9 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA Número de publicación: 2 26 49 Int. Cl.: C07K 4/43 (06.0) A6K 38/7 (06.0) A0N 63/02 (06.0) 2 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: 0980332.9 86 Fecha de presentación : 03.09.0 87 Número de publicación de la solicitud: 3747 87 Fecha de publicación de la solicitud: 04.06.03 4 Título: Derivados de la maurotoxina, Pi y HsTx. Prioridad: 04.09.00 GB 002639 06..00 GB 002438 73 Titular/es: Cellpep S.A. 6, rue de la Banque 7002 Paris, FR 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: 6..06 72 Inventor/es: Sabatier, Jean-Marc; Mabrouk, Kamel y Rochat, Hervé 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: 6..06 74 Agente: Manresa Val, Manuel ES 2 26 49 T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99. del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 7 2807 Madrid
ES 2 26 49 T3 Derivados de la maurotoxina, Pi y HsTx. DESCRIPCIÓN 2 3 4 0 6 La invención se refiere a derivados de la maurotoxina, una toxina de cadena corta de escorpión, que actúa sobre los canales de K + y que se encuentra entrecruzada por cuatro puentes disulfuro. Los derivados de la invención pueden resultar útiles en el tratamiento de trastornos neurológicos, comprendiendo los trastornos neurológicos inmunitarios, asociados a su acción sobre la modulación o el bloqueo de canales de K + específicos, subtipos activados por el Ca 2+ y/o dependientes del voltaje. La invención comprende también composiciones farmacéuticas que contienen los derivados de la invención. La maurotoxina (MTX), una toxina obtenida a partir del veneno del escorpión tunecino de la familia de los chactidae, Scorpio maurus palmatus, consiste en un péptido 34-mero entrecruzado por cuatro puentes disulfuro. La secuencia de aminoácidos de la MTX es VSCTGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGC-NH 2 [SEC. ID Nº. ]. La MTX pertenece a una familia distinta de las toxinas de cadena corta de escorpión con un número de aminoácidos inferior a, que resultan activas sobre diversos subtipos de canales de potasio (canales Kv y KCa). A diferencia de la mayoría de las toxinas de cadena corta de escorpión que actúan sobre los canales de K +, la presente familia puede distinguirse por la presencia de un puente disulfuro adicional (cuatro en vez de los tres presente habitualmente en dichas toxinas). Dicha clase estructural comprende también la Pi [SEC. ID NO. 2] y la HsTx [SEC. ID NO. 3] obtenidas de los venenos de los escorpiones Pandinus imperator y Heterometrus spinnifer, respectivamente. Dichas toxinas comparten entre un 3 y un 68% de identidad en la secuencia con la MTX pero presentan unas selectividades farmacológicas distintas. Por ejemplo, la MTX y la Pi son activas en determinados canales de K + activados por el Ca 2+, por ejemplo los canales SK sensibles a la apamina, mientras que se ha descrito que la HsTx resulta inactiva en dichos tipos de canal. Asimismo, se ha descubierto que la MTX es activa en los canales Kv.3 de rata a diferencia de la Pi sintética. Resulta interesante que la MTX difiera estructuralmente de la Pi y la HsTx, pero también es distinta de otras tres toxinas clásicas de escorpión con enlaces disulfuro, debido a su pauta única de puentes disulfuro. En las toxinas con tres puentes disulfuro, los pares de hemicistina son del tipo C-C4, C2-C y C3-C6 (por ejemplo caribdotoxina, P0, agitoxina 2, leiurotoxina ). En las toxinas de cadena corta con cuatro puentes disulfuro, dicha pauta se ve alterada por la inserción de dos hemicistinas adicionales en la secuencia de aminoácidos, una de ellas situada a continuación de C3 y la otra a continuación de C6. Como resultado de ellos, se han descubierto experimentalmente dos nuevas pautas de puentes disulfuro en función de la toxina: (i) un patrón del tipo C-C, C2-C6, C3-C7 y C4-C8 tanto en la Pi como en la HsTx (que corresponde a una organización similar a la observada en las toxinas con tres puentes disulfuro), y (ii) una pauta poco común del tipo C-C, C2-C6, C3-C4 y C7-C8 en la MTX. Dichas dos pautas poseen en común los dos primeros puentes disulfuro pero difieren en los dos disulfuros restantes. Aunque las diferencias en las propiedades farmacológicas entre las toxinas de cadena corta con cuatro puentes disulfuro dependen obviamente de sus distintas secuencias de aminoácidos, resulta también posible que los cambios en los pares de hemicistinas puedan contribuir a alteraciones confomacionales considerables o aisladas y al reposicionamento de aminoácidos clave que se encuentran implicados en la selectividad de la toxina. A nivel farmacológico, la MTX presenta una especificidad aumentada poco común, siendo activa - en unos valores de concentración picomolar o nanomolar - tanto en los canales de K + activados por el Ca 2+, por ejemplo, canales de K + activados por el Ca 2+ (SK) sensibles a la apamina con una conductancia reducida, como en diversos subtipos de canales de K + dependientes del voltaje (Kv), comprendiendo los Kv.2. En J. Biol Chem; Vol. 27, nº. 8, p. 3-362, 00, Fajloun et al han descrito un derivado de la MTX con tres puentes disulfuro en vez de cuatro, formado al sustituir los residuos de α-aminobutirato (Abu) por residuos de Cys situados en las posiciones 9 y 34 (que corresponden numéricamente a las posiciones C4 y C8). Dicho derivado adopta la estructura α/β ahora con los pares de hemicistina convencionales uniendo C-C, C2-C6 y C3-C7 pero continúa siendo letal por inyección intracerebroventricular en ratones (DL 0 : 0,2 µg/ratón). La invención proporciona un derivado de la maurotoxina en el que uno o dos aminoácidos de maurotoxina han sido sustituidos por distintos aminoácidos provocando que la pauta natural de puentes disulfuro (Cys3-Cys24, Cys9- Cys29, Cys3-Cys9, Cys3 -Cys34) se vea cambiada a Cys3-Cys24, Cys9-Cys29, Cys3-Cys3, Cys9-Cys34. Dichos derivados presentan un perfil farmacológico nuevo, muy potente y más selectivo. Si ninguno de los aminoácidos de las posiciones 32 y 33 es un residuo Gly o un residuo Pro, el plegamiento se ve alterado de tal modo que el derivado de la MTX adopta la convencional C-C, C2-C6, C3-C7 y C4-C8 de la Pi y la HsTx. En particular, la sustitución del residuo Gly de la posición 33 por un residuo Ala, formando [A33]-MTX [SEC. ID Nº. 4], resulta eficaz. La sustitución de la Arg4 y/o la Lys por Gln para proporcionar el péptido [Q4]-MTX [SEC. ID Nº. ], el péptido [Q]-MTX [SEC. ID Nº. 6] o el péptido [Q 4, Q ]-MTX [SEC. ID Nº. 7] provoca también los pares de hemicistina entre Cys3-Cys24, Cys9-Cys29, Cys3-Cys3 y Cys9-Cys34. El péptido [Q]- MTX en particular resultó.000 veces más potente que el péptido [Abu9,9,29,34]-MTX en el canal dependiente del voltaje Kv.2 en los mamíferos (CI 0 = 47 pm). A diferencia de la MTX natural que resulta letal en los ratones C7/BL6 (DL 0 = 4 mcg/kg), los derivados de la MTX tales como el péptido [Q]-MTX nunca resultan letales ni tóxicos cuando se inyectan por vía intracerebroventricular en dichos ratones en unas concentraciones activas. Los derivados de la MTX de la invención resultan por lo tanto de valor terapéutico potencial en el tratamiento de enfermedades de mamíferos (entre ellos el ser humano) que se encuentran asociadas a alteraciones en el funcionamiento de los subtipos de los canales de Kv activados por 2
ES 2 26 49 T3 el Ca 2+ y/o dependientes del voltaje. Dichas enfermedades comprenden trastornos inmunitarios y/o neurológicos tales como la esclerosis múltiple, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer, de las que se cree que se encuentran asociadas a alteraciones en el funcionamiento de el/los subtipo(s) de los canales de K + activados por el Ca 2+ y/o dependientes del voltaje. La propagación del impulso axónico garantiza una transmisión continua de las señales nerviosas hasta objetivos lejanos. En varias neuropatías, la conducción nerviosa se ve ralentizada o bloqueada. Ello puede asociarse a la alteración o a cambios funcionales de las fibras mielínicas (la desmielinización o la alteración de las propiedades de la membrana en los nódulos de Ranvier). Entre dichas neuropatías se encuentra la esclerosis múltiple (sistema nervioso central; SNC) y el síndrome de Guillain-Barré (sistema nervioso periférico). Se admite actualmente que la alteración de la función axónica se encuentra relacionada con la presencia de canales de K + (Kv) dependientes del voltaje (existe una amplia distribución de los subtipos de canales Kv. y Kv.2 en los terminales nerviosos a lo largo del cerebro, mientras que los canales Kv - independientes de sus subtipos - se consideran ampliamente distribuidos, comprendiendo el sistema nervioso periférico), y posiblemente los canales de K + activados por el Ca 2+. En las neuropatías citadas anteriormente, los canales de K + activados por el Ca 2+ y los canales Kv se ven expuestos de un modo anormal a lesiones desmielinizantes o inflamatorias, o se sobreexpresan. Por lo tanto, los bloqueadores selectivos de los canales de K +, comprendiendo péptidos derivados de la MTX que actúan sobre los canales de K + activados por el Ca 2+ y/o que actúan sobre los Kv tales como el péptido [Q]-MTX presentan valor terapéutico potencial como tratamiento sintomático de la esclerosis múltiple y neuropatías relacionadas, así como en la utilización de fármacos inmunodepresores selectivos debido a su acción bloqueadora de los canales activados por el Ca 2+ y/o los canales Kv. Además, puede especularse que dichos bloqueadores peptídicos, en el SNC, pueden aumentar la liberación de transmisores en las vías afectadas por enfermedades neurodegenerativas progresivas tales como la enfermedad de Alzheimer. 2 3 4 0 6 3
ES 2 26 49 T3 REIVINDICACIONES 2. Derivado de la maurotoxina en el que uno o dos de los residuos de aminoácidos de la maurotoxina se encuentran sustituidos por distintos aminoácidos provocando que la pauta natural de puentes disulfuro (Cys3-Cys24, Cys9-Cys29, Cys3-Cys9, Cys3 -Cys34) se vea cambiada a Cys3-Cys24, Cys9-Cys29, Cys3-Cys3, Cys9-Cys34. 2. Derivado de la maurotoxina según la reivindicación en el que el aminoácido Arg de la posición 4 ha sido sustituido por un aminoácido Gln ([Q4]-MTX) [SEC. ID Nº. ]. 3. Derivado de la maurotoxina según la reivindicación en el que el aminoácido Lys de la posición ha sido sustituido por un aminoácido Gln ([Q]-MTX) [SEC. ID Nº. 6]. 4. Derivado de la maurotoxina según la reivindicación en el que el aminoácido Arg de la posición 4 y el aminoácido Lys de la posición han sido sustituidos por aminoácidos Gln ([Q4, Q]-MTX) [SEC. ID Nº. 7].. Derivado de la maurotoxina según la reivindicación en el que ninguno de los aminoácidos de las posiciones 32 y 33 es un aminoácido Gly o Pro. 6. Derivado de la maurotoxina según la reivindicación o la reivindicación en el que el aminoácido Gly de la posición 33 ha sido sustituido por un aminoácido Ala ([A33]-MTX) [SEC. ID Nº. 4]. 7. Composición farmacéutica que comprende un derivado de la maurotoxina según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en una mezcla con un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. 3 4 0 6 4
ES 2 26 49 T3 LISTA DE SECUENCIAS 2 <> Cellpep S.A. <> Maurotoxina. Derivados Pi y HsTx <> C39.007.02 <0> GB 002 639.0 < > 00-09-04 <0> GB 002438. < > 00--06 <> 7 <70> PatentIn version 3. <2> <2> 34 <22> PRT <23> Scorpio Maurus palmatus <0> Tyr Ala Pro Cys Arg 2 Lys Gln 3 4 0 6 <2> 2 <2> 3 <22> PRT <23> Scorpio Pandinus imperator <0> 2 Leu Val Lys Cys Gln Thr Gly Tyr Gly Cys 3 Arg Gly Thr Ser Asp Cys Pro Asn Ser Lys <2> 3 <2> 34 <22> PRT <23> Scorpio Heterometrus spinnifer <0> 3 Ala Ser Cys Arg Arg Cys Cys Gly Arg Pro Cys Cys Ile Asn Arg Met 2 Thr Pro Lys Asp Cys Pro Tyr Gly Lys Cys <2> 4 <2> 34 <22> PRT <23> Secuencia artificial <2> Gln Gln Cys Lys Cys Ala Asp Pro Cys Arg Met Asn Arg Lys Cys 2 Lys Glu Lys Cys Asn
<223> MTX con Ala en lugar de Gly en la posición 33 <0> 4 ES 2 26 49 T3 Ala Cys Tyr Ala Pro Cys Arg 2 Lys Gln 2 <2> <2> 34 <22> PRT <23> Secuencia artificial <2> <223> MTX con Gln en lugar de Arg en la posición 4 <0> Tyr Ala Pro Cys Gln 2 Lys Gln 3 4 <2> 6 <2> 34 <22> PRT <23> Secuencia artificial <2> <223> MTX con Gln en lugar de Lys en la posición <0> 6 Tyr Ala Pro Cys Arg 2 Gln Gln 0 6 <2> 7 <2> 34 <22> PRT <23> Secuencia artificial <2> <223> MTX con Gln-Gln en lugar de Arg-Lys en las posiciones 4- <0> 7 Tyr Ala Pro Cys Gln 2 Gln Gln 2