LIAISON DHEA-S (310430)

DiaSorin S.p.A. Via Crescentino snc - 13040 Saluggia (Vercelli) - Italy Tel. 39.0161.487.093 - Fax 39.0161.487.628 Atención a las modificaciones! LIAISON DHEA-S (310430) 1. FINALIDAD DEL ENSAYO El ensayo LIAISON DHEA-S emplea la tecnología de la quimioluminiscencia (CLIA) en un ensayo inmunológico para la determinación cuantitativa in vitro del sulfato de dehidroepiandrosterona en muestras de suero o de plasma humano. El ensayo debe realizarse en el instrumento LIAISON. 2. SUMARIO Y EXPLICACIÓN DEL TEST La dehidroepiandrosterona (DHEA) es una prohormona esteroidea sintetizada principalmente por la corteza suprarrenal a partir del sulfato de colesterol, del sulfato de pregnenolona y del sulfato de 17-hidroxipregnenolona. La DHEA es una molécula lipófila que puede convertirse en la forma hidrófila circulante, el sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEA-S). La transformación en la forma hidrófila de reserva se produce en las glándulas suprarrenales, en el hígado y en el intestino delgado. La concentración de DHEA-S es 300 veces mayor respecto a la de DHEA; por lo tanto, la DHEA-S es la hormona esteroidea de 19 átomos de carbono más abundante que se observe en la sangre. La DHEA y la DHEA-S son precursoras inactivas de andrógenos y estrógenos, que se transforman en esteroides sexuales activos en los tejidos específicos periféricos como cerebro, genitales externos, folículos pilosos y tejido adiposo. La DHEA- S con la DHEA también regula la actividad de la 3-beta deshidrogenasa y de la 11-beta hidroxilasa, dos enzimas de importancia fundamental para la biosíntesis de los esteroides suprarrenales. La DHEA-S es excretada por la orina, donde representa el más importante 17-cetosteroide. Además, la DHEA-S actúa como sustrato para la síntesis de androstenodiona (y por lo tanto testosterona) y como producto de desintoxicación de las suprarrenales, que se puede interpretar como forma de reserva y como descarga metabólica de la corteza suprarrenal. En los hombres, el 50% aproximadamente de los andrógenos derivan de los precursores esteroides suprarrenales. En las mujeres, antes de la menopausia, el 75% aproximadamente de la síntesis de estrógenos se produce en las células específicas periféricas; en las mujeres, después de la menopausia, el porcentaje es casi del 100%. La síntesis de la DHEA-S se asocia fuertemente a la edad. La actividad biológica de la DHEA-S comienza durante la vida intrauterina, donde puede considerarse un precursor de los estrógenos en la placenta. Aquí se concentra tanto la DHEA-S proveniente de la corteza suprarrenal, como la DHEA-S que se forma por la esteroidogénesis placentaria. En el recién nacido los niveles disminuyen hasta valores prepúberes después de las tres primeras semanas de vida. Esta observación indica que los niveles séricos de DHEA-S derivan de la actividad residual de la corteza suprarrenal fetal. Adquiere un particular interés al respecto la observación de valores elevados de DHEA-S en los niños nacidos antes de término (38 semanas de gestación), como índice de la respuesta suprarrenal fetal al nacimiento prematuro. Los niveles séricos de DHEA-S aumentan de nuevo hacia los seis años de edad y alcanzan los niveles de la edad adulta alrededor de los 13 años. El significado de esta hipersecreción sería la estimulación de la síntesis de las gonadotropinas hipofisarias. La DHEA-S brinda una buena indicación para establecer la función de la corteza suprarrenal a causa de su larga semivida y de las limitadas variaciones circadianas. Por lo tanto, el ensayo de la DHEA-S es el test mayormente utilizado para el diagnóstico diferencial de pacientes con virilismo. La DHEA-S es útil para diagnosticar patologías endocrinas, en especial de origen suprarrenal: Estudio de la evolución de la pubertad: los niveles de DHEA-S son bajos en caso de pubertad retardada y elevados en caso de pubertad precoz. Estudio de la funcionalidad suprarrenal: los niveles de DHEA-S son bajos en el hipoadrenalismo primario y secundario; por el contrario, la DHEA-S es el único andrógeno presente en concentraciones anormalmente elevadas en las mujeres hirsutas con amenorrea de origen suprarrenal y en los pacientes con hiperplasia suprarrenal congénita. El ensayo de la DHEA-S se aconseja durante los test dinámicos de supresión con dexametasona, porque los niveles de DHEA-S en estos casos permanecen suprimidos por 30-90 días. La mayoría de los pacientes con síndrome de Cushing (de etiología hipofisaria) presentan niveles moderadamente elevados de DHEA-S. Altas concentraciones de DHEA-S a menudo se observan en la síndrome del ovario poliquístico y demuestran que el hiperandrogenismo suprarrenal es bastante común de esta enfermedad. Niveles muy elevados de DHEA-S en las mujeres son indicativos de tumor suprarrenal que secreta la hormona. Dado que los niveles de DHEA-S reflejan la síntesis de los andrógenos suprarrenales, la medición de las concentraciones séricas representa un indicador precoz del inicio de la pubertad en los varones (adrenarca). La medición de la DHEA-S sérica se utiliza muy frecuentemente para el diagnóstico diferencial de pacientes con virilismo. El virilismo se debe a altos niveles de andrógenos (testosterona), que pueden causar calvicie (alopecia), amenorrea y crecimiento anormal del vello (hirsutismo). Los tumores ováricos virilizantes se asocian con marcado aumento de la testosterona sérica en presencia de niveles casi normales de DHEA-S. Los tumores virilizantes de las glándulas suprarrenales secretan grandes cantidades de andrógenos potentes además de la DHEA-S. DHEA-es.fm 39 March 29, 2010 11:23 am

3. PRINCIPIO DEL ENSAYO El método para la determinación cuantitativa de la DHEA-S es un ensayo inmunológico de tipo competitivo basado en el principio de la quimioluminiscencia. Un anticuerpo monoclonal de ratón específico dirigido contra la DHEA-S recubre las partículas magnéticas (fase sólida, anticuerpo de captura); la DHEA-S se enlaza a un derivado del isoluminol para formar un conjugado. Durante la incubación, la DHEA-S presente en los calibradores, en las muestras o en los controles compite con el conjugado entre isoluminol y DHEA-S por la cantidad fija y limitada de anticuerpo monoclonal anti-dhea-s enlazada en la fase sólida. Después de la incubación, la DHEA-S no enlazada se separa de la DHEA-S enlazada a las partículas magnéticas por aspiración de la mezcla de reacción y sucesivo ciclo de lavado. A continuación, los pocillos con las partículas magnéticas lavadas se colocan en el luminómetro del instrumento donde se añaden automáticamente los reactivos starter que inducen una reacción de quimioluminiscencia. La señal luminosa se mide con un fotomultiplicador y se expresa en unidades relativas de luz (RLU, relative light units). Ésta se correlaciona con la cantidad de DHEA-S conjugada y es inversamente proporcional a la concentración de DHEA-S presente en los calibradores, en las muestras o en los controles. 4. MATERIALES SUMINISTRADOS Integral de reactivos Partículas magnéticas (2,3 ml) Calibrador 1 (0,8 ml) Calibrador 2 (0,8 ml) Conjugado (23 ml) Diluyente de muestras (13 ml) Partículas magnéticas recubiertas con anticuerpo monoclonal de ratón anti-dhea-s, albúmina sérica bovina, tampón PBS, < 0,1% azida sódica. Suero humano sin esteroides que contiene niveles bajos de DHEA-S, 0,2% ProClin 300, conservantes y un colorante rojo inactivo. Las concentraciones de los calibradores () están calibradas contra una preparación estándar interna de DHEA-S. Suero humano sin esteroides que contiene niveles altos de DHEA-S, 0,2% ProClin 300, conservantes y un colorante azul inactivo. Las concentraciones de los calibradores () están calibradas contra una preparación estándar interna de DHEA-S. DHEA-S conjugado con un derivado del isoluminol, IgG de ratón no específica, albúmina sérica bovina, tampón PBS, 0,2% ProClin 300 y un colorante rojo inactivo. Albúmina sérica bovina, tampón PBS, 0,2% ProClin 300 y un colorante azul inactivo. El reactivo es usado para la dilución de las muestras con concentraciones de DHEA-S por encima del intervalo de medición. Número de ensayos 100 Todos los reactivos se suministran listos para su uso. El orden de los reactivos refleja el orden con el que se han ensamblado los contenedores en el integral de reactivos. Materiales requeridos, pero no suministrados Otros materiales requeridos LIAISON Module (código 319130). Controles LIAISON DHEA-S, niveles 1 y 2 (código 310431). LIAISON Starter Kit (código 319102). LIAISON Cleaning Kit (código 310990). LIAISON Light Check (código 319101). LIAISON Wash/System Liquid (código 319100). LIAISON Waste Bags (código 450003). 5. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Sólo para uso diagnóstico in vitro. Todos los materiales utilizados para la fabricación de los componentes de este kit se han analizado y se han encontrado no reactivos para la presencia de HBsAg, anti-hcv, anti-hiv-1 y anti-hiv-2. Sin embargo, visto que ningún método de análisis puede asegurar que los agentes patógenos estén ausentes, todo el material de origen humano se deberá considerar potencialmente infeccioso y manipularlo como tal. 6. NORMAS DE SEGURIDAD No coma, beba, fume o se maquille durante la ejecución del ensayo. No pipetee las soluciones con la boca. Evite el contacto directo con el material potencialmente infeccioso usando batas de laboratorio, gafas de protección y guantes desechables. Lávese cuidadosamente las manos al terminar el ensayo. Evite salpicaduras o formación de aerosoles. En caso de que esto sucediera, cada gota de reactivo se debe eliminar con una solución de hipoclorito sódico al 5% y el medio utilizado se deberá tratar como material residuo potencialmente infeccioso. Todas las muestras, los reactivos biológicos del kit y los materiales usados para efectuar el ensayo se deben considerar capaces de transmitir agentes infecciosos; por lo tanto los residuos se deberán eliminar de acuerdo con las reglamentaciones de las agencias autorizadas que tengan jurisdicción sobre el laboratorio, y con las normativas de cada país. El material desechable deberá ser incinerado; los residuos líquidos deberán ser descontaminados con una solución de hipoclorito sódico a una concentración final del 5% durante media hora como mínimo. Cualquier material que pueda ser reutilizado deberá ser tratado en autoclave con un tratamiento de exceso (overkill) (USP 24, 2000, p. 2143). Generalmente se considera que una hora a 121 C es un tiempo de esterilización adecuado; sin embargo se recomienda a cada usuario que verifique la eficacia del ciclo de descontaminación mediante una validación inicial y el uso rutinario de indicadores biológicos. Los reactivos que contienen ProClin 300 se clasifican como irritantes según las Directivas Europeas aplicables: R 43 - Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel. S 24 - Evítese el contacto con la piel. S 37 - Úsense guantes adecuados. S 60 - Elimínense el producto y su recipiente como residuos peligrosos. DHEA-es.fm 40 March 29, 2010 11:23 am

7. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS INTEGRAL DE REACTIVOS Antes de quitar la protección de los contenedores, es esencial agitar horizontalmente el integral de reactivos con delicadeza y sumo cuidado. Evite la formación de espuma. Elimine la protección de los contenedores y gire hacia adelante y hacia atrás la ruedecilla dentada situada por debajo del contenedor de las partículas magnéticas hasta que la suspensión adopte una coloración morena. Este procedimiento da inicio a la resuspensión de las partículas magnéticas. Antes de utilizar el producto, inspeccione el contenedor visualmente para confirmar que todas las partículas magnéticas que pudiera haber depositadas vuelven a estar en suspensión. Repita el procedimiento las veces que sea necesario hasta que todas las partículas magnéticas estén en suspensión. Si la resuspensión de las partículas magnéticas no es adecuada, póngase en contacto con el representante local de DiaSorin. Seque con sumo cuidado la superficie de cada pared para eliminar el líquido residual. Coloque el integral de reactivos en el área de los reactivos del instrumento con la etiqueta de los códigos de barras situada a la izquierda y déjelo agitar durante 30 minutos antes del uso. Durante este tiempo las partículas magnéticas serán mantenidas en agitación automáticamente para garantizar una resuspensión completa. Hágase referencia al manual operativo del instrumento para cargar las muestras e iniciar el ensayo. CONTROLES Hágase referencia a las instrucciones del juego de controles LIAISON DHEA-S para preparar y manipular los controles. 8. CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD DEL INTEGRAL DE REACTIVOS Sellado: Estable a 2-8 C hasta la fecha de caducidad. Abierto en el instrumento o a 2-8 C: Estabilidad mínima cuatro semanas. Después de este intervalo de tiempo, se puede seguir usando el integral de reactivos, siempre que los controles permanezcan dentro de los límites esperados. Use siempre el mismo instrumento LIAISON para un integral de reactivos ya abierto. Use las gradillas suministradas con el instrumento LIAISON para la conservación del integral de reactivos en posición vertical. No congele. Mantenga el integral de reactivos en posición vertical durante la conservación para facilitar la resuspensión de las partículas magnéticas. Mantenga protegido de la luz directa. 9. RECOGIDA Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS El ensayo se puede efectuar en muestras de suero o plasma humano. Se pueden utilizar anticoagulantes como el citrato, el EDTA y la heparina. Recoja la sangre extraída por punción en vena en tubos de ensayo sin aditivos y déjela coagular según los procedimientos establecidos por el laboratorio, asegurándose de que la muestra se mantenga íntegra. Separe el suero del coágulo lo antes posible. La presencia de hemólisis puede indicar una manipulación incorrecta de las muestras durante la recogida o la preparación de las mismas. Si el ensayo se lleva a cabo de los siete días sucesivos a la recogida, las muestras se pueden conservar a 2-8 C. En caso contrario, se deben subdividir en alícuotas congeladas a 20 C o a temperaturas inferiores. Diez muestras se han sometido a cuatro ciclos de congelación y descongelación. Los resultados no han presentado diferencias significativas. Antes de realizar el ensayo descongele con precaución, agite las muestras descongeladas y elimine las burbujas de aire que pudiera haber. No use muestras fuertemente hemolizadas o lipémicas, ni muestras que presenten material suspendido o evidente contaminación microbiana. No use muestras coaguladas. Se recomienda analizar las muestras inmediatamente después de haberlas colocado en el instrumento. El volumen mínimo de muestra necesario para una determinación es 160 µl (10 µl de muestra + 150 µl de volumen muerto). 10. CALIBRACIÓN El ensayo de los calibradores contenidos en el integral de reactivos permite ajustar la curva predefinida memorizada por el fabricante (curva patrón) en el instrumento como se indica en los códigos de barras que aparecen en la etiqueta del integral de reactivos. Con una solución de los calibradores es posible realizar 12 calibraciones. El instrumento se debe calibrar en triplicado cada vez que se verifique una de las siguientes condiciones: Se usa un nuevo lote de reactivos starter. La calibración anterior fue realizada más de una semana antes. Se usa un nuevo lote de integral de reactivos. El instrumento ha sufrido una intervención de asistencia técnica. Los valores de los controles están fuera de los rangos esperados. 11. PROCEDIMIENTO OPERATIVO Para obtener prestaciones analíticas ideales hay que respetar estrictamente las instrucciones del manual operativo del instrumento. Cada parámetro del test es identificado mediante el código de barras en la etiqueta del integral de reactivos. En caso de que el lector del código de barras no funcione correctamente, se deberán introducir manualmente los datos convenientes. Hágase referencia al manual operativo del instrumento para una información más detallada. El instrumento realiza las operaciones siguientes: 10 µl Calibradores, controles o muestras. +20µL Partículas magnéticas recubiertas. +200µL Conjugado. 21 minutos Incubación seguida por un ciclo de lavado. 3 segundos Medición. DHEA-es.fm 41 March 29, 2010 11:23 am

12. CONTROL DE CALIDAD El control de calidad se debe realizar analizando los controles LIAISON DHEA-S (a) por lo menos una vez por cada día de trabajo, (b) cuando se usa un nuevo integral de reactivos, (c) cuando se calibra el kit, (d) cuando se usa un nuevo lote de reactivos starter, (e) cuando se determina la adecuación de las prestaciones del integral de reactivos abierto con más de cuatro semanas de anterioridad, o según las disposiciones legislativas y las reglamentaciones vigentes en cada país. Atención: Los controles LIAISON se deben analizar individualmente para evaluar las prestaciones del test. Los valores de los controles tienen que estar comprendidos entre los rangos esperados: cada vez que uno o ambos valores estén fuera de los rangos esperados habrá que volver a efectuar la calibración y probar de nuevo los controles. Si los valores experimentales de los controles estén de nuevo fuera de los rangos predefinidos después de la calibración, habrá que repetir el test usando un frasco de control no abierto. Si los valores de los controles estén fuera de los rangos esperados, los resultados de las muestras no deben ser notificados. Las prestaciones de otros controles se deben evaluar para asegurar su compatibilidad con este test antes del uso. Por lo tanto es indispensable establecer los intervalos de los valores de los materiales usados para el control de calidad. 13. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS El instrumento calcula automáticamente las concentraciones de DHEA-S de las muestras. Hágase referencia al manual operativo del instrumento para una información más detallada. Intervalo de medición: El ensayo mide las concentraciones de DHEA-S de 1,0 hasta 750. El valor más bajo que puede ser reportado es 1,0, basado sobre la mínima dosis de analito que el test puede detectar (ver 15.6). El valor más alto que puede ser reportado sin dilución de la muestra es 750. Los valores de las muestras con concentraciones de DHEA-S superiores al intervalo de medición pueden considerarse superiores a 750. En alternativa las muestras pueden ser pre-diluidas mediante la función Dilute del instrumento LIAISON y reanalizadas. El factor de dilución aconsejado es 1:10. Los resultados se multiplicarán automáticamente por el factor de dilución para obtener los niveles de DHEA-S de las muestras no diluidas. El volumen de diluyente de muestras disponible en el integral de reactivos permite realizar la pre-dilución de 74 muestras. Estándar de referencia: El ensayo está calibrado según una preparación estándar interna de DHEA-S. Las concentraciones nominales de la preparación estándar han sido asignadas utilizando un método no isotópico seleccionado como test de referencia. Valores esperados: Para determinar el intervalo de referencia de los valores esperados se han realizado dos estudios. Los resultados indicados abajo se refieren a los grupos de pacientes tomados en consideración; no se trata de indicaciones garantizadas, sino de datos indicativos. Cada laboratorio debe establecer sus propios intervalos de referencia para la población tomada en consideración. El estudio 1 se ha realizado en muestras de suero recogidas de 220 niños y adolescentes aparentemente sanos, de edad comprendida entre 3 y 18 años. Los resultados del estudio, subdivididos por grupos de edad están indicados en la tabla que sigue. Edad (años) Número de sujetos Hembras (total, n = 130) Varones (total, n = 90) 5 percentil () 95 percentil () Número de sujetos 5 percentil () 95 percentil () 3-9 52 2,1 79,0 36 1,7 61,8 9-18 78 16,0 189,6 54 21,0 397,7 El estudio 2 se ha realizado en muestras de suero recogidas de 462 sujetos adultos aparentemente sanos, de edad comprendida entre 20 y 66 años. Los resultados del estudio, subdivididos por grupos de edad están indicados en la tabla que sigue. Edad (años) Número de sujetos Mujeres (total, n = 205) Hombres (total, n = 257) 5 percentil () 95 percentil () Número de sujetos 5 percentil () 95 percentil () 20-29 39 80,2 339,5 29 161,2 561,6 30-39 36 58,7 227,0 51 124,5 482,7 40-49 65 46,7 247,6 82 96,9 391,5 50-59 55 33,0 212,8 80 59,7 307,9 > 60 10 61,6 124,1 15 40,8 405,4 DHEA-es.fm 42 March 29, 2010 11:23 am

14. LIMITACIONES DEL ENSAYO Los reactivos del kit deben usarse sólo en el sistema LIAISON. Los componentes individuales del integral de reactivos no deben ser separados del integral. El kit no debe usarse después de la fecha de caducidad que figura en la etiqueta externa. Para obtener resultados fiables es necesario atenerse estrictamente a las instrucciones de uso y poseer una adecuada técnica manual. La contaminación bacteriana de las muestras o la inactivación mediante calentamiento pueden modificar los resultados del análisis. Los resultados del test se muestran de manera cuantitativa. Sin embargo, el diagnóstico de una patología se debe formular en base al cuadro clínico del paciente, con otras pruebas clínicas y con la opinión del médico. Cada decisión terapéutica debe ser tomada caso por caso. El kit LIAISON DHEA-S se ha puesto a punto para la determinación del analito de forma intacta e inalterada. La degradación de la molécula puede influir en los resultados finales. Aunque estén presentes agentes capaces de neutralizar los anticuerpos anti-ratón (HAMA, human anti-mouse antibodies), concentraciones de HAMA extremadamente elevadas algunas veces pueden influir en los resultados del ensayo. No se han estudiado las interferencias debidas a la administración de fármacos. Se han obtenido muestras de suero, de plasma obtenido con EDTA, con heparina y con citrato después de la recogida de la sangre de 40 sujetos para investigar el efecto de diversos tipos de muestra sobre los resultados de la DHEA-S. Las alícuotas de suero y de plasma para cada muestra de sangre han sido analizadas durante una sola sesión analítica. Se han observado las correlaciones siguientes, obtenidas con el análisis de la regresión lineal. Resultado con plasma-edta = 0,921 x resultado con suero + 3,682. Coeficiente de correlación r = 0,990. Resultado con plasma-heparina = 0,988 x resultado con suero + 3,659. Coeficiente de correlación r = 0,986. Resultado con plasma-citrato = 0,814 x resultado con suero + 14,886. Coeficiente de correlación r = 0,982. Las prestaciones metodológicas del kit se han estudiado en las muestras de suero. 15. PRESTACIONES METODOLÓGICAS DEL KIT 15.1. Especificidad analítica La especificidad analítica se define como la capacidad que tiene el test para detectar exactamente el analito ante la presencia de factores potencialmente interferentes en la matriz de la muestra (por ejemplo, hemólisis, lipemia, bilirrubinemia). Interferencias. Estudios controlados sobre los factores potencialmente interferentes han demostrado que las prestaciones del test no están influenciadas por las concentraciones de bilirrubina hasta 20 mg/dl, de hemoglobina hasta 1000 mg/dl o de triglicéridos hasta 3000 mg/dl. Reacciones cruzadas. Los datos de especificidad del anticuerpo empleado en este kit están expresados según Abraham como la relación entre concentración de DHEA-S y concentración de la hormona que provoca reacciones cruzadas al 50% de inhibición de la máxima capacidad de enlace. La presencia de las siguientes moléculas que pueden ocasionar, potencialmente, reacciones cruzadas muestra interferencias en el ensayo como se ilustra en la tabla que sigue. Estas interferencias, sin embargo, tienen una importancia clínica limitada. El test se ha realizado según las líneas guía del Instituto para Estándares Clínicos y de Laboratorio (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI, USA), Documento N. EP07-A2. Molécula Cantidad añadida a la muestra % Reactividad cruzada Androstenodiona 3.000 0,02% DHEA 3.000 0,01% Androsterona 5.000 0,02% Testosterona 5.000 0,02% Sulfato de androsterona 10.000 0,23% Glucuronido de androsterona 15.000 no determinable Aldosterona 15.000 no determinable Estradiol 15.000 no determinable Estriol 15.000 no determinable Estrona 15.000 no determinable Progesterona 15.000 no determinable Sulfato de estrona 15.000 0,02% Cortisol 30.000 no determinable DHEA-es.fm 43 March 29, 2010 11:23 am

15.2. Precisión La repetibilidad y la reproducibilidad del ensayo (es decir las variaciones intra-ensayo e inter-ensayo) han sido determinadas utilizando muestras en diferentes concentraciones de analito. Los resultados se refieren a los grupos de pacientes tomados en consideración; no se trata de prestaciones garantizadas porque pueden existir diferencias entre los diferentes laboratorios. Repetibilidad. Para evaluar la repetibilidad se han analizado veinte replicados en la misma sesión analítica en el laboratorio donde se desarrolló el kit. Repetibilidad A B C D E F G Control 1 Control 2 20 20 Media () 7,4 18,6 36,0 85,0 156,6 386,1 498,7 42,3 169,3 Desviación estándar () 0,4 0,7 1,1 2,6 15,1 38,9 40,5 2,0 5,9 Coeficiente de variación (%) 5,2 3,5 3,0 3,0 9,6 10,1 8,1 4,8 3,5 Valor mínimo () 6,3 16,4 34,5 80,2 96,2 326,1 411,1 37,2 150,8 Valor máximo () 7,8 19,5 38,3 92,0 170,9 459,0 585,0 45,5 180,2 Reproducibilidad. Para evaluar la reproducibilidad se han analizado veinte replicados en días diferentes (una o dos sesiones analíticas al día) utilizando tres lotes diferentes de integral. Los ensayos se realizaron en dos sitios, en el laboratorio donde se desarrolló el kit (sitio 1) y en un laboratorio independiente (sitio 2) utilizando los mismos instrumentos. Reproducibilidad - Sitio 1 H I J K L Control 1 Control 2 LOTE Nr. 01 Media () 21,7 75,2 139,0 315,8 476,0 49,4 184,7 Desviación estándar () 1,4 4,2 7,7 20,2 56,6 2,8 11,8 Coeficiente de variación (%) 6,5 5,5 5,5 6,4 11,9 5,7 6,4 Valor mínimo () 19,3 66,4 120,4 286,2 396,5 43,7 149,3 Valor máximo () 24,6 84,1 152,3 356,5 589,4 55,5 208,9 LOTE Nr. 02 Media () 22,7 76,2 139,5 305,9 526,1 50,1 188,0 Desviación estándar () 1,8 4,5 7,3 21,8 45,9 2,1 7,2 Coeficiente de variación (%) 8,1 5,9 5,3 7,1 8,7 4,2 3,8 Valor mínimo () 19,3 68,5 123,3 257,2 413,9 46,4 173,6 Valor máximo () 25,6 84,2 153,1 348,1 607,0 55,6 207,4 LOTE Nr. 03 Media () 21,1 71,8 134,2 296,5 477,4 48,5 180,0 Desviación estándar () 1,1 3,8 4,8 17,0 39,8 3,2 7,0 Coeficiente de variación (%) 5,1 5,2 3,6 5,7 8,3 6,6 3,9 Valor mínimo () 19,5 64,1 126,3 271,5 396,9 42,5 165,2 Valor máximo () 22,9 78,4 143,0 323,1 544,6 54,4 193,2 Coeficiente de variación inter-lotes (%) 3,8 3,1 2,1 3,2 5,8 1,6 2,2 Reproducibilidad - Sitio 2 H I J K L Control 1 Control 2 LOTE Nr. 01 Media () 23,0 69,1 128,9 282,2 471,4 47,4 188,9 Desviación estándar () 3,2 7,8 9,7 41,8 67,5 3,9 15,9 Coeficiente de variación (%) 13,8 11,3 7,6 14,8 14,3 8,1 8,4 Valor mínimo () 18,5 51,3 113,0 209,2 391,8 40,8 173,2 Valor máximo () 30,2 82,6 150,1 369,3 639,4 55,9 233,2 LOTE Nr. 02 Media () 22,9 72,1 130,9 266,8 528,1 50,6 194,5 Desviación estándar () 3,3 7,1 11,5 42,6 56,1 5,1 11,0 Coeficiente de variación (%) 14,3 9,9 8,8 16,0 10,6 10,1 5,7 Valor mínimo () 19,7 61,3 109,2 187,4 451,4 41,6 167,6 Valor máximo () 32,1 86,8 154,9 347,4 674,2 62,5 210,7 LOTE Nr. 03 Media () 20,5 64,9 119,0 247,6 471,6 44,9 177,3 Desviación estándar () 1,4 5,8 7,8 29,2 76,7 2,8 12,9 Coeficiente de variación (%) 6,8 9,0 6,5 11,8 16,3 6,3 7,3 Valor mínimo () 18,0 56,0 104,7 200,5 349,8 39,5 160,1 Valor máximo () 23,7 75,6 131,8 310,6 628,5 49,3 215,5 Coeficiente de variación inter-lotes (%) 6,6 5,3 5,0 6,5 6,7 6,1 4,7 DHEA-es.fm 44 March 29, 2010 11:23 am

15.3. Linealidad con el test de dilución Se han analizado diluciones en serie de forma manual de dos muestras de concentración elevada de DHEA-S tanto no diluidas, como después de dilución con el diluyente de muestras. Las concentraciones medidas de DHEA-S obtenidas en función de las concentraciones esperadas han sido analizadas con la regresión lineal. Los coeficientes de correlación (r) estaban comprendidos entre 0,995 y 0,998. Dilución esperada, medida, % Recuperación Dilución esperada, medida, % Recuperación no diluido 411,4 no diluido 393,1 1:2 205,7 199,4 96,9 1:2 196,6 198,0 100,7 1:4 102,9 117,7 114,4 1:4 98,3 109,5 111,4 1:8 51,4 61,8 120,2 1:8 49,1 56,6 115,2 1:16 25,7 29,2 113,6 1:16 24,6 27,6 112,3 1:32 12,9 14,8 115,1 1:32 12,3 13,3 108,3 media 112,0 media 109,6 15.4. Veracidad con el test de recuperación Se han analizado dos grupos de muestras, cada uno de ellos formado por una muestra con concentración de DHEA-S elevada y por una muestra con concentración de DHEA-S baja o normal mezcladas en proporción 1:5, 1:2, 1:1, 2:1 y 5:1 (grupo 1: muestras X y Y - grupo 2: muestras W y Z). Los porcentajes de recuperación han sido determinados por los resultados de las muestras no diluidas. Las concentraciones medidas de DHEA-S obtenidas en función de las concentraciones esperadas han sido analizadas con la regresión lineal. Los coeficientes de correlación (r) estaban comprendidos entre 0,985 y 1,000. Grupo 1 esperada, medida, % Recuperación Grupo 2 esperada, medida, % Recuperación X no diluido 31,6 W no diluido 71,8 5:1 75,1 72,8 97,0 5:1 92,4 96,9 104,9 2:1 118,6 118,7 100,1 2:1 112,9 121,7 107,8 1:1 162,1 158,7 97,9 1:1 133,5 141,9 106,3 1:2 205,5 202,7 98,6 1:2 154,0 160,2 104,0 1:5 249,0 247,8 99,5 1:5 174,6 167,6 96,0 Y no diluido 292,5 Z no diluido 195,1 15.5. Efecto arrastre El efecto arrastre (carryover) ha sido estudiado analizando dos muestras de suero tanto antes como después de cuatro muestras con concentraciones siempre mayores de DHEA-S del orden de las que se hallan normalmente en las condiciones patológicas de exceso de secreción. Las muestras usadas para evaluar el efecto arrastre fueron un suero con concentraciones naturalmente muy bajas de DHEA-S y un suero sin esteroides. Los resultados obtenidos permiten demostrar que no se verifica efecto arrastre significativo utilizando el instrumento LIAISON. 15.6. Sensibilidad analítica y funcional La sensibilidad analítica (límite de detección) se define como la mínima dosis de analito que el test puede detectar, que puede ser distinta del punto cero. La sensibilidad analítica, definida como la mínima dosis de analito que el test puede detectar, que puede ser distinta del punto cero, oscila entre 0,4 y 0,7 (determinada con varias sesiones analíticas, lotes de kit e instrumentos). La sensibilidad analítica, calculada según las líneas guía del Instituto para Estándares Clínicos y de Laboratorio (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI, USA), Documento N. EP17-A, oscila entre 1,0 y 2,5 (determinada con varias sesiones analíticas, lotes de kit e instrumentos). La sensibilidad funcional, definida como la concentración de analito a la que el coeficiente de variación inter-ensayo es superior al 20%, oscila entre 1,5 y 5,4 (determinada con varias sesiones analíticas, lotes de kit e instrumentos). DHEA-es.fm 45 March 29, 2010 11:23 am

15.7. Comparación con otros métodos Se han comparado los resultados del test LIAISON DHEA-S con los de un método no isotópico seleccionado como test de referencia en 500 muestras. Las muestras estudiadas eran las mismas utilizadas para definir el intervalo de los valores esperados. Se ha obtenido la siguiente correlación: LIAISON DHEA-S = 1,042 x test de referencia + 0,943. Coeficiente de correlación r = 0,944 (n = 500). 700 600 LIAISON DHEA-S, LIAISON DHEA-S ( g/dl) 500 400 300 200 100 0 0 100 200 300 400 500 600 700 Test Ref DHEA-S erence DHEA-S de referencia, method () DHEA-es.fm 46 March 29, 2010 11:23 am

LIAISON Control DHEA-S (310431) 1. FINALIDAD DEL ENSAYO Los controles LIAISON DHEA-S (niveles 1 y 2) deben ser usados en los ensayos de quimioluminiscencia (CLIA) LIAISON para verificar la fiabilidad de los ensayos. Las prestaciones metodológicas de los controles LIAISON DHEA-S no son definidas con otros ensayos o instrumentos automáticos. 2. MATERIALES SUMINISTRADOS Control de nivel 1 (2 x 1 ml) Suero humano que contiene niveles bajos de DHEA-S, 0,2% ProClin 300, conservantes. Control de nivel 2 (2 x 1 ml) Suero humano que contiene niveles altos de DHEA-S, 0,2% ProClin 300, conservantes y un colorante azul inactivo. Todos los reactivos se suministran listos para su uso. El intervalo de las concentraciones para cada control está impreso en el certificado de análisis e indica los límites definidos por DiaSorin para los valores de los controles obtenidos con test fiables. Cada laboratorio es responsable de adoptar límites diferentes para cumplir exigencias específicas. 3. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Sólo para uso diagnóstico in vitro. Los controles no son específicos para lote de kit. Se pueden intercambiar también con lotes diferentes de integral de reactivos. Todos los materiales utilizados para la fabricación de los componentes de este kit se han analizado y se han encontrado no reactivos para la presencia de HBsAg, anti-hcv, anti-hiv-1 y anti-hiv-2. Sin embargo, visto que ningún método de análisis puede asegurar que los agentes patógenos estén ausentes, todo el material de origen humano se deberá considerar potencialmente infeccioso y manipularlo como tal. Observe las precauciones necesarias para la manipulación de los reactivos de laboratorio. Los residuos deben eliminarse de acuerdo con la reglamentación local. 4. NORMAS DE SEGURIDAD No coma, beba, fume o se maquille durante la ejecución del ensayo. No pipetee las soluciones con la boca. Evite el contacto directo con el material potencialmente infeccioso usando batas de laboratorio, gafas de protección y guantes desechables. Lávese cuidadosamente las manos al terminar el ensayo. Evite salpicaduras o formación de aerosoles. En caso de que esto sucediera, cada gota de reactivo se debe eliminar con una solución de hipoclorito sódico al 5% y el medio utilizado se deberá tratar como material residuo potencialmente infeccioso. Todas las muestras, los reactivos biológicos del kit y los materiales usados para efectuar el ensayo se deben considerar capaces de transmitir agentes infecciosos; por lo tanto los residuos se deberán eliminar de acuerdo con las reglamentaciones de las agencias autorizadas que tengan jurisdicción sobre el laboratorio, y con las normativas de cada país. Los reactivos que contienen ProClin 300 se clasifican como irritantes según las Directivas Europeas aplicables: R 43 - Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel. S 24 - Evítese el contacto con la piel. S 37 - Úsense guantes adecuados. S 60 - Elimínense el producto y su recipiente como residuos peligrosos. 5. CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD No deje los controles a temperatura ambiente durante más tiempo del necesario para el uso instrumental. En el momento de su llegada, los controles se deben mantener a 2-8 C en posición vertical para evitar el contacto de la solución con la tapa del frasco. No congele. Si los controles se conservan sellados y en posición vertical, ellos son estables a 2-8 C hasta la fecha de caducidad. Después de la apertura, los controles son estables durante cuatro semanas si se conservan refrigerados a 2-8 C entre dos usos sucesivos. Evite la contaminación bacteriana de los controles. Los controles no se deben usar pasada la fecha de caducidad indicada en las etiquetas de los frascos. 6. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS Coloque los frascos de los controles en las gradillas C del instrumento LIAISON. Con una solución de control es posible realizar por lo menos 60 test. El volumen mínimo de control necesario es 410 µl (10 µl de control + 400 µl de volumen muerto). En el momento del uso, acondicione los controles a temperatura ambiente (20-25 C) antes de la apertura de los frascos y déjelos en el área de las muestras del instrumento sólo durante el tiempo requerido para realizar el test de control de calidad. Después del uso, tape los frascos lo antes posible y manténgalos a 2-8 C en posición vertical. Durante la manipulación de los controles, adopte las precauciones necesarias para evitar la contaminación microbiana. 7. MANIPULACIÓN Asegúrese de que no se coloquen uno tras otro en las gradillas del instrumento ni que se analizan en secuencia dos controles idénticos (nivel 1 ó 2). Hágase referencia al manual operativo del instrumento LIAISON para una información más detallada. DHEA-es.fm 47 March 29, 2010 11:23 am

8. VALORES ESPERADOS Los intervalos de las concentraciones de DHEA-S de los controles están indicados en el certificado de análisis. Estos se han establecido considerando la variabilidad de las sesiones analíticas respecto a la curva predefinida memorizada por el fabricante, a fines de garantizar la precisión de los resultados analíticos y obtener indicaciones sobre la estabilidad y el deterioro de los reactivos. Si los valores experimentales de los controles están repetidamente fuera de los intervalos predefinidos, con mucha probabilidad, el ensayo se ha llevado a cabo de forma incorrecta. 200/007-919, E - 02/2010 DHEA-es.fm 48 March 29, 2010 11:23 am