REALIZACION DE CURVAS DE CALIBRACIÓN PARA PROTEÍNAS Y AZÚCARES REDUCTORES. INTRODUCCIÓN Existen dos facetas de calibración en el análisis cualitativo, la calibración instrumental y la calibración metodológica. La calibración instrumental se realiza con estándares que no contienen el analito y se utiliza para asegurar el funcionamiento del instrumento empleado. La calibración metodológica se realiza con estándares que contienen el analito para establecer una relación entre las características fisicoquímicas del analito y las señales del instrumento. En un proceso analítico se relaciona la señal y características del analito, de modo que la calibración se realiza al obtener la señal de respuesta como función de la concentración conocida del analito. Se representan los datos obtenidos y se obtiene la gráfica de la señal corregida frente a la concentración del analito. Lo normal es que la gráfica tienda a una línea recta, donde a medida que aumenta la concentración (Fig.1), la señal de respuesta es mayor (pendiente positiva). En el modelo de curva de calibración lineal, la pendiente vendrá dada por la ecuación matemática: y = mx + b Siendo m la pendiente, x la concentración e y la señal de respuesta. La sensibilidad de calibración es la pendiente de la curva de calibrado. Por tanto en una curva de calibrado lineal la sensibilidad es siempre la misma y no va a depender de la concentración, ya que para que se cumpla y = mx + b, las concentraciones deben tener una incertidumbre insignificante. Exactitud Es el grado de concordancia entre el resultado de una determinación o la media de n resultados y el valor verdadero del analito en la muestra en cuestión. Toda medida tiene un fallo, por lo que el valor verdadero no lo conocemos, pero nos podemos aproximar a él utilizando los siguientes materiales: Material de referencia: material o sustancia, en el cual una o más de sus propiedades están suficientemente bien establecidas para que sea usado en la calibración, la estimación de un método de medición o para asignar valores a los materiales. Material de referencia certificado (MRC): material en el que los valores de una o más de sus propiedades están certificados por un procedimiento técnicamente validado.
Determinación de proteínas y azúcares reductores Existen diversos métodos que permiten cuantificar la concentración de proteína presente en las muestras biológicas, basados en las propiedades que muestran las proteínas en solución. Los métodos más usuales son:. Reacción de Biuret.. Método de Lowry.. Método de Bradford.. Método del ácido Bicinconínico (BCA).. Absorción en el ultravioleta.. Métodos inmunológicos. Siendo uno de los más utilizados el método Bradforf por ser un método rápido, reproducible y sensible. Para la determinación de azúcares según el método Miller, los azúcares reductores pueden reducir al ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) bajo determinadas condiciones. Cuando el ácido 3,5-dinitrosa- licílico es reducido en presencia de calor, por los azúcares reductores que entran en contacto con él, se desarrolla un cambio de color parecido al café (con variaciones de amarillo hasta café). El cambio de coloración puede entonces determinarse por lecturas de densidad óptica, leídas por espectrofotometría a una determinada longitud de onda. La concentración de los azúcares reductores totales liberados en la muestra se determina haciendo una interpolación en la curva patrón del azúcar utilizado, graficando la absorbancia en función de la concentración.
OBJETIVO GENERAL Elaboración de diferentes curvas de calibración (azúcares reductores y proteínas) y entender su importancia. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Obtener una curva de calibración para azúcares reductores haciendo uso del método de Miller (DNS) usando Glucosa como estándar. Obtener una curva de calibración para proteína por el método Bradford Albúmina de huevo (AH) como estándar. usando MATERIALES Y EQUIPO. Micropipetas de 1000, 200 y 20 µl. Puntas para micropipeta azules y amarillas. Tubos eppendorf de 1.5 ml. Gradillas para eppendorf. Vasos de pp de 1 litro. Vasos de pp de 250 ml. Reactivo DNS. Reactivo Bradford. Parrilla de calentamiento. Recipiente con hielos.. Espectrofotómetro con celdas. Vortex DESARROLLO EXPERIMENTAL Y TEÓRICA. Preparación de reactivos a) Reactivo de Bradford Disolver 10 mg de azul brillante de Coomassie G-250 en 5 ml de etanol al 95%. A esta solución se le añaden 10 ml de ácido fosfórico al 85% (w/v). La solución resultante se diluye a un volumen final de 100 ml. Las concentraciones finales en el reactivo son 0.01%
(w/v) de azul brillante de Coomassie G- 250, 4.7% (w/v) de etanol y 8.5% (w/v) de ácido fosfórico. Una vez terminado el reactivo se debe verificar el color, debe ser café. Si tiene un tono azulado no es adecuada y se desecha, debiendo preparar nuevamente. Filtrar el reactivo cuando sea necesario, conservar en frasco ámbar bajo refrigeración hasta su uso. b) Reactivo del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) 1. Preparar una solución de 100 ml que contenga 2 g de NaOH disuelto. 2. Agregar 2g de Ácido 3,5-Dinitrosalicílico con agitación constante 3. Agregar 40g de Tartrato sódico-potasio tetrahidratado. 4. Agregar 0.4 g de fenol. 5. Agregar 0.1g de Sulfito de sodio. 6. Aforar a 200 ml con agua destilada. 7. Guardar en obscuridad y en frasco ámbar. Dejar reposar 15 min, en caso de uso inmediato. ES IMPORTANTE tener cuidado con los volúmenes que se manejan, por que el volumen final no debe ser mayor a 200 ml. OBTENCIÓN DE LAS CURVAS DE CALIBRACIÓN. a) Azúcares Reductores 1. Para la obtención de la curva de calibración de azúcares reductores se utilizará como estándar la Glucosa para ello se realiza la curva patrón de Glucosa (o el azúcar reductor más adecuado en función de lo que se vaya a determinar) en un rango de concentración de 0 a 2.0 g/l. 2. Las diluciones se prepararán, por duplicado, de acuerdo a la Tabla 1, o bien, pueden realizarse diluciones seriadas teniendo en cuenta la concentración que se tendrá en cada una. 3. Una vez que se preparan las diluciones se debe realizar el procedimiento para azúcares reductores.
*Con el blanco se ajusta a cero de absorbancia el espectrofotómetro. CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES POR EL MÉTODO DE DNS 4. Agregar 100 µl de la solución problema (solución de glucosa a 1 mg/ml o de sacarosa a 6 mg/ml ya digerida, tabla 1). 5. Agregar 300 µl del reactivo de DNS preparado. 6. Ebullir 5 minutos y dejar enfriar (10 minutos aproximadamente) en el recipiente con hielos. 7. Agregar 600 µl de agua destilada. 8. Agitar en vórtex a temperatura ambiente. 9. Leer la absorbancia registrada en el espectro de UV-Visible a 540 nm (cuidar que no pase más de 30 min para su lectura). 10. Elaborar la curva patrón en donde se grafique en el eje de las ordenas (eje y ) promedio de la absorbancia determinada a 540 nm y en el eje de las abscisas (eje x ) el promedio de la concentración de Glucosa determinada en g/l. 11. Determina la ecuación de la línea recta que relaciona a los dos parámetros: y = mx + b En donde y representa la absorbancia determinada a 540 nm. x representa la concentración de maltosa determinada en g/l.
La curva patrón será correcta cuando se obtenga una R2 mayor o igual a 0.98, con lecturas de absorbancia entre 0 y 1. b) Determinación de Proteína. 1. La determinación de proteína de una solución enzimática con el método de Bradford, se determina por medio de una curva tipo con albúmina de huevo (AH) y el reactivo de Bradford. 2. Curva tipo: preparar diferentes concentraciones de AH de 0 a 200 µg/ml, a partir de una solución de 200 µg/ml, (Tabla 2). 3. Agregar en un tubo eppendorf limpio la cantidad de solución de AH y agua que se indica para obtener un volumen final de 0.25 ml de muestra. 4. Posteriormente adicionar 0.75 ml de reactivo de Bradford, y dejar en reposo EXACTAMENTE 5 minutos, inmediatamente después leer la absorbancia a 595 nm, ajustando el equipo con el blanco de reactivos o agua (el que no contiene proteína). REFERENCIAS Bradford, M. M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254. Miller G., 1959. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal. Chem. 31: 426-428.