los factores que influyen sobre la liberación de un fármaco de su forma farmacéutica, su disolución en los líquidos fisiológicos, su estabilidad en esos líquidos, su permeabilidad a través de las membranas biológicas más importantes y su metabolismo presistémico, condicionarán la velocidad y magnitud de la absorción del fármaco (Aulton, 2004). En los últimos años, las propiedades biofarmacéuticas han sido utilizadas como una herramienta fundamental en la demostración de intercambiabilidad entre productos farmacéuticos, lo que ha permitido comprobar si productos farmacológicos químicamente equivalentes, pero fabricados por compañías distintas, son terapéuticamente equivalentes. Esto se ha logrado a través de una extensión del concepto de biodisponibilidad relativa, que consiste básicamente en comparar la cantidad total de un fármaco que llega sin cambios a la circulación sistémica a partir de una forma farmacéutica de prueba y de otra convencional, que contengan dosis iguales del mismo fármaco, siendo equivalentes o no en cuanto a la velocidad y magnitud de su absorción. A esto se le denomina estudio de Bioequivalencia, que consiste básicamente en la comparación de dos productos farmacéuticos en relación a su Biodisponibilidad Bioequivalencia Se dice que dos o más productos químicamente equivalentes son Bioequivalentes si sus biodisponibilidades no difieren significativamente cuando se

27 27 administra la misma dosis en condiciones experimentales similares (Aulton, 2004). Por lo tanto, los productos farmacéuticos se consideran Bioequivalentes si el producto farmacéutico de prueba no muestra una diferencia significativa en la velocidad y grado de absorción por comparación con un producto farmacéutico designado como referencia, cuando se administran a la misma dosis molar de la misma entidad activa, en la misma forma farmacéutica, bajo condiciones experimentales similares, bien sea en dosis únicas o en dosis múltiples (USP, 2009). El objetivo de un estudio de Bioequivalencia es demostrar que dos productos medicinales producen concentraciones suficientemente similares para concluir que el efecto sistémico de los productos es el mismo (EMEA, 2001). El diseño de un estudio de Bioequivalencia depende de los objetivos del mismo, la capacidad de analizar el fármaco en fluidos biológicos, la farmacodinámica del fármaco, la vía de administración del medicamento, la naturaleza del fármaco y del producto farmacéutico (USP, 2009). Dentro de este contexto, los productos farmacéuticos se pueden clasificar de la siguiente manera: Equivalentes Farmacéuticos Son productos farmacéuticos que contienen idénticas cantidades de los mismos principios activos, o sus mismas sales o ésteres, en idéntica forma farmacéutica y vía de administración, pero no necesariamente contienen los mismos excipientes, y que cumplen con las mismas o comparables especificaciones de calidad (Res. Ex. Nº 727, 2005).

28 28 Equivalentes Farmacéuticos no necesariamente implican Bioequivalencia ya que diferencias en los excipientes y/o procesos de manufactura pueden conducir a una rápida o lenta disolución y/o absorción (EMEA, 2001) Equivalentes Terapéuticos Dos productos farmacéuticos son Equivalentes Terapéuticos si son Equivalentes Farmacéuticos y, después de la administración en la misma dosis molar, sus efectos, con respecto a eficacia y seguridad, son esencialmente los mismos, determinados por estudios apropiados (Clínicos, Farmacodinámicos, de Bioequivalencia, o "in vitro"). Tales productos deben estar adecuadamente rotulados y ser manufacturados cumpliendo con las normas vigentes GMP (Res. Ex. Nº 727, 2005). En la práctica, la demostración de Bioequivalencia es generalmente el método más apropiado de acreditar Equivalencia Terapéutica entre productos medicinales que son Equivalentes Farmacéuticos, siempre y cuando ellos no tengan excipientes que vayan a afectar la seguridad o la eficacia. (EMEA, 2001) Alternativas Farmacéuticas Los productos farmacéuticos son Alternativas Farmacéuticas si ellos contienen idénticas cantidades de los mismos principios activos, pero difieren en su forma farmacéutica (tabletas y cápsulas, por ejemplo) o en su forma química (diferentes sales o ésteres, por ejemplo). Las Alternativas Farmacéuticas entregan la misma fracción activa por la misma ruta de administración pero no son Equivalentes Farmacéuticos (Res. Ex. Nº 727, 2005).

29 Estudios de Bioequivalencia in vitro Los estudios de Bioequivalencia se iniciaron en 1977, cuando la FDA solicitó determinaciones farmacocinéticas para Bioequivalencia, medidos en AUC (área bajo la curva) y C.máx. (concentración máxima). La solicitud fue originada debido a problemas surgidos en ese entonces, con genéricos de digoxina, fenitoína, antidepresivos tricíclicos e hipoglicemiantes orales (Bavestrello, 2003). La utilización de los estudios in vitro (estudios de liberación disolución in vitro) se basan en el hecho de que después de la administración de un medicamento por vía oral desde una forma farmacéutica sólida, la absorción del principio activo depende de los procesos de liberación, disolución y permeabilidad a través de la barrera gastrointestinal (ISP, 2007). Hay evidencia que indica que las diferencias observadas in vivo entre la velocidad y la cuantía de la absorción de un principio activo en dos productos farmacéuticos orales sólidos (Equivalentes Farmacéuticos o Alternativas Farmacéuticas) pueden ser atribuibles a diferencias en la cinética de liberacióndisolución del fármaco in vivo (Yu et al, 2001). Sin embargo, cuando la liberacióndisolución in vivo de una FFSO-LI es rápida en relación con el vaciamiento gástrico y el principio activo tiene alta permeabilidad, es poco probable que la velocidad y la cuantía de la absorción del fármaco dependan de la liberación-disolución y/o el tiempo de tránsito gastrointestinal del fármaco. Bajo tales circunstancias, es posible que no sea necesaria la demostración de Biodisponibilidad comparativa o Bioequivalencia in vivo para los productos farmacéuticos que contienen principios activos que pertenecen a la Clase 1, siempre que los excipientes usados en la forma farmacéutica y el proceso de

30 30 fabricación no afecten significativamente la absorción de los principios activos (Niazi, 2007). Esta información es esencial, ya que otorga la evidencia científica necesaria para respaldar la realización de los estudios de Bioequivalencia in vitro para los principios activos que pertenecen a la Clase 1, según el SCB, demostrando de esta manera la Equivalencia Terapéutica del producto genérico, que se propone como sustituyente del producto innovador desarrollado por la industria de investigación. Una vez establecida la Equivalencia Terapéutica se puede prescribir el medicamento genérico en base a la evidencia de seguridad y eficacia establecida durante la investigación. Un estudio de Bioequivalencia in vitro es una prueba de disolución que incluye la comparación del perfil de disolución entre el producto de estudio y el producto de referencia en tres medios: a ph 1,2, ph 4,5 y ph 6,8 (WHO, 2006). Para la realización de un estudio de Bioequivalencia, es necesario contar con un producto farmacéutico de referencia, que generalmente es el producto innovador elaborado por la industria farmacéutica de desarrollo, y el producto farmacéutico en estudio. Ambos son definidos de la siguiente manera: Producto de Referencia o Innovador El producto de referencia es un producto farmacéutico con el que el producto en estudio está destinado a ser intercambiable en la práctica clínica. El producto de referencia normalmente corresponde al producto innovador ya que su eficacia, seguridad y calidad han sido establecidas. La elección del producto de referencia es

31 31 generalmente hecha por la autoridades nacionales a cargo de la regulación de los medicamentos (WHO, 2006) Producto Farmacéutico en estudio Producto farmacéutico que es sometido a una investigación sistemática para determinar su equivalencia terapéutica con respecto al producto de referencia, mediante estudios apropiados (Res. Ex. Nº 727, 2005) Bioexención Es la prerrogativa de la autoridad regulatoria para eximir de la obligación de tener que presentar estudios in vivo para el establecimiento de Equivalencia Terapéutica, la cuál puede demostrarse mediante estudios in vitro (Res. Ex. Nº 727, 2005). Por lo tanto, se puede entender que una Bioexención es el reemplazo o exención de los estudios de Bioequivalencia in vivo por una prueba in vitro. Para formas farmacéuticas sólidas orales, la evidencia de Bioequivalencia se determina basándose en una comparación del perfil de disolución in vitro entre el producto en estudio y el producto de referencia (USP, 2009). Una de las mayores ventajas del procedimiento de Bioexención es la simplificación y reducción del tiempo requerido para la aprobación del producto, reduciendo así los costos de llevar un producto Bioequivalente al mercado. El desarrollo de un estudio in vitro de Bioexención de un estudio de Bioequivalencia in vivo para FFSO-LI se basa en el SCB, que entrega una clasificación de los principios activos en base a su solubilidad y permeabilidad (WHO, 2006).

32 Sistema de Clasificación Biofarmacéutico El Sistema de Clasificación Biofarmacéutico (SCB) es un marco científico utilizado para clasificar los principios activos basándose en su solubilidad acuosa y permeabilidad intestinal. Cuando se combina con la cinética de liberación-disolución del producto farmacéutico, el SCB considera tres factores principales que gobiernan la velocidad y cuantía de la absorción a partir de formas farmacéuticas de liberación inmediata: disolución, solubilidad y permeabilidad intestinal (WHO, 2006). De acuerdo al SCB, los principios activos se clasifican de la siguiente manera: Fig. 1. Sistema de Clasificación Biofarmacéutico (SCB) Clase Solubilidad Permeabilidad (USP, 2009). 1 Alta Alta 2 Baja Alta 3 Alta Baja 4 Baja Baja Esta clasificación puede ser usada para el marco de las especificaciones de la disolución in vitro y puede también proveer un base para predecir la probabilidad de obtener una correlación in vivo in vitro (IVIVC) satisfactoria (FDA, 1997). Diferentes a las FFSO-LI son los productos de liberación controlada o modificada ya que son diseñados para proporcionar perfiles de liberación distintos, generalmente más allá de las 12 horas, por lo que no pueden ser caracterizados por una prueba de disolución de un solo punto. Por esta razón, es más fácil desarrollar una IVIVC para un producto de liberación controlada que para una FFSO-LI (Murthy, 2007).

33 33 El uso del SCB se ha convertido en un medio para documentar la Bioequivalencia sin efectuar un estudio in vivo (USP, 2009). Para clasificar un producto farmacéutico acorde al SCB, la solubilidad, dosis y permeabilidad del fármaco deben ser conocidas (Lindenberg et al, 2004). Para alta solubilidad, alta permeabilidad y para una administración oral del producto farmacéutico, la documentación de Bioequivalencia usando una aproximación in vitro es apropiada basada en el SCB (FDA, 2003). De acuerdo a la Norma de Equivalencia Terapéutica vigente en Chile, el principio activo de un producto farmacéutico para el cual se solicita una exención de un estudio de Biodisponibilidad in vivo, basándose en el SCB deberá ser altamente soluble y altamente permeable (Clase 1). Eventualmente se podrá aceptar bioexenciones para medicamentos elaborados con fármacos Clase 2 y 3, en cuyo caso se tomarán las consideraciones caso a caso que sean pertinentes (ISP, 2007). En resumen, la Bioexención puede ser asumida si el producto de referencia y el de estudio son altamente solubles, altamente permeables y de rápida o muy rápida liberación-disolución. Además, se debe tener en cuenta algunas consideraciones adicionales, como los excipientes utilizados y la ventana terapéutica del fármaco (Volpe, 2008). Hay que tener en cuenta que los excipientes utilizados en el producto en estudio, no deben afectar la velocidad y magnitud de la absorción, por lo que la cantidad de excipientes en la FFSO-LI deberá corresponder a la función prevista. Por otro lado, los fármacos que tienen un estrecho margen terapéutico no aplican para una solicitud de Bioexención (ISP, 2007).

34 Caracterización de Solubilidad El establecimiento de la Clase a la que pertenece un principio activo en relación a su solubilidad considera la mayor concentración posológica del producto de liberación inmediata objeto de una solicitud de Bioexención (ISP, 2007). Por lo tanto, un principio activo se considera altamente soluble cuando la mayor dosis recomendada o la dosis más alta disponible en el mercado, como una forma farmacéutica sólida oral, es soluble en 250 ml o menos, en un medio acuoso con valores de ph comprendidos entre 1,2 6,8 (WHO, 2006). La FDA también ha desarrollado criterios para la evaluación de la solubilidad, por lo que señala que un principio activo es altamente soluble cuando la dosis más alta es soluble en 250 ml o menos, en un medio acuoso con valores de ph comprendidos entre 1-7,5 (FDA, 2000). La reducción de ph 7,5 (criterio FDA) a ph 6,8 refleja la necesidad de disolver el principio activo antes de llegar a la mitad del yeyuno, garantizando de esta forma una reserva suficiente para la absorción en el tracto gastrointestinal (WHO, 2005). Un tema relevante del estado sólido de los fármacos es que pueden existir en varias formas cristalinas denominadas polimorfos y pseudopolimorfos que pueden presentar diferencias en sus propiedades biofarmacéuticas. El polimorfismo se define como las diferentes estructuras cristalinas que una misma molécula puede presentar y el pseudopolimorfismo son las formas cristalinas de una molécula que presentan en su estructura cristalina otro tipo de moléculas, como hidratos y solvatos. Las formas polimórficas de un principio activo pueden tener diferentes propiedades físicas y

35 35 químicas, incluyendo el punto de fusión, la reactividad química, solubilidad aparente, rango de disolución, presión de vapor y densidad (FDA, 2007). La solubilidad es una de las propiedades más importantes que distingue a un polimorfo de otro ya que uno puede ser tan soluble que termine siendo tóxico a una dosis determinada, o tan insoluble que no produzca el efecto terapéutico esperado. Además, la solubilidad se puede modificar con el hábito cristalino o morfología de las partículas y con el tamaño de partículas del polimorfo, por lo que son características que se deben establecer y controlar en la formulaciones farmacéuticas que contengan principios activos en estado sólido (ISP, 2007) Caracterización de Permeabilidad La clasificación de los principios activos en base a las características de permeabilidad se basa directamente en la medida de absorción de un principio activo en el hombre o indirectamente en mediciones de la velocidad de transferencia de masa a través de la membrana intestinal humana (Yu et al, 2002). Como alternativa, se puede utilizar sistemas no humanos capaces de predecir la medida de absorción en el hombre. Ante la ausencia de evidencia que sugiera inestabilidad en el sistema gastrointestinal, se considera que el principio activo es altamente permeable cuando se establece que la fracción absorbida de la dosis administrada en seres humanos es del 90% o más, basándose en una determinación de balance de masa o en la comparación con una dosis de referencia intravenosa (FDA, 2000). Sucesivas discusiones y publicaciones científicas han sugerido reducir el criterio a un 85% de fracción absorbida en seres humanos, para clasificar un principio activo como altamente permeable (WHO,

36 ). Sin embargo, la Guía Técnica GBIOF 02 considera el criterio propuesto por la FDA al momento de evaluar permeabilidad Cinética de liberación disolución Las formas farmacéuticas sólidas orales se clasifican por su liberación disolución rápida o lenta. Dentro de este marco, cuando cumplen ciertos criterios, se puede usar el SCB como una herramienta de desarrollo del medicamento con el propósito de ayudar a la industria farmacéutica a justificar las solicitudes de Bioexención (ISP, 2007). Se considera que una FFSO-LI es de muy rápida liberación-disolución, cuando no menos del 85% de la dosis del principio activo se disuelve a los 15 minutos, empleando el aparato de paleta (aparato II USP) a 75 rpm o el aparato de canastillo (aparato I USP) a 100 rpm, en un volumen de 900 ml o menos, en cada uno de los siguientes medios (WHO, 2005): 1. Una solución de ph 1,2: HCl 0,1 N o Fluido Gástrico Simulado USP sin enzimas; 2. Una solución amortiguadora de ph 4,5: Buffer Acetato y, 3. Una solución amortiguadora a ph 6,8: Buffer Fosfato o Fluido Intestinal Simulado USP sin enzimas. Se considera que una FFSO-LI es de rápida liberación disolución, cuando no menos del 85% de la dosis del principio activo se disuelve dentro de 30 minutos, empleando el Aparato I de la USP a 100 rpm o el Aparato II de la USP a 75 rpm en un volumen de 900 ml o menos, en cada uno de los siguientes medios (WHO, 2005): 1. Medio ácido, tal como HCl 0,1 N o Fluido Gástrico Simulado USP sin enzimas; 2. Buffer ph 4,5 y,

37 37 3. Buffer ph 6,8 o Fluido Intestinal Simulado USP sin enzimas. Cabe destacar, que la FDA propone los mismos criterios establecidos por la WHO para evaluar la rápida o lenta liberación-disolución de las FFSO-LI. Sin embargo, la FDA propone que el criterio de velocidad para el Aparato II de la USP sea de 50 rpm, a diferencia de las 75 rpm propuestas por la WHO. Para respaldar una solicitud de Bioexención, se deberá evaluar un mínimo de 12 unidades posológicas de un producto farmacéutico de tres lotes diferentes. Se deberá recolectar las muestras en un número suficiente de intervalos para caracterizar completamente el perfil liberación disolución del producto farmacéutico. Cuando se comparen los productos en estudio y el de referencia se debe utilizar el factor de similitud denominado f2, que es una manera sencilla de comparar los perfiles de disolución. El factor de similitud corresponde a la transformación logarítmica de la raíz cuadrada recíproca de la suma del error cuadrado y es una medición de la similitud en el porcentaje de disolución entre las dos curvas (ISP, 2007). Fig. 2. Fórmula para obtener el factor de similitud (f2) (WHO, 2005). Donde: n = número de puntos. Rt = porcentaje (%) disuelto promedio del producto de referencia a cada tiempo de muestreo t.

38 38 Tt = porcentaje (%) disuelto promedio del producto en estudio a cada tiempo de muestreo t. Los dos perfiles se consideran similares cuando el valor de f2 es > 50. Un valor de f2 de 50 o mayor refleja la equivalencia de las dos curvas y por lo tanto, la Bioequivalencia entre los productos. Para permitir el uso de datos promedio, el coeficiente de variación no deberá ser más del 20% en los puntos temporales más tempranos del perfil de liberación-disolución (por ejemplo, 10 minutos), y no más del 10% en los demás puntos temporales del perfil (ISP, 2007). Es importante destacar que si el producto de referencia y el de estudio se disuelven en un 85 % o más de la cantidad declarada a los 15 minutos o menos, (utilizando los tres medios de disolución descritos) no es necesaria la comparación con una prueba f2 (WHO, 2006). Como se mencionó anteriormente, los aparatos de disolución utilizados en el estudio de liberación-disolución son los propuestos por la USP XXXII (aparato 1 y 2) que están constituidos por un módulo agitador (motor) al cual se conecta al aparato que gira. Este módulo permite trabajar con distintas velocidades de agitación expresadas en rpm. También presenta un módulo calefactor que permite mantener la temperatura del baño de agua donde se sumergen los vasos con el medio de disolución a 37ºC ± 0.5. Además, estos aparatos tienen Vasos, Canastillos o Paletas dependiendo del equipo (el aparato 1 es de canastillos y el aparato 2 es de paletas). El clásico test de disolución in vitro que aparece en Farmacopeas, se ha utilizado para evaluar la calidad lote a lote de un producto farmacéutico, para guiar el desarrollo de nuevas formulaciones y para asegurar la calidad y el rendimiento continuo del producto después de ciertas modificaciones, tales como cambios en la formulación,

39 39 cambios en el proceso de fabricación, cambios en el sitio de fabricación y aumento de escala del proceso de fabricación (Amidon et al, 1995). No se debe confundir esta prueba con los estudios cinéticos de liberación-disolución de los principios activos desde las formas farmacéuticas, cuya finalidad, en casos muy específicos, es establecer la condición de Equivalentes Terapéuticos entre un producto en estudio y uno de referencia, sin tener que realizar estudios de Bioequivalencia in vivo. Es decir, para optar a una Bioexención. Para asegurar el correcto uso de los aparatos de disolución se debe tener presente algunas variables que son mencionadas a continuación. 1. Equipo de Disolución 1.1. Geometría del Sistema La USP especifica que el eje del elemento de rotación (de canastillo o paleta) debe coincidir en todos los puntos con el eje central del vaso de disolución dentro de ± 2 mm. Esta especificación define el alineamiento, el centrado y la excentricidad de los ejes Alineamiento de Ejes Esta variable parece ser la influencia externa más importante en ambos métodos (paleta y canastillo). La medición y ajuste de esta variable se hace una vez que el baño y la base del equipo han sido razonablemente nivelados mediante el uso de un nivel de burbuja. Para chequear y ajustar el alineamiento se recomienda el uso de una escuadra y la tapa de un vaso de disolución como base de la escuadra, o la utilización de algún

40 40 sistema digital para la medición. El procedimiento se debe realizar en dos planos ubicados a 90 para asegurar la perpendicularidad en esos dos planos. Se recomienda chequear esta variable cada vez que se mueve el equipo y, como buenas prácticas de laboratorio, cada tres a seis meses. Fig. 3. Medición del alineamiento de los ejes Centrado de los Ejes (Dissolution Toolkit, 2010). Las variaciones en el diámetro externo de los vasos de disolución hacen necesario ubicarlos individualmente con respecto al centro de rotación, a fin de cumplir la especificación ± 2 mm del centro. Varios equipos de disolución han adoptado un sistema de tres argollas que ajustan el vaso con su centrado exacto respecto al eje de rotación. Es recomendable numerar y marcar los vasos para luego usarlos en la misma ubicación en el aparato. Este ajuste debe formar parte del procedimiento rutinario en un buen análisis de disolución.

41 Excentricidad de los ejes La USP especifica que el eje de agitación debe rotar sin excentricidad significativa. El término significativo pone en el experimentador la responsabilidad de demostrar que la excentricidad no influye en el test Vibración en el Sistema La vibración puede cambiar el flujo laminar del líquido e introducir energía no deseada al sistema dinámico. Ambos efectos pueden provocar resultados erráticos entre uno y otro análisis o entre vasos de disolución, aumentando la velocidad de disolución y el coeficiente de variación. Ningún sistema está libre de vibración, pero ideal es reducir la vibración a un nivel mínimo manejable. La USP establece que ninguna parte del sistema, incluyendo el contorno en el cual está montado, debe contribuir significativamente a la vibración que no sea la emitida por la suave rotación del elemento agitador. Un sistema satisfactorio de aislar el baño María del mesón de laboratorio ha sido montando el baño en una plancha de poliuretano. Cualquier elemento del laboratorio que pueda contribuir a la vibración, como unidades de aire acondicionado, centrífugas, bombas, etc., debe ser monitoreado y controlado Velocidad de agitación La velocidad de agitación, generalmente de 50 a 150 rpm, es la variable que determina cuán rápido una forma farmacéutica se desintegra y/o disuelve en un volumen especificado de medio de disolución. La USP requiere que la velocidad de agitación se mantenga en ± 4% de lo especificado. La velocidad de agitación es

42 42 fácilmente controlada y monitoreada. Modernos controles de velocidad permiten una lectura constante y digital de las rpm. Se ha observado que después de iniciar su funcionamiento, los equipos tienden a aumentar la velocidad de agitación, por lo cual es esencial estabilizar la lectura digital de las rpm por un período preliminar antes de comenzar el análisis. Es conveniente chequear si la lectura digital corresponde a la velocidad real que está dando el equipo. Para ello basta colocar un papel engomado en el extremo del eje y contar cuántas veces da la vuelta completa en un tiempo determinado cronometrado Control de temperatura El efecto de las variaciones de temperatura en los resultados de disolución dependerá de las curvas de temperatura, solubilidad del fármaco y excipientes de la forma farmacéutica. La USP especifica 37 C ± 0,5 C como temperatura de trabajo, durante la prueba de disolución. El control de esta variable es relativamente simple: Equilibrar la temperatura a 37 C antes de comenzar el análisis. Monitorear la temperatura (por lo menos cada una hora). Chequear la temperatura al final del análisis. Es fundamental para este control usar termómetros adecuados y calibrados.

43 Posición vertical de paleta o canastillo La USP especifica que la distancia entre el fondo interno del vaso y el fondo de la canasta o paleta se debe mantener en 25 mm ± 2 mm. Ya que la profundidad del vaso puede variar, cada paleta o canastillo debe ser ajustado individualmente a la distancia especificada. Existen calibradores de altura que permiten hacer este ajuste en forma simple. Se pueden marcar los ejes o usar collares ajustables para establecer la posición requerida, de manera que ésta pueda ser repetida en forma rápida y segura Posición y método de muestreo La posición de muestreo puede influir en mayor o menor grado en los resultados de disolución dependiendo del tamaño de las partículas en que se desintegra el producto y de la diferencia en la gravedad específica entre las partículas y el medio de disolución. La USP establece que la muestra debe ser extraída desde una zona media entre la superficie del medio de disolución y la parte superior del canastillo o paleta y a no menos de 1 cm de la pared del vaso. La especificación USP presenta el inconveniente de que es difícil de cumplirla cuando se usan 500 ml de medio de disolución y, además, permite hacer un muestreo desde puntos muy cercanos al canastillo. El muestreo automático tiene la ventaja sobre el muestreo manual de que la posición de muestreo es siempre reproducible y para efectos de filtración la cantidad de pérdida disminuye. Es preciso reducir lo más posible el tiempo en que el sistema de muestreo está en el vaso de disolución, ya que la presencia del dispositivo puede producir cambios en el flujo hidrodinámico.

44 Cuidados y manipulación de paletas y canastillos Los canastillos y paletas deben ser constantemente inspeccionados, manipulados como instrumentos delicados y almacenados adecuadamente. Se recomienda descartar los canastillos que se observen torcidos o con otros defectos que no se puedan corregir por simple manipulación. La cubierta de polifluorocarbono de las paletas se puede dañar y picar si éstas se dejan caer o se tiran unas contra otras Formas farmacéuticas que flotan Uno de los problemas del método de la paleta es que algunas formas farmacéuticas como las cápsulas tienden a flotar en el medio de disolución a causa de su baja gravedad específica. La USP permite el uso de una pequeña hélice de material no reactivo para mantener la forma farmacéutica en el fondo del vaso. Conjuntamente, la USP establece que el equipo de disolución se debe calibrar con comprimidos de acuerdo a las condiciones de operación especificadas. Para ello existen comprimidos calibradores, uno del tipo desintegrable (Prednisona comprimidos 50 mg con excipiente lactosa) y otro del tipo no desintegrable (Ácido Salicílico comprimidos 300 mg). Antes de proceder a calibrar, se deben chequear y ajustar cuidadosamente todas las variables características del sistema. El equipo se debe calibrar cada vez que se cambia de ubicación o cuando se le hace algún cambio significativo. Es una buena práctica de laboratorio calibrarlo por lo menos cuatro veces al año como rutina básica para prevenir cualquier desalineamiento debido al uso o a la pérdida de las condiciones que requieren estar bajo control.

45 Buenas Prácticas de Manufactura y Control de Calidad La WHO define las GMP como el área de garantía de la calidad que asegura que los productos se fabriquen en forma uniforme y controlada, de acuerdo con las normas de calidad adecuadas al uso que se pretende dar a los productos, y conforme a las condiciones exigidas para su comercialización (WHO, 1998). Las GMP abarcan todos los aspectos del proceso de fabricación locales, almacenamiento y transporte adecuados; personal calificado y capacitado para la producción y el control de la calidad; laboratorios apropiados; procedimientos e instrucciones escritas aprobados; registros donde consten todas las etapas de los procedimientos definidos y adoptados; posibilidad de seguir un producto en todas sus etapas mediante registros de procesado de lotes y registros de distribución; y sistemas para el retiro de un producto y la investigación de quejas (WHO, 1998). El principio rector de las GMP es que la calidad forma parte integral de la elaboración del producto, y no es algo que meramente se somete a prueba en el producto. Por consiguiente, con esto se asegura que el producto no sólo cumple con las especificaciones finales, sino que se ha hecho con los mismos procedimientos y en las mismas condiciones cada vez que se elabora. La validación es la parte de las GMP por la cual se logra que los sistemas, los equipos, los procesos y los procedimientos para los ensayos del establecimiento estén bajo control y, por consiguiente, se produzca uniformemente un producto de calidad (WHO, 1998). El control de la calidad es una parte de las GMP que se refiere al muestreo, a los procedimientos de organización, documentación y autorización que asegura que los ensayos de materias primas, materiales de envasado, productos intermedios, a granel y

46 46 acabados, realmente se efectúen, para que no se permita la circulación de los materiales, ni se autorice la venta o suministro de los productos, hasta que su calidad haya sido aprobada como satisfactoria. No se limita a las operaciones de laboratorio, sino que debe estar presente en todas las decisiones concernientes a la calidad del producto (WHO, 1992). A través de las normas GMP, se asegura que cada unidad de producto fabricado, tenga la misma calidad que la unidad analizada por el Departamento de Control de Calidad; éste debe ser también independiente de otros departamentos y estar bajo la autoridad de una persona calificada y experimentada. Debe contar con recursos suficientes para asegurar que los procedimientos de control de la calidad puedan efectuarse con eficacia y confiabilidad. Para esto se debe contar con requisitos básicos del control de la calidad. Se debe contar con instalaciones adecuadas, personal capacitado y procedimientos aprobados, a fin de llevar a cabo el muestreo, la inspección y el ensayo desde las materias primas hasta el producto acabado. Deben obtenerse muestras de materias primas, materiales de envasado, y productos intermedios, a través de métodos y de personal aprobados por el departamento de control de la calidad. Los métodos de ensayo deben ser validados. Deben mantenerse registros que sirvan para demostrar que se han llevado a cabo todos los procedimientos de muestreo, inspección y ensayo, y que cualquier desviación ha sido plenamente registrada e investigada. Los productos terminados deben contener ingredientes que se adecuen a la composición cualitativa y cuantitativa del producto. No se debe autorizar la venta o suministro de ningún lote de productos antes de su certificación por el personal autorizado. Finalmente, debe retenerse un número suficiente de materia prima y

47 47 productos para posibilitar un examen del producto en el futuro, si fuese necesario (WHO, 1992) Validación El objetivo de la validación de una metodología analítica es demostrar que dicho procedimiento es adecuado para los fines previstos (ICH, 2005). La validación por lo tanto es, un procedimiento claramente diseñado para establecer en forma documentada que un sistema, un equipo, un proceso de producción o una metodología analítica de control de un producto cumplen con los parámetros de calidad especificados (WHO, 1998). El hecho de contar con los procesos validados no sólo significa para una industria farmacéutica tener productos de calidad que le permitan garantizar su efectividad para entrar y mantenerse en el exigente mercado farmacéutico, sino también significa un valioso ahorro en tiempo y dinero, ya que se minimizan los riesgos de perder lotes de producción por errores generados durante el transcurso de la fabricación (WHO 1998). Una vez desarrollado un método de análisis por HPLC, al igual que toda técnica analítica, deberá validarse, es decir, se debe confirmar y documentar que los resultados por él producidos son confiables. Diferencias entre distintas formas farmacéuticas, tipo y calidad de las materias primas empleadas por cada fabricante, hacen validar la metodología de cada producto en particular (Quattrocchi et al, 1992). Los parámetros fundamentales para la validación son exactitud, precisión, selectividad, sensibilidad, reproducibilidad y estabilidad (FDA, 2001).

48 48 4. PROBLEMÁTICA A ABORDAR Lograr demostrar a través de un trabajo in vitro para Bioexención de un estudio de Bioequivalencia, la Equivalencia Terapéutica entre dos formulaciones comprimidos que contienen Ciclobenzaprina Clorhidrato 10 mg. 5. OBJETIVO GENERAL Al realizar el trabajo in vitro para Bioexención de un estudio de Bioequivalencia, se busca el siguiente objetivo general: Llevar a cabo un trabajo in vitro para Bioexención de un estudio de Bioequivalencia para establecer Equivalencia Terapéutica entre dos formulaciones comprimidos que contienen Ciclobenzaprina Clorhidrato 10 mg. 6. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Al realizar el trabajo in vitro para Bioexención de un estudio de Bioequivalencia, se desea lograr los siguientes objetivos específicos: Llevar a cabo la Validación de una metodología analítica que será utilizada en el estudio, para establecer Equivalencia Terapéutica entre dos formulaciones comprimidos que contienen Ciclobenzaprina Clorhidrato 10 mg. Dominar el correcto manejo del equipo HPLC y de otros equipos o materiales empleados durante el estudio en cuestión. Recopilar antecedentes bibliográficos que permitan obtener información sobre los productos que estarán sometidos al estudio, con la finalidad de demostrar Equivalencia Terapéutica.

49 49 Determinar la solubilidad del principio activo bajo condiciones de ph fisiológicas simuladas, basándose en el SCB. Determinar la permeabilidad de un principio activo por medio de una búsqueda bibliográfica. Determinar las características de liberación-disolución in vitro de los dos productos farmacéuticos en cuestión.

50 50 7. MATERIALES 7.1. Materiales y equipos Algunos de los reactivos, materiales y equipos que se utilizaron durante el estudio, son mencionados a continuación: Material de vidrio Clase A. Soluciones y reactivos. Proveedor Merck S.A. Estándar secundario, Ciclobenzaprina Clorhidrato. Cromatógrafo Líquido de Alta Performance (HPLC), con detector de longitud de onda variable, Agilent Serie Aparato de Disolución Vision Elite, asociado a Controlador Automático Auto Plus Maximer Virtual Instrument, Hanson Research. Posee un mostrador automático Auto Plus Multifill, Hanson Research. Aparato de Disolución SR8 Plus, Hanson Research. Balanza Analítica Sartorius, Modelo CP224S. ph Metro Fisher Hanna Hi123 Nº Serie , con electrodo. Sonicador Power Sonic Luc 410 Lab Tech. Desaireador Media Mate Plus. Hanson Research. Baño Termocirculador Lab. Tech. Modelo LCB R13. Software Chembiodraw Ultra 11.0.

51 51 8. METODOLOGÍA El estudio de Equivalencia Terapéutica de FFSO-LI se basó en las recomendaciones entregadas por el Instituto de Salud Pública (ISP) a través de la Guía Técnica G-BIOF 02 denominada Bioexención de los estudios de Biodisponibilidad/Bioequivalencia para establecer Equivalencia Terapéutica de Formas Farmacéuticas Sólidas Orales. Esta guía entrega información para las solicitudes de exención de los estudios de Bioequivalencia in vivo para FFSO- LI en base al SCB y para formulaciones sólidas orales proporcionalmente similares a otro producto, cuya Equivalencia Terapéutica haya sido demostrada mediante un estudio in vivo. También, se consultó la literatura desarrollada por organizaciones que estén innovando en lo que respecta a los avances científicos y normativos-reguladores de los estudios de Equivalencia Terapéutica, como la Organización Mundial de la Salud (WHO), Federación Farmacéutica Internacional (FIP), Administración Federal de Alimentos y Drogas de los Estados Unidos (FDA), Agencia Europea de Medicamentos (EMEA) u otras de igual connotación. La metodología para la clasificación de los principios activos en base a su permeabilidad, solubilidad y las características cinéticas de liberación-disolución fueron obtenidas de la Guía G-BIOF-02 denominada anteriormente Revisión Bibliográfica La recopilación de información científica relevante es un paso clave para obtener las herramientas y conocimientos necesarios para la realización de un ensayo analítico.

52 52 Es por esto, que a continuación se detallan algunas propiedades y características del principio activo en cuestión Descripción del principio activo A continuación, se presenta la descripción del principio activo, obtenida de la base de datos conocida como DrugBank. a) Nombre del principio activo: Ciclobenzaprina (como Ciclobenzaprina Clorhidrato). b) Nombre químico: 3-(5H-dibenzo [a,d] ciclohepten-5-ilidene)-n, N-dimetil -1- propanamina. c) Estructura: Fig. 4. Estructura Ciclobenzaprina Clorhidrato. HCl N La forma molecular de Ciclobenzaprina Clorhidrato es C 20 H 21 N x HCl, y su peso molecular es de 311,9 g/mol. d) Acción terapéutica: Relajante muscular. e) Propiedades: Ciclobenzaprina suprime el espasmo del músculo esquelético de origen local sin interferir con la función y fuerza muscular. Se ha demostrado que la acción sobre la formación reticular reduce el tono motor influyendo sobre el sistema motor gamma y alfa.

53 53 f) Indicaciones: Cervicobraquialgias, lumbalgias, tortícolis, fibrositis, periartritis escapulohumeral, espasmos musculares asociados con dolor agudo de etiología musculoesquelética. g) Dosificación: La dosis habitual es de 10 mg dos o tres veces al día, distribuidos a intervalos regulares. Según criterio médico puede administrarse 40 mg por día; no se recomienda exceder los 60 mg. h) Reacciones adversas: Ciclobenzaprina en las dosis recomendadas es muy bien tolerada. En forma ocasional pueden presentarse mareos, sequedad bucal y somnolencia. i) Precauciones y advertencias: Ciclobenzaprina sólo debe emplearse durante periodos no mayores a dos o tres semanas. Debe administrarse con precaución en pacientes medicados con fármacos anticolinérgicos, personas que operan maquinarias o conducen vehículos. Dado que se carece de experiencia no se recomienda administrarla a los niños. j) Interacciones: No administrar en forma simultánea con antidepresivos tricíclicos, inhibidores de la monoaminooxidasa. Puede potenciar los efectos del alcohol, barbitúricos u otros fármacos depresores del sistema nervioso central. k) Contraindicaciones: Hipersensibilidad a la Ciclobenzaprina y glaucoma. Retención urinaria. Uso simultáneo con inhibidores de la MAO. Fase aguda postinfarto de miocardio. Pacientes con arritmias cardiacas, bloqueo o alteraciones de la conducción, insuficiencia cardiaca congestiva. Hipertiroidismo.

54 Propiedades Fisicoquímicas a) Solubilidad: Libremente soluble en agua y alcohol, moderada solubilidad en isopropanolol, ligeramente soluble en cloroformo y cloruro de metileno, prácticamente insoluble en hidrocarbonos. b) pka: El pka de Ciclobenzaprina es cercano a 8,47. c) Peso molecular: El peso molecular de Ciclobenzaprina Clorhidrato es de 311,9 g/mol. d) Aspecto: cristales blancos. e) Punto de fusión: 215 C y 219 C Validación de la metodología analítica La validación de la metodología analítica se basó en los parámetros recomendados por el ISP a través de la Guía Técnica G-BIOF 02 denominada Bioexención de los estudios de Biodisponibilidad/Bioequivalencia para establecer Equivalencia Terapéutica de Formas Farmacéuticas Sólidas Orales. Los parámetros evaluados en la Validación fueron linealidad, exactitud, precisión, robustez, selectividad, influencia del filtro, estabilidad y precisión intermedia Desarrollo analítico Los medios de disolución utilizados en la caracterización de solubilidad y en la cinética de liberación-disolución fueron los siguientes:

55 55 Solución HCl 0,1N, ph 1,2: Preparación: medir 8,5 ml de Ácido Clorhídrico (HCL) concentrado (37%) y diluir con agua destilada hasta completar 1 L. (Este medio será utilizado en las pruebas de solubilidad y liberación-disolución). Solución amortiguadora de Ftalato, ph 3,0: Preparación: tomar 250 ml de la solución de ftalato de potasio 0,2 M, con 22,3 ml de HCl 0,2 M y diluir con agua destilada hasta completar 1 L. (Este medio será utilizado solo en la prueba solubilidad). Solución amortiguadora de Acetato, ph 4,5: Preparación: pesar 2,99 g de Acetato de Sodio NaC 2 H 3 O 2 3H 2 O; medir 14 ml de Ácido Acético 2 N, y diluir con agua destilada hasta completar 1 L. (Este medio será utilizado en las pruebas de solubilidad y liberación-disolución). Solución amortiguadora de fosfato, ph 6,8 Preparación: medir 250 ml de la solución de fosfato monobásico de potasio 0,2 M en un matraz volumétrico de 1000 ml. Agregar 112 ml de la solución de hidróxido de sodio 0,2 M. (Este medio será utilizado en las pruebas de solubilidad y liberacióndisolución). En las pruebas de cinética liberación-disolución los medios fueron precalentados, desaireados y filtrados a través del Desaireador Media Mate Plus. Cada vez que fue necesario determinar la concentración de las muestras analizadas por el HPLC, se

56 56 procedió a la calibración a partir de la concentración del estándar, que fue determinada a través de la siguiente fórmula: Cálculos: [St] = PSt * PotSt * Dilución [St]: PSt: Concentración del estándar (mg/ml o mg/cp según corresponda). Peso del estándar (mg). PotSt: Potencia del estándar (%). Dilución: Volumen utilizado (ml). A continuación, se procederá a detallar cuales fueron los parámetros analizados en la validación de la metodología analítica necesaria para llevar a cabo el estudio de Bioexención. a) Selectividad o Especificidad Este parámetro se refiere a la propiedad del método de producir una señal medible debida a la sola presencia del analito, libre de interferencia de otros componentes en la matriz de la muestra. Estos componentes pueden ser excipientes de un fármaco, productos de degradación, metabolitos del mismo analito en un fluido biológico, etc. (Quattrocchi et al, 1992). En este parámetro se analizaron soluciones que contenían sólo el medio de disolución (blanco) y soluciones que contenían los componentes de la matriz (medio que contiene todos los componentes de la forma farmacéutica, menos el principio activo a validar), determinándose la contribución de ambos al cromatograma, a través del

57 57 cálculo de ruido. Por lo tanto, por cada medio de disolución se realizó una prueba de selectividad para el blanco y la matriz, en la que se preparó: 1 blanco, que se inyectó al cromatógrafo durante aproximadamente 10 minutos. 10 matrices, que se inyectaron al cromatógrafo durante aproximadamente 10 minutos. Este ensayo no se realizó para el Buffer Ftalato ph 3,0 debido a que este medio no será utilizado en el estudio de liberación disolución. Criterio de aceptación: La determinación de la contribución de la señal de ruido debe ser menor al 2%. b) Linealidad Es la capacidad de un método analítico de asegurar que los resultados obtenidos son directamente proporcionales a la concentración del analito en la muestra (WHO, 2006). En este parámetro se prepararon y midieron para cada medio: Cinco soluciones, que contengan aproximadamente 10%, 30%, 60%, 90% y 120% de la concentración estándar de Ciclobenzaprina Clorhidrato, que se inyectaron por quintuplicado en el cromatógrafo. Criterio de aceptación: El coeficiente de correlación no deberá ser menor a 0,98, el intercepto en y no debe ser diferente de cero, empleando un intervalo de confianza del 95%, y el coeficiente de variación del factor de respuesta no debe ser mayor a 2%.

58 58 c) Exactitud y Precisión La exactitud de un método, corresponde a la diferencia entre el valor obtenido (media) y el valor verdadero (Quattrocchi et el, 1992), y la precisión del método expresa la cercanía entre una serie de múltiples muestreos de una misma muestra homogénea, bajo condiciones establecidas (ICH, 2005). En estos parámetros se prepararon y midieron para cada medio: muestras que contenían cantidades equivalentes 30%, 60% y 120% de la concentración teórica del estándar Ciclobenzaprina Clorhidrato. Cada una de las muestras debe contener la matriz del producto (para medio Buffer Ftalato ph 3,0 no se agrega matriz ya que este medio no será utilizado en la prueba de liberación-disolución). Para cada uno de los niveles se prepararon tres muestras por separado y se inyectaron por duplicado en el HPLC. Criterio de aceptación: El porcentaje promedio de recuperación debe ubicarse entre 95% y 105%, y el RSD debe ser menor o igual a 2%. d) Precisión Intermedia La precisión intermedia se realizó con la finalidad de observar si la metodología analítica era reproducible al momento de cambiar al analista, demostrando de esta forma la reproducibilidad del método. Esta prueba se efectuó en dos medios distintos (Buffer Acetato ph 4,5 y Buffer Fosfato ph 6,8). Dos analistas diferentes realizan dos estudios cinéticos de disolución (n=6) por duplicado, repetidos para dos lotes. Se comparan los resultados promedios y los coeficientes de variación (%).

59 59 Criterios de aceptación: La diferencia en los valores promedio, no debe exceder un 10% en aquellos tiempos en los que se ha disuelto un porcentaje menor o igual al 85% y un 5% en los que se ha disuelto más del 85% del fármaco en estudio. e) Estabilidad La finalidad que tiene la prueba de estabilidad es demostrar que las muestras y estándares de Ciclobenzaprina Clorhidrato no sufren algún tipo de degradación o alteración, ya sea a temperatura ambiente o de refrigeración, que afecte su concentración al ser analizados al HPLC. Para este parámetro se prepararon y midieron para cada medio: dos soluciones estándares y dos muestras, realizando dos lecturas de cada estándar y de las muestras. Se almacenaron las fracciones sobrantes o no utilizadas de estándares y muestras, a temperatura ambiente y en el refrigerador (aproximadamente a 4ºC), por 24 horas. Transcurrido este periodo de tiempo, se analizaron los estándares y muestras por el HPLC. Finalmente, se comparó el resultado promedio de las soluciones estándares con el valor teórico y los resultados de las muestras con las obtenidas en las lecturas iniciales. Criterio de aceptación: Los estándares son estables si el promedio de las lecturas 24 horas después de la preparación es igual al valor teórico en un 98% a 102%, y las muestras son estables en solución, si el porcentaje de recuperación relativo se encuentra entre 98% y 102% del valor promedio. Esto se aplica tanto a la fracción almacenada a temperatura ambiente, como a la fracción refrigerada.

60 60 f) Robustez La robustez de un método analítico corresponde a los estudios que indican el grado de confiabilidad del ensayo ante cambios de variables comunes. Estos cambios pueden ser ligeras diferencias operativas, de equipos, analistas, laboratorios, fuente de columnas, etc. (Quattrocchi et al, 1992). Para este ensayo fueron evaluados diversos parámetros mediante ocho experimentos, que comparan la influencia de los factores mediante el cambio en estos parámetros, utilizando el método Plackett y Burman, descrito por Quattrocchi et al (1992). A continuación se aplica la siguiente tabla: Fig. 5. Diseño experimental para 7 variables en un estudio de Robustez FACTOR EXP1 EXP2 EXP3 EXP4 EXP5 EXP6 EXP7 EXP8 A/a A A A A a a a a B/b B B b b B B b b C/c C c C c C c C c D/d D D d d d d D D E/e E e E e e E e E F/f F f f F F f f F G/g G g g G g G G g Resultado exp. s t u v w x y z (Quattrocchi et al, 1992). Los parámetros en mayúscula corresponden a la metodología original y los parámetros en minúscula a los cambios realizados para el análisis de robustez. El efecto de cada factor se calcula de la siguiente forma: Valor del efecto A-a=1/4((s+t+u+v)-(w+x+y+z)) = 1 Valor del efecto B-b=1/4((s+t+w+x)-(u+v+y+z)) = 2 Valor del efecto C-c=1/4((s+u+w+y)-(t+v+x+z)) = 3 Valor del efecto D-d=1/4((s+t+y+z)-(u+v+w+x)) = 4

61 61 Valor del efecto E-e=1/4((s+u+x+z)-(t+v+w+y)) = 5 Valor del efecto F-f=1/4((s+v+w+z)-(t+u+x+y)) = 6 Valor del efecto G-g=1/4((s+v+x+y)-(t+u+w+z)) = 7 Considerando los 7 parámetros siguientes, se trabaja con el valor original (mayúsculas) y un valor alternativo (minúsculas): Fig. 6. Parámetros evaluados en la Robustez FACTORES METODOLOGIA ORIGINAL METODOLOGIA MODIFICADA Efecto tiempo preparaciónlectura Concentración componente de la fase móvil A a A/a B b B/b Volumen de inyección C c C/c Concentración de Fase Móvil D d D/d Temperatura E e E/e Longitud de onda F f F/f Flujo G g G/g Los parámetros mostrados en la figura 6, serán los seleccionados para sufrir una modificación, evaluando de esta forma la robustez del método analítico desarrollado. Las letras mayúsculas representa los parámetros de la metodología original y las letras minúsculas representan los parámetros de la metodología modificada. Luego se completa la matriz y se realizan los 8 experimentos según la metodología desarrollada. A continuación se presenta una tabla con los experimentos

62 62 realizados, que considera cada uno de los parámetros evaluados en el ensayo de Robustez. Fig. 7. Experimentos y sus parámetros correspondientes PARAMETRO Exp 1 Exp 2 Exp 3 Exp 4 Exp 5 Exp 6 Exp 7 Exp 8 A-a B-b Efecto tiempo preparación-lectura Concentración componente fase móvil A A A A a a a a B B b b B B b b C-c Volumen de Inyección C c C c C c C c D-d Concentración Fase Móvil D D d d d d D D E-e Temperatura E e E e e E e E F-f Longitud de Onda F f f F F f f F G-g Flujo G g g G g G G g Resultado Exp. s t u v w x y z La figura 7 muestra los 8 experimentos necesarios para demostrar la robustez del método. Cada experimento presenta 4 parámetros modificados, exceptuando el experimento número 1, que contiene los 7 parámetros originales. Concluidos todos los experimentos, se obtiene los efectos de modificar cada parámetro, reemplazando en las ecuaciones anteriormente descritas, los resultados de cada uno de los 8 experimentos. Estos 7 resultados son comparados con la expresión s 2, siendo s el valor de la desviación estándar obtenido en el estudio de precisión del método. Todos los experimentos se deben realizar a partir de una muestra homogénea. Cabe destacar, que por cada uno de los medios analizados se prepararon dos muestras que contenían la matriz del medio más el principio activo (excepto para el Buffer Ftalato ph 3,0) a validar y dos muestras que solo contenían el principio activo. Además, se debieron preparar dos estándares para poder cuantificar los resultados obtenidos.

63 63 Criterio de Aceptación: Comparar el valor del efecto obtenido, con la expresión s 2 donde s es la desviación estándar obtenida en el ensayo de precisión del método. A continuación se presenta una tabla con los criterios de aceptación para el ensayo. Fig. 8. Criterios de aceptación para la Robustez Resultado Menor a s 2 Mayor a s 2 y Delta menor a 3% Delta mayor a 3% Criterio No significativo Significativo Muy significativo g) Influencia del filtro Se realizó una prueba de influencia del filtro adecuada a las concentraciones de trabajo y en todos los medios de disolución. Se determinó el efecto del filtro sobre una solución estándar. Para ello se analizó el estándar filtrado y otro sin pasar por el filtro, para más tarde comparar ambos resultados. Criterio de aceptación: El porcentaje de recuperación relativa debe encontrarse entre 98% y 102% Solubilidad Se deberá determinar el perfil de solubilidad versus el ph del principio activo en estudio, en un medio acuoso a ºC con ph comprendido entre 1,2 6,8. Además, se deberá evaluar un número suficientes de condiciones de ph para definir con precisión el perfil de solubilidad versus ph. Se deberá determinar la concentración del principio activo en los tampones seleccionados y en las condiciones de ph señaladas, utilizando un ensayo validado (ISP, 2007).

64 64 Se deberá establecer la clasificación de solubilidad, calculando el volumen de un medio acuoso suficiente para disolver la mayor potencia de la forma farmacéutica. De esta forma, se clasificará un principio activo como altamente soluble cuando la mayor dosis sea soluble en un volumen de 250 ml o menos, de medio acuoso en toda la gama de ph comprendida entre 1,2 6,8 (WHO, 2006) Desarrollo analítico El método utilizado para la prueba de solubilidad fue de agitación por matraz. Para este ensayo se prepararon diferentes soluciones a un ph determinado (Medio HCl 0,1 N, ph 1,2; Buffer Ftalato ph 3,0; Buffer Acetato ph 4,5 y Buffer Fosfato ph 6,8). El principio activo fue adicionado a 5 ml de cada medio hasta lograr la saturación. Debido a que Ciclobenzaprina Clorhidrato es una molécula dependiente de ph, la solubilidad es distinta en cada uno de los medios (ver figura 49, 50, 51 y 52). Posteriormente, las muestras fueron sonicadas y colocadas en el baño termorregulador por 24 horas a C. Al día siguiente, las muestras fueron diluidas y filtradas para ser analizadas en el HPLC. Para poder cuantificar las muestras obtenidas, se debió preparar un estándar 1 y un estándar 2 de Ciclobenzaprina Clorhidrato. La preparación de los medios se encuentra detallada en el punto Criterio de aceptación: Ciclobenzaprina Clorhidrato debe ser soluble en volúmenes de 250 ml o menos, en los cuatro medios seleccionados.

65 Permeabilidad Existen numerosas técnicas para calcular o determinar la velocidad de paso a través de membranas, que pueden utilizarse para estudiar la absorción oral en seres humanos. El principio activo se considera altamente permeable cuando se establece que la fracción absorbida de la dosis administrada en seres humanos es del 90% o más, basándose en una determinación de balance de masa o en la comparación con una dosis de referencia intravenosa (FDA, 2000). Para respaldar la alta permeabilidad del fármaco, se deberá presentar resultados propios o antecedentes científicos válidos que respalden la alta permeabilidad del principio activo (ISP, 2007). Existen varias técnicas para demostrar la permeabilidad de un principio activo determinado, pero dentro de los más simples tenemos la determinación de la lipofilia a través del cálculo de Log P y clog P a través de programas informáticos, como el Software ChembioDraw Ultra 11.0, que fue utilizado para obtener los valores de Log P y clog P de Ciclobenzaprina Búsqueda Bibliográfica Una de las principales propiedades de una molécula es su coeficiente de partición entre una fase de aceite y otra de agua, conocido como Log P. Este coeficiente mide la lipofilia de la molécula y permite predecir con que facilidad atravesará las membranas (Aulton, 2004). Existen varios métodos para determinar la lipofilia de la molécula, pero hoy en día, en vez de determinar directamente Log P se pueden utilizar métodos informáticos para calcularlo, como el Software ChembioDraw

66 66 Ultra La correlación entre los valores calculados y medidos es razonablemente buena. Log P puede calcularse dividiendo la molécula en fragmentos y calculando la contribución de cada fragmento a la lipofilia global, a menudo conocido como clog P (Aulton, 2004). En la literatura no fueron encontrados antecedentes sobre estudios de balance de masa, o permeabilidad intestinal para este fármaco. Sin embargo, esta sección es respaldada mediante los resultados de clog P y Log P para Ciclobenzaprina entregados por el Software ChembioDraw Ultra 11.0 y comparados con los obtenidos para Metoprolol como fármaco de alta permeabilidad, a través del mismo programa. En las últimas décadas se han utilizado cada vez más las técnicas con cultivos celulares para determinar la absorción de las moléculas; actualmente se aceptan como modelo de la absorción (Aulton, 2004). En la búsqueda de antecedentes científicos, no fueron encontrados estudios de balance de masa o permeabilidad intestinal para Ciclobenzaprina, pero dentro de la literatura se encontró un estudio de permeabilidad de Ciclobenzaprina en células MDCK tipo II, (corresponden a células de riñón de canino) que fue elaborado para estudiar el paso del fármaco a través de la barrera hematoencefálica por Mahar et al (2002). Las células MDCK son utilizadas en estudios de transporte de fármacos en modelos de mucosa intestinal, barrera hematoencefálica y riñón. Teniendo este estudio como antecedente, se procedió a realizar una correlación con otras fuentes científicas válidas, sobre permeabilidad intestinal, que no consideran a Ciclobenzaprina dentro sus estudios, pero sí a otros fármacos que están dentro del estudio de permeabilidad de Ciclobenzaprina en células MDCK tipo II.

67 67 Analizando los resultados de permeabilidad, se observa que aquellos que superan la permeabilidad de Metoprolol, están clasificados como de Alta Permeabilidad, como en otros estudios enfocados a analizar la permeabilidad intestinal. La primera correlación realizada (Fig. 57) fue entre el estudio de permeabilidad en células MDCK tipo II y un estudio realizado por Wu et al (2005), sobre la clasificación según la permeabilidad intestinal de fármacos. Una segunda correlación realizada fue la del estudio de permeabilidad en células MDCK tipo II con otro estudio de permeabilidad jejunal humana (Fig. 58 y 59) realizado por Kasim et al (2004), considerando a Metoprolol como principio activo de alta permeabilidad. Una de las líneas celulares más utilizadas son las Caco-2. Las células Caco-2 son una línea de células del carcinoma de colon humano que fueron propuestas como modelo para la absorción oral de fármacos. En cultivo, estas células se diferencian espontáneamente formando una monocapa de enterocitos polarizados parecidos a los del intestino delgado (Aulton, 2004). Para demostrar que existe una correlación entre la utilización de estas dos líneas celulares, al momento de respaldar los resultados de permeabilidad, se recurrió a la literatura en búsqueda de algún antecedente que respaldara dicha correlación. Así es como Ranaldi et al (1992) presentan un estudio en células Caco-2 y MDCK (Fig. 60, 61 y 62). Criterio de aceptación: A través de la búsqueda de antecedentes científicos válidos, se debe demostrar la alta permeabilidad de Ciclobenzaprina.

68 Liberación Disolución Para la Bioexención de un estudio de Bioequivalencia in vivo, el producto en estudio deberá exhibir características de liberación-disolución in vitro muy rápidas o rápidas (criterios de clasificación fueron mencionados en el punto ), dependiendo de las propiedades SCB del principio activo (ISP, 2007). Los aparatos y procedimientos generales para demostrar la cinética de liberación disolución del principio activo desde su forma farmacéutica deberán estar validados Desarrollo analítico La aprobación de productos similares empleando estudios comparativos de liberación-disolución in vitro, deben basarse en la generación de perfiles cinéticos de disolución realizados en aparatos de disolución. Este estudio se llevó a cabo utilizando los medios HCl 0,1 N, ph 1,2; Buffer Acetato ph 4,5 y Buffer Fosfato ph 6,8 en las condiciones de disolución detalladas a continuación, utilizando los siguientes aparatos de disolución: Fig. 9. Aparatos de disolución utilizados Equipo Marca Modelo Test de disolución Nº2 Hanson Research SR8 Plus Test de disolución Nº3 Hanson Research SR8 Plus Test de disolución Nº5 Hanson Research Vision Elite 8 Los tres aparatos detallados en la tabla fueron los utilizados para la realización del estudio de liberación-disolución. El modelo Vision Elite 8 de Hanson Research

69 69 contiene un muestreador automático a diferencia de los otros dos aparatos de disolución, en los que el muestreo se debe hacer de forma manual. El equipo utilizado en el estudio de liberación-disolución es el aparato número 2 de la USP, tipo paleta. A continuación, se presenta una tabla con las condiciones necesarias para realizar el ensayo de liberación-disolución. Fig. 10. Condiciones para las pruebas de disolución Medio Solución HCl ph 1,2 Buffer Acetato ph 4,5 Buffer Fosfato ph 6,8 Volumen 900 ml 900 ml 900 ml Aparato Nº2 (USP), Paletas Nº2 (USP), Paletas Nº2 (USP), Paletas Velocidad 75 r.p.m 75 r.p.m 75 r.p.m Tiempo de muestreo minutos minutos minutos Temperatura 37ºC ± 0,5ºC 37ºC ± 0,5ºC 37ºC ± 0,5ºC El objetivo de este estudio es establecer una comparación entre las cinéticas de liberación-disolución del producto en estudio y el producto de referencia. Por lo tanto, por cada medio se realizan pruebas de disolución con 12 unidades de cada lote, por 20 minutos totales (muestreando cada 5 minutos), en 900 ml de medio, a 75 r.p.m y a 37 C, utilizando el aparato N 2, tipo paleta. A continuación se presenta una tabla con la descripción de los productos utilizados durante el estudio de liberación-disolución.

70 70 Fig. 11. Descripción de los productos en estudio PRODUCTO PRESENTACIÓN NUMERO DE LOTE POTENCIA Producto en estudio Comprimidos recubiertos 1 10 mg Producto en estudio Comprimidos recubiertos 2 10 mg Producto en estudio Comprimidos recubiertos 3 10 mg Producto de referencia Comprimidos recubiertos 1 10 mg En este estudio, se analizaron tres lotes del producto en estudio y un lote del producto de referencia, con dos cinéticas de liberación-disolución por cada lote. Por lo tanto, se realizaron un total de 8 cinéticas de liberación-disolución por cada medio de disolución Preparación de las muestras Para Medio HCl 0,1 N (ph 1,2), Buffer Acetato ph 4,5 y Buffer Fosfato ph 6,8: Pesar y transferir individualmente 1 comprimido a cada uno de los vasos del equipo de disolución que contienen 900 ml de medio. Se debe extraer un volumen de muestra filtrada cada 5 minutos y realizar las diluciones pertinentes, para finalmente analizar las muestras en el cromatógrafo. Para poder cuantificar las muestras obtenidas, se debió preparar un estándar 1 y un estándar 2 de Ciclobenzaprina Clorhidrato. La preparación de los medios se encuentra detallada en el punto Criterio de aceptación: para cada cinética de liberación-disolución realizada, el producto farmacéutico debe presentar una rápida o muy rápida liberación-disolución.

71 71 9. RESULTADOS 9.1. Validación de la metodología analítica a) Selectividad La tabla mostrada a continuación resume los resultados obtenidos en la prueba de selectividad, para todos los medios de disolución. Fig. 12. Tabla con resumen de resultados de Selectividad del medio y matriz ESPECIFICACION DE TIPO DE ENSAYO RESULTADO VEREDICTO PUREZA SELECTIVIDAD AL MEDIO DISOLUCIÓN SELECTIVIDAD A LA MATRIZ SIN PRESENCIA DE SEÑALES AL TIEMPO DE RETENCION DE CICLOBENZAPRINA CLORHIDRATO SIN PRESENCIA DE SEÑALES AL TIEMPO DE RETENCION DE CICLOBENZAPRINA CLORHIDRATO NO HAY SEÑAL NO HAY SEÑAL CUMPLE CUMPLE b) Linealidad Las siguientes tablas presentan los resultados de Linealidad para los distintos medios. Fig. 13. Resumen de resultados en relación al factor de respuesta

72 72 Fig. 14. Resultados de Linealidad para medio HCl 0,1 N, ph 1,2 Fig. 15. Resultados de Linealidad para Buffer Ftalato, ph 3,0

73 73 Fig. 16. Resultados de Linealidad para Buffer Acetato, ph 4,5 Fig. 17. Resultados de Linealidad para Buffer Fosfato, ph 6,8

74 74 c) Exactitud y Precisión En las siguientes tablas se presentan los resultados obtenidos para los parámetros Exactitud y Precisión de los medios. Fig. 18. Resultados de Exactitud y Precisión para el medio HCl 0,1 N, ph 1,2 Recup: porcentaje de recuperación. X = Promedio. SD = Desviación estándar. RSD = Desviación estándar relativa.

75 75 Fig. 19. Resultados de Exactitud y Precisión para el Buffer Ftalato ph 3,0 Recup: porcentaje de recuperación. X = Promedio. SD = Desviación estándar. RSD = Desviación estándar relativa.

76 76 Fig. 20. Resultados de Exactitud y Precisión para el Buffer Acetato, ph 4,5 Recup: porcentaje de recuperación. X = Promedio. SD = Desviación estándar. RSD = Desviación estándar relativa.

77 77 Fig. 21. Resultados de Exactitud y Precisión para el Buffer Fosfato, ph 6,8 Recup: porcentaje de recuperación. X = Promedio. SD = Desviación estándar. RSD = Desviación estándar relativa.

78 78 d) Precisión Intermedia A continuación se presentan los resultados para la Precisión Intermedia en Buffer acetato ph 4,5 y Buffer fosfato ph 6,8. Fig. 22. Resultado Precisión Intermedia realizada en Buffer Acetato ph 4,5 (Lote 1) X = Promedio. DS = Desviación estándar. RSD = Desviación estándar relativa.

79 79 Fig. 23. Resultado Precisión Intermedia realizada en Buffer Fosfato ph 6,8 (Lote 2) X = Promedio. DS = Desviación estándar. RSD = Desviación estándar relativa.

80 80 e) Estabilidad A continuación se presentan los resultados de Estabilidad para los distintos medios. Fig. 24. Resultados Estabilidad para medio HCl 0,1 N, ph 1,2 Estandares y muestras iniciales Valores de 24 Hrs (Ambiente) Dia 1 PESO CONC (mg/cp) Lectura X 24 Hr Lectura X % Recup M1 22,2 10,04 9,93 9,93 M1 9,97 9,98 100,5% M1 22,2 10,04 9,93 M1 9,99 M2 22,1 9,99 10,06 10,03 M2 10,05 10,11 100,7% M2 22,1 9,99 10,00 M2 10,16 X Recup 100,6% St 1 22,2 10,04 St 1 9,90 St 2 22,2 10,04 St 1 9,90 9,90 98,6% St 2 10,19 10,19 101,5% St 2 10,19 CUMPLE X Recup 100,1% CUMPLE VEREDICTO: CUMPLE MUESTRAS Estandares y muestras iniciales Valores de 24 Hrs (Refrigerados) Dia 1 PESO CONC (mg/cp) Lectura X 24 Hr Lectura X % Recup M1 22,2 10,04 9,93 9,93 M1 10,02 10,05 101,2% M1 22,2 10,04 9,93 M1 10,08 M2 22,1 9,99 10,06 10,03 M2 10,23 10,18 101,5% M2 22,1 9,99 10,00 M2 10,13 X Recup 101,4% CUMPLE St 1 22,2 10,04 St 1 10,06 St 2 22,2 10,04 St 1 10,05 10,06 100,1% St 2 9,98 10,04 100,0% St 2 10,09 X Recup 100,1% CUMPLE VEREDICTO: CUMPLE X = Promedio. % Recup = Porcentaje de recuperación. X Recup = Promedio recuperación.

81 81 Fig. 25. Resultados Estabilidad para Buffer Ftalato ph 3,0 Estandares y muestras iniciales Valores de 24 Hrs (Ambiente) Dia 1 PESO CONC (mg/cp) Lectura X 24 Hr Lectura X % Recup M1 222,6 10,10 9,98 10,01 M1 10,29 10,30 102,9% M1 222,6 10,10 10,03 M1 10,30 M2 222,2 10,08 9,83 9,84 M2 10,01 9,98 101,4% M2 222,2 10,08 9,84 M2 9,94 X Recup 102,2% CUMPLE St 1 222,4 10,09 St 1 10,07 St 2 222,4 10,09 St 1 10,10 10,09 100,0% St 2 9,99 10,01 99,2% St 2 10,03 X Recup 99,6% CUMPLE VEREDICTO: CUMPLE MUESTRAS Estandares y muestras iniciales Valores de 24 Hrs (Refrigerados) Dia 1 PESO CONC (mg/cp) Lectura X 24 Hr Lectura X % Recup M1 222,6 10,10 9,98 10,01 M1 10,08 10,08 100,7% M1 222,6 10,10 10,03 M1 10,07 M2 222,2 10,08 9,83 9,84 M2 9,97 9,99 101,6% M2 222,2 10,08 9,84 M2 10,01 X Recup 101,1% CUMPLE St 1 222,4 10,09 St 1 10,27 St 2 222,4 10,09 St 1 10,29 10,28 101,9% St 2 10,06 10,07 99,8% St 2 10,07 X Recup 100,8% CUMPLE VEREDICTO: CUMPLE X = Promedio. % Recup = Porcentaje de recuperación. X Recup = Promedio recuperación.

82 82 Fig. 26. Resultados Estabilidad para Buffer Acetato ph 4,5 MUESTRAS Estandares y muestras iniciales Valores de 24 Hrs (Ambiente) Dia 1 PESO CONC (mg/cp) Lectura X 24 Hr Lectura X % Recup M1 22,2 10,04 10,28 M1 10,11 10,26 M1 22,2 10,04 10,24 M1 10,11 10,11 98,5% M2 22,3 10,09 10,34 10,36 M2 10,18 10,20 98,5% M2 22,3 10,09 10,37 M2 10,22 X Recup 98,5% St 1 St 2 22,3 9,93 10,09 St 1 9,86 St 2 St 2 22,4 9,93 10,13 St 1 9,88 9,87 9,93 97,9% 98,0% CUMPLE X Recup 97,9% CUMPLE VEREDICTO: CUMPLE MUESTRAS Estandares y muestras iniciales Valores de 24 Hrs (Refrigerados) Dia 1 PESO CONC (mg/cp) Lectura X 24 Hr Lectura X % Recup M1 22,2 10,04 10,28 M1 10,12 10,26 M1 22,2 10,04 10,24 M1 10,23 M2 22,3 10,09 10,34 M2 10,23 10,36 M2 22,3 10,09 10,37 M2 10,29 10,175 10,26 99,2% 99,1% X Recup 99,1% CUMPLE St 1 St 2 22,3 9,98 10,09 St 1 9,89 St 2 St 2 22,4 9,95 10,13 St 1 9,87 9,88 9,965 98,0% 98,4% X Recup 98,2% CUMPLE VEREDICTO: CUMPLE X = Promedio. % Recup = Porcentaje de recuperación. X Recup = Promedio recuperación.

83 83 Fig. 27. Resultados Estabilidad para Buffer Fosfato ph 6,8 Estandares y muestras iniciales Valores de 24 Hrs (Ambiente) Dia 1 PESO CONC (mg/cp) Lectura X 24 Hr Lectura X % Recup M1 222,0 10,07 10,01 M1 10,01 10,01 M1 222,0 10,07 10,00 M1 9,97 9,99 99,9% M2 222,1 10,07 10,02 10,03 M2 10,00 10,00 99,7% M2 222,1 10,07 10,04 M2 9,99 X Recup 99,8% St 1 St 2 222,5 10,04 10,09 St 1 10,13 St 2 St 2 222,1 10,02 10,07 St 1 10,10 10,12 10,03 100,2% 99,6% CUMPLE X Recup 99,9% CUMPLE VEREDICTO: CUMPLE MUESTRAS Estandares y muestras iniciales Valores de 24 Hrs (Refrigerados) Dia 1 PESO CONC (mg/cp) Lectura X 24 Hr Lectura X % Recup M1 222,0 10,07 10,01 10,01 M1 10,16 10,14 101,3% M1 222,0 10,07 10,00 M1 10,12 M2 222,1 10,07 10,02 10,03 M2 9,76 9,77 97,4% M2 222,1 10,07 10,04 M2 9,78 X Recup 99,4% CUMPLE St 1 222,5 10,09 St 1 10,07 St 2 222,1 10,07 St 1 10,16 10,12 100,2% St 2 St 2 10,17 10,17 10,17 100,9% X Recup 100,6% CUMPLE VEREDICTO: CUMPLE X = Promedio. % Recup = Porcentaje de recuperación. X Recup = Promedio recuperación.

84 84 f) Robustez En las siguientes tablas se presentan los resultados obtenidos para la robustez. Fig. 28. Resultados Robustez para medio HCl 0,1 N, ph 1,2 (muestras con matriz) Valor del efecto DICTAMEN Result experiment % Valor del efecto Tiempo preparación-lectura 0,00675 No Significativo s 106,2% Valor del efecto concentracion ácido 0,01275 No Significativo t 106,3% Valor del efecto volumen de inyección 0,00125 No Significativo u 105,2% Valor del efecto concentración Fase Móvil -0,00375 No Significativo v 105,5% Valor del efecto Temperatura -0,00325 No Significativo w 106,0% Valor del efecto Longitud de Onda -0,00200 No Significativo x 105,9% Valor del efecto flujo 0,00225 No Significativo y z 104,7% 103,9% Fig. 29. Resultados Robustez para medio HCl 0,1 N, ph 1,2 (muestras sin matriz) Valor del efecto DICTAMEN Result experiment % Valor del efecto Tiempo preparación-lectura 0,03025 Significativo s 102,1% Valor del efecto ph Fase Móvil 0,01875 No Significativo t 107,7% Valor del efecto volumen de inyección -0,01125 No Significativo u 101,5% Valor del efecto concentración de MeOH 0,01575 No Significativo v 101,4% Valor del efecto Temperatura -0,01625 No Significativo w 100,7% Valor del efecto Longitud de Onda -0,01250 No Significativo x 99,9% Valor del efecto flujo -0,01575 No Significativo y 100,1% z 99,9% : Cada vez que se prepararon muestras para medio HCl 0,1 N (muestras sin matriz), ya sea para pruebas de solubilidad y cinética de liberación-disolución, fueron analizadas el mismo día que fueron preparadas para evitar alguna significancia en los resultados.

85 Fig. 30. Resultados Robustez para Buffer Ftalato, ph 3,0 (muestras sin matriz) 85

86 86 Fig. 31. Resultados Robustez para Buffer Acetato, ph 4,5 (muestras con matriz) Fig. 32. Resultados Robustez para Buffer Acetato, ph 4,5 (muestras sin matriz) MUESTRA TIPO 2 (No contiene Matriz) : Robustez del ensayo de solubilidad Valor del efecto DICTAMEN Result experiment % Valor del efecto Tiempo preparación-lectura -0,00921 No Significativo s 100,6% Valor del efecto ph Fase Móvil -0,00050 No Significativo t 101,1% Valor del efecto volumen de inyección -0,00075 No Significativo u 100,9% Valor del efecto concentración de MeOH 0,00074 No Significativo v 100,7% Valor del efecto Temperatura -0,00049 No Significativo w 101,4% Valor del efecto Longitud de Onda -0,00360 No Significativo x 101,9% Valor del efecto flujo 0,00049 No Significativo y 102,0% z 101,6%

87 87 Fig. 33. Resultados Robustez para Buffer Fosfato, ph 6,8 (muestras con matriz) Fig. 34. Resultados Robustez para Buffer Fosfato, ph 6,8 (muestras sin matriz) MUESTRA TIPO 2 (No contiene Matriz) : Robustez del ensayo de solubilidad Valor del efecto DICTAMEN Result experiment % Valor del efecto Tiempo preparación-lectura 0,00496 No Significativo s 102,3% Valor del efecto ph Fase Móvil 0,00297 No Significativo t 102,8% Valor del efecto volumen de inyección 0,00521 No Significativo u 103,7% Valor del efecto concentración de MeOH -0,01611 No Significativo v 104,1% Valor del efecto Temperatura -0,00942 No Significativo w 103,0% Valor del efecto Longitud de Onda -0,01488 No Significativo x 104,3% Valor del efecto flujo 0,01364 No Significativo y 103,9% z 99,7%

88 88 g) Influencia del Filtro A continuación se presenta una tabla con el resumen de los resultados para la influencia del filtro. Fig. 35. Resumen resultados Influencia del Filtro para todos los medios

89 Cromatogramas medios. A continuación se presentan los Cromatogramas obtenidos en cada uno de los Fig. 36. Estándar Ciclobenzaprina Clorhidrato en medio HCl 0,1 N, ph 1,2 Fig. 37. Cromatograma del producto en estudio, que contiene Ciclobenzaprina Clorhidrato, en medio HCl 0,1 N, ph 1,2

90 90 Fig. 38. Cromatograma para el blanco medio HCl 0,1 N, ph 1,2 Fig. 39. Cromatograma de la matriz del producto en estudio, medio HCl 0,1 N, ph 1,2

91 91 Fig. 40. Estándar Ciclobenzaprina Clorhidrato, Buffer Ftalato ph 3,0 Fig. 41. Cromatograma para el blanco, Buffer Ftalato ph 3,0

92 92 Fig. 42. Estándar Ciclobenzaprina Clorhidrato Buffer Acetato ph 4,5 Fig. 43. Cromatograma del producto en estudio, que contiene Ciclobenzaprina Clorhidrato, Buffer Acetato ph 4,5

93 93 Fig. 44. Cromatograma para el blanco, Buffer Acetato ph 4,5 Fig. 45. Cromatograma de la matriz del producto en estudio, Buffer Acetato ph 4,5

94 94 Fig. 46. Estándar Ciclobenzaprina Clorhidrato, Buffer Fosfato ph 6,8 Fig. 47. Cromatograma del producto en estudio, que contiene Ciclobenzaprina Clorhidrato, Buffer Fosfato ph 6,8

95 95 Fig. 48. Cromatograma para el blanco, Buffer Fosfato ph 6,8 Fig. 49. Cromatograma de la matriz del producto en estudio, Buffer Fosfato ph 6,8

96 Solubilidad A continuación se presentan los resultados de los distintos ensayos de solubilidad para el principio activo Ciclobenzaprina Clorhidrato. Fig. 50. Resultados de Solubilidad medio HCl 0,1 N, ph 1,2 M = Muestra. V/D = Volumen necesario para disolver una dosis de 10 mg de Ciclobenzaprina HCl. X = Promedio. D.S = Desviación estándar. %RSD = Desviación estándar relativa.

97 97 Fig. 51. Resultados de Solubilidad Buffer Ftalato, ph 3,0 M = Muestra. V/D = Volumen necesario para disolver una dosis de 10 mg de Ciclobenzaprina HCl. X = Promedio. D.S = Desviación estándar. %RSD = Desviación estándar relativa.

98 98 Fig. 52. Resultados de Solubilidad Buffer Acetato ph 4,5 M = Muestra. V/D = Volumen necesario para disolver una dosis de 10 mg de Ciclobenzaprina HCl. X = Promedio. D.S = Desviación estándar. %RSD = Desviación estándar relativa.

99 99 Fig. 53. Resultados de Solubilidad Buffer Fosfato ph 6,8 M = Muestra. V/D = Volumen necesario para disolver una dosis de 10 mg de Ciclobenzaprina HCl. X = Promedio. D.S = Desviación estándar. %RSD = Desviación estándar relativa. Fig. 54. Representación gráfica de los resultados de Solubilidad de Ciclobenzaprina Clorhidrato en la forma de perfil de Solubilidad versus ph Solubilidad (mg/ml) 180,0 160,0 140,0 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 Perfil de Solubilidad de Ciclobenzaprina Clorhidrato versus ph 1,2 3 4,5 6,8 ph medio

100 Permeabilidad A continuación se presentan los antecedentes que entregan un respaldo a los resultados de permeabilidad propuestos para Ciclobenzaprina. Fig. 55. Resultados de Permeabilidad según Software ChembiowDraw Ultra Principio activo Log P clog P Ciclobenzaprina 4,31 5,097 Metoprolol 2,18 1,4834 Fig. 56. Resultados Permeabilidad a través de la barrera hematoencefálica en células MDCK tipo II Transporte Apical- Transporte Basolateral- Principio activo Basolateral Apical (nm/s) (nm/s) Ciclobenzaprina Metoprolol (Modificado de Mahar et al, 2002)

101 101 Fig. 57. Tabla Clasificaciones de Permeabilidad para fármacos Clasificación Permeabilidad en Fármacos Permeabilidad células MDCK intestinal tipo II Amitriptilina Alta Alta Buspirona Alta Alta Clorpromazina Alta Alta Desipramina Alta Alta Fluoxetina Alta Alta Midazolam Alta Alta Antipirina Alta Alta Atenolol Alta Alta Clorfeneramina Alta Alta Verapamilo Alta Alta Metoprolol Alta Alta Atenolol Baja Baja Cimetidina Baja Baja Trimetoprim Baja Baja (Adaptado desde Wu et al, 2005; y Mahar et al, 2002) Nota figura 57: En la tabla se puede observar que la correlación de los resultados de ciertos fármacos considerados altamente permeables en el estudio de permeabilidad en células MDCK tipo II y el realizado por Wu et al (2005) es bastante buena, ya que once de los catorce principios activos seleccionados muestran una alta permeabilidad, y tres de los catorce principios activos muestran una baja permeabilidad en ambos estudios.

102 102 Fig. 58. Correlación de permeabilidades jejunales humanas con permeabilidades determinadas en células MDCK tipo II Fármacos Permeabilidad Jejunal Humana (x10 4 cm/s) Permeabilidad BBB (blood-brain barrier), con células MDCK tipo II (nm/s) Atenolol 0,20 2,56 Cimetidina 0,26 3,96 Metoprolol 1, Propanolol 2, Carbamazepina 4,3 602 Antipirina 5,6 792 Verapamilo 6,8 415 (Adaptado desde Kasim et al, 2004; y Mahar et al, 2002) Fig. 59. Gráfico correlación de permeabilidades jejunales humanas con permeabilidades determinadas en células MDCK tipo II Grafico de correlación de la permeabilidad jejunal humana con resultados en celulas MDCK tipo II Fármacos 6 Peff x E4 (cm/s) Papp (nm/s) en Células MDCK tipo II (Adaptado desde de Kasim et al, 2004; y Mahar et al, 2002) Nota figura 58 y 59: Considerando a Metoprolol como un principio activo de alta permeabilidad, en ambos estudios se demuestra una buena correlación con respecto a los principios activos analizados.

103 103 Fig. 60. Correlación de Células MDCK con Células Caco-2 Fármacos Transporte Apical-Basolateral % fármaco/hora Células Células MDCK Caco-2 Transporte Basolateral-Apical % fármaco/hora Células Células MDCK Caco-2 Trimetoprim 3,3 3,9 8,4 5,1 Rifampicina 5,2 4 6,7 5,6 d-cicloserina 14,3 0,7 1,5 1,1 Rifapentina 18,1 20,3 19,2 20,2 Novobiocin 19,4 9,3 19,8 9,3 Isoniazida 35,6 21,7 36,2 17,1 Acido Nalidixico 132,7 143,2 131,0 129,0 (Modificado de Ranaldi et al, 1992) Fig. 61. Gráfico correlación células MDCK con células Caco-2, Apical-Basolateral Gráfico Correlación Células MDCK con Células Caco-2, Apical-Ba sola teral. Fig. 62. Gráfico correlación células MDCK con células Caco-2, Basolateral-Apical Gráfico Correlación Células MDCK con Células Caco-2, Basolateral-Apical Células MDCK (Adaptado desde Ranaldi et al, 1992) (Adaptado desde Ranaldi et al, 1992) Nota figura 60, 61 y 62: En la tabla y en los gráficos del estudio de Ranaldi et al (1992) se puede inferir la correlación entre ambas líneas celulares cuando se habla de permeabilidad. R 2 = Células Caco-2 Fármacos Lineal (Fármacos) Células MDCK R 2 = Fármacos Células Caco-2 Lineal (Fármacos)

104 Liberación-Disolución A continuación se presentan los resultados del estudio de liberación-disolución para los medios a ph 1,2, ph 4,5 y ph 6,8. Fig. 63. Perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) X = Promedio. D.S = Desviación estándar. C.V= Coeficiente de variación. MAX = Máximo. MIN = Mínimo.

105 105 El cálculo de los valores corregidos para cada uno de los ensayos de liberacióndisolución se realiza de la siguiente manera: Fig. 64. Cálculo de los valores corregidos para las pruebas de disolución realizadas en el aparato de disolución modelo Vision Elite, Hanson Research Tiempo Cálculo 5 min Valor de lectura 5 min 10 min Valor de lectura 10 min + (Valor de lectura 5 min * (12/900)) 15 min 20 min Valor de lectura 15 min + (Valor de lectura 5 min * (12/900)) + (Valor Corregido 10 min * (12/900)). Valor de lectura 20 min + (Valor de lectura 5 min * (12/900)) + (Valor Corregido 10 min * (12/900)) + (Valor Corregido 15 min * (12/900)). Fig. 65. Cálculo de los valores corregidos para las pruebas de disolución realizadas en los aparatos de disolución modelo SR8 Plus, Hanson Research Tiempo Cálculo 5 min Valor de lectura 5 min 10 min Valor de lectura 10 min + (Valor de lectura 5 min * (20/900)) 15 min 20 min Valor de lectura 15 min + (Valor de lectura 5 min * (20/900)) + (Valor Corregido 10 min * (20/900)). Valor de lectura 20 min + (Valor de lectura 5 min * (20/900)) + (Valor Corregido 10 min * (20/900)) + (Valor Corregido 15 min * (20/900)).

106 106 Fig. 66. Gráfico perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) % disuelto de Ciclobenzaprina HCl 120,0% 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% Perfil Liberación-Disolución producto en estudio Lote 1, Medio ph 1,2 5 min 10 min 15 min 20 min Tiempo V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 Fig. 67. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) % disuelto de Ciclobenzaprina HCl 120,0% 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% Perfil Liberación-Disolución promedio Producto en estudio, Lote 1 Medio ph 1,2 5 min 10 min 15 min 20 min Tiempo (min)

107 107 Fig. 68. Perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 2, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) X = Promedio. D.S = Desviación estándar. C.V= Coeficiente de variación. MAX = Máximo. MIN = Mínimo.

108 108 Fig. 69. Gráfico perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 2, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) % disuelto de Ciclobenzaprina HCl 120,0% 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% Perfil Liberación-Disolución producto en estudio Lote 2. Medio ph 1,2 5 min 10 min 15 min 20 min Tiempo V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 Fig. 70. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto en estudio Lote 2, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) 120,0% Perfil Liberación-Disolución promedio Producto en estudio, Lote 2 Medio ph 1,2 % disuelto de Ciclobenzaprina HCl 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% 5 min 10 min 15 min 20 min Tiempo (min)

109 109 Fig. 71. Perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 3, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) X = Promedio. D.S = Desviación estándar. C.V= Coeficiente de variación. MAX = Máximo. MIN = Mínimo.

110 110 Fig. 72. Gráfico perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 3, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) % disuelto de Ciclobenzaprina HCl 120,0% 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% Perfil Liberación-Disolución producto en estudio Lote 3. Medio ph 1,2 5 min 10 min 15 min 20 min Tiempo V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 Fig. 73. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto en estudio Lote 3, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) % disuelto de Ciclobenzaprina HCl 120,0% 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% Perfil Liberación-Disolución promedio Producto en estudio, Lote 3 Medio ph 1,2 5 min 10 min 15 min 20 min Tiempo (min)

111 111 Fig. 74. Perfil liberación-disolución producto de referencia (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) X = Promedio. D.S = Desviación estándar. C.V= Coeficiente de variación. MAX = Máximo. MIN = Mínimo.

112 112 Fig. 75. Gráfico perfil liberación-disolución producto de referencia (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) Perfil Liberación-Disolución producto de referencia Lote 1. Medio ph 1,2 % disu elto de Cicloben zaprina HCl 120,0% 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% 5 min 10 min 15 min 20 min Tiempo (min) V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 Fig. 76. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto de referencia Lote 1, medio HCl 0,1 N (ph 1,2) % disuelto de Ciclobenzaprina HCl 120,0% 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% Perfil Liberación-Disolución promedio Producto de referencia, Lote 1 Medio ph 1,2 5 min 10 min 15 min 20 min Tiempo (min)

113 113 Fig. 77. Resumen resultados estudio liberación-disolución para medio HCl 0,1 N, ph 1,2 Producto Nº de Lote % disuelto a los 15 minutos. Límite Resultado Estudio 1 93,2% Estudio 2 99,4% Estudio 3 105,1% Mayor o igual a 85% disuelto a los 15 min. Mayor o igual a 85% disuelto a los 15 min. Mayor o igual a 85% disuelto a los 15 min. Muy rápida liberación-disolución Muy rápida liberación-disolución Muy rápida liberación-disolución PROMEDIO 99,2 % CLASIFICACIÓN Muy rápida liberación-disolución Producto Nº de Lote % disuelto a los 15 minutos. Límite Resultado Referencia 1 93,8% Mayor o igual a 85% disuelto a los 15 min. Muy rápida liberación-disolución PROMEDIO 93,8 % CLASIFICACIÓN Muy rápida liberación-disolución

114 114 Fig. 78. Perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, Buffer Acetato (ph 4,5) X = Promedio. D.S = Desviación estándar. C.V= Coeficiente de variación. MAX = Máximo. MIN = Mínimo.

115 115 Fig. 79. Gráfico perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, Buffer Acetato (ph 4,5) Perfil Libe ración-disolución produc to en e studio Lote 1. Medio Buffer Acetato ph 4,5 % disuelto de Ciclobenzaprina HCl 120,0% 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% 5 min 10 min 15 min 20 min V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 Tiempo (min) Fig. 80. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto en estudio Lote 1, Buffer Acetato (ph 4,5) 120,0% Perfil Liberación-Disolución promedio Producto en estudio, Lote 1 Medio Buffer Acetato ph 4,5 % disuelto de Ciclobenzaprina HCl 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% 5 min 10 min 15 min 20 min Tiempo (min)

116 116 Fig. 81. Perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 2, Buffer Acetato (ph 4,5) X = Promedio. D.S = Desviación estándar. C.V= Coeficiente de variación. MAX = Máximo. MIN = Mínimo.

117 117 Fig. 82. Gráfico perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 2, Buffer Acetato (ph 4,5) Perfil Libe ración-disolución producto en es tudio Lote 2. Medio Buffer Acetato ph 4,5 % disuelto de Ciclobenzaprina HCl 120,0% 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% 5 min 10 min 15 min 20 min V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 Tiempo (min) Fig. 83. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto en estudio Lote 2, Buffer Acetato (ph 4,5) 120,0% Perfil Liberación-Disolución promedio Producto en estudio, Lote 2 Medio Buffer Acetato ph 4,5 % disuelto de Ciclobenzaprina HCl 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% 5 min 10 min 15 min 20 min Tiempo (min)

118 118 Fig. 84. Perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 3, Buffer Acetato (ph 4,5) X = Promedio. D.S = Desviación estándar. C.V= Coeficiente de variación. MAX = Máximo. MIN = Mínimo.

119 119 Fig. 85. Gráfico perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 3, Buffer Acetato (ph 4,5) Perfil Libe ración-disolución producto en es tudio Lote 3. Medio Buffer Acetato ph 4,5 % disuelto de Ciclobenzaprina HCl 120,0% 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% 5 min 10 min 15 min 20 min V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 Tiempo (min) Fig. 86. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto en estudio Lote 3, Buffer Acetato (ph 4,5) 120,0% Perfil Liberación-Disolución promedio Producto en estudio, Lote 3 Medio Buffer Acetato ph 4,5 % disuelto de Ciclobenzaprina HCl 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% 5 min 10 min 15 min 20 min Tiempo (min)

120 120 Fig. 87. Perfil liberación-disolución producto de referencia (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, Buffer Acetato (ph 4,5) X = Promedio. D.S = Desviación estándar. C.V= Coeficiente de variación. MAX = Máximo. MIN = Mínimo.

121 121 Fig. 88. Gráfico perfil liberación-disolución producto de referencia (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, Buffer Acetato (ph 4,5) % disuelto de Ciclobenzaprina HCl 120,0% 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% Perfil Liberación-Disolución producto de referencia Lote 1. Medio Buffer Acetato ph 4,5 5 min 10 min 15 min 20 min Tiempo V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 Fig. 89. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto de referencia Lote 1, Buffer Acetato (ph 4,5) 120,0% Perfil Liberación-Disolución promedio Producto de referencia, Lote 1 Medio Buffer Acetato ph 4,5 % disuelto de Ciclobenzaprina HCl 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% 5 min 10 min 15 min 20 min Tiempo (min)

122 122 Fig. 90. Resumen resultados estudio liberación-disolución para Buffer ph 4,5 Producto Nº de Lote % disuelto a los 15 minutos. Límite Resultado Estudio 1 103,6% Estudio 2 101,8% Estudio 3 102,0% Mayor o igual a 85% disuelto a los 15 min. Mayor o igual a 85% disuelto a los 15 min. Mayor o igual a 85% disuelto a los 15 min. Muy rápida liberación-disolución Muy rápida liberación-disolución Muy rápida liberación-disolución PROMEDIO 102,5 % CONCLUSION Muy rápida liberación-disolución Producto Nº de Lote % disuelto a los 15 minutos. Límite Resultado Referencia 1 98,1% Mayor o igual a 85% disuelto a los 15 min. Muy rápida liberación-disolución PROMEDIO 98,1 % CONCLUSION Muy rápida liberación-disolución

123 123 Fig. 91. Perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, Buffer Fosfato (ph 6,8) X = Promedio. D.S = Desviación estándar. C.V= Coeficiente de variación. MAX = Máximo. MIN = Mínimo.

124 124 Fig. 92. Gráfico perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, Buffer Fosfato (ph 6,8) Perfil Liberación-Disolución producto en estudio Lote 1. Medio Buffer Fosfato ph 6,8 % disuelto de Ciclobenzaprina HCl 120,0% 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% 5 min 10 min 15 min 20 min V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 Tiempo (min) Fig. 93. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto en estudio Lote 1, Buffer Fosfato (ph 6,8) 120,0% Perfil Liberación-Disolución promedio Producto en estudio, Lote 1 Medio Buffer Fosfato ph 6,8 % disuelto de Ciclobenzaprina HCl 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% 5 min 10 min 15 min 20 min Tiempo (min)

125 125 Fig. 94. Perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 2, Buffer Fosfato (ph 6,8) X = Promedio. D.S = Desviación estándar. C.V= Coeficiente de variación. MAX = Máximo. MIN = Mínimo.

126 126 Fig. 95. Gráfico perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 2, Buffer Fosfato (ph 6,8) Perfil Libe ra ción-disolución produc to en es tudio Lote 2. Medio Buffer Fosfato ph 6,8 % disuelto de Ciclobenzaprina HCl 120,0% 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% 5 min 10 min 15 min 20 min T iempo (min) V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 Fig. 96. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto en estudio Lote 2, Buffer Fosfato (ph 6,8) 120,0% Perfil Lib eración-disolución prom edio Producto en estudio, Lo te 2 Medio Buffer Fosfato ph 6,8 % disuelto de Ciclobenzaprina HCl 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% 5 min 10 m in 15 m in 20 m in Tiempo (min)

127 127 Fig. 97. Perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 3, Buffer Fosfato (ph 6,8) X = Promedio. D.S = Desviación estándar. C.V= Coeficiente de variación. MAX = Máximo. MIN = Mínimo.

128 128 Fig. 98. Gráfico perfil liberación-disolución producto en estudio (Ciclobenzaprina HCl) Lote 3, Buffer Fosfato (ph 6,8) Perfil Liberación-Disolución producto en estudio Lote 3. Medio Buffer Fosfato ph 6,8 % disuelto de Ciclobenzaprina HCl 120,0% 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% 5 min 10 min 15 min 20 min Tiempo (min) V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 Fig. 99. Gráfico perfil liberación-disolución promedio, producto en estudio Lote 3, Buffer Fosfato (ph 6,8) 120,0% Perfil Liberación-Disolución promedio Producto en estudio, Lote 3 Medio Buffer Fosfato ph 6,8 % disuelto de Ciclobenzaprina HCl 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% 5 min 10 min 15 min 20 min Tiempo (min)

129 129 Fig Perfil liberación-disolución producto de referencia (Ciclobenzaprina HCl) Lote 1, Buffer Fosfato (ph 6,8) X = Promedio. D.S = Desviación estándar. C.V= Coeficiente de variación. MAX = Máximo. MIN = Mínimo.