LAURA MILDRED LÓPEZ MARTÍNEZ 41012071. Tesis de Grado para Optar al Titulo de Ingeniera Ambiental y Sanitaria

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA (CL50-48) DEL CLORO EN EL EFLUENTE DE UNA INDUSTRIA TIPO MEDIANTE BIOENSAYOS DE TOXICIDAD ACUÁTICA UTILIZANDO DAPHNIA PULEX LAURA MILDRED LÓPEZ MARTÍNEZ 41012071 Tesis de Grado para Optar al Titulo de Ingeniera Ambiental y Sanitaria UNIVERSIDAD DE LA SALLE PROGRAMA DE INGENIERÍA AMBIENTAL Y SANITARIA BOGOTÁ D.C. 2009

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA (CL50-48) DEL CLORO EN EL EFLUENTE DE UNA INDUSTRIA TIPO MEDIANTE BIOENSAYOS DE TOXICIDAD ACUÁTICA UTILIZANDO DAPHNIA PULEX LAURA MILDRED LÓPEZ MARTÍNEZ 41012071 Tesis de Grado para Optar al Titulo de Ingeniera Ambiental y Sanitaria Director PEDRO MIGUEL ESCOBAR MALAVER QUÍMICO INDUSTRIAL UNIVERSIDAD DE LA SALLE PROGRAMA DE INGENIERÍA AMBIENTAL Y SANITARIA BOGOTÁ D.C. 2009

Nota de Aceptación Firma del Director de Tesis Firma del Jurado Firma del jurado

AGRADECIMIENTOS La autora expresa sus agradecimientos a: Pedro Miguel Escobar Malaver, Químico Industrial, director del proyecto de grado, por su amistad, colaboración, confianza, paciencia y ayuda durante el desarrollo de este proyecto. Camilo Hernando Guáqueta Rodríguez, Decano de la Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria unisalle, por su apoyo, entusiasmo y concejos apropiados durante toda la carrera. Yanneth Parra y Rosalina Gonzalez, profesoras de la Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria unisalle, por sus apreciables intervenciones, orientaciones y motivación en la realización de este proyecto. Roberto Balda, profesor de la Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria unisalle, por sus orientaciones y colaboración en la realización de este proyecto. Hoover Varón López, Giovanny Triana Bolaños y Máximo Caicedo Reyes, laboratoristas de química de la Universidad de La Salle. Oscar Fernando Contento, ingeniero químico y laboratorista de la Facultad de Ingeniera Ambiental y Sanitaria unisalle. Yasmin Maldonado y Angélica Castelblanco, por su apoyo, colaboración y amistad. A todos mis compañeros de Laboratorio de Bioensayos por su apoyo, paciencia, ayuda y comprensión durante el desarrollo de este proyecto.

A Dios y a la Virgen, por darme la oportunidad de vivir y hacer realidad uno de mis sueños. A mis padres, gracias por darme la vida, apoyo, amor, caricias, sonrisas, regaños y por el aliento que me dieron siempre para ir hacia delante en este camino. A mis hermanitos, por estar siempre en el momento justo. A Hugo Armando, que es mi apoyo incondicional y el que me da esa fuerza para salir adelante y nunca darme por vencida. Y a todas aquellas personas que hacen parte esencial de mi vida.

GLOSARIO Aclimatación: es el proceso por el cual un organismo se adapta fisiológicamente a las condiciones ambientales o de experimentación. Agua reconstituida: es agua destilada con adición de reactivos. El resultado es agua dulce sintética libre de contaminantes y con características deseables de ph y dureza. Se prepara con sales inorgánicas en cantidad requerida por el organismo prueba. Aguas residuales: son las aguas de composición variada provenientes de las descargas Municipales, industriales, comerciales, agrícolas pecuarias, domésticas y en general de cualquier otra Agudo: ocurre dentro de un periodo corto (minutos, horas o algunos días) en relación con el periodo de vida del organismo de ensayo. Batería de ensayos: combinación de diversos ensayos de toxicidad con diferentes organismos. Bioacumulación: Proceso por el cual los organismos vivos, especialmente los acuáticos, pueden colectar y concentrar productos químicos (Ej. xenobióticos o contaminantes) ya sea directamente del ambiente que les rodea o indirectamente a través del alimento. Bioensayo: ensayo en el cual el poder o potencia de una sustancia es medido a través de la respuesta de organismos vivos o sistemas vivientes. Biomagnificación: Es un caso especial de bioacumulación; manifiesta la tendencia de algunos productos químicos a acumularse a lo largo de la cadena trófica, exhibiendo concentraciones sucesivamente mayores al ascender el nivel trófico.

Carcinogenicidad: capacidad que una sustancia química tiene de causar o inducir el desarrollo de cáncer. Carta control: es un gráfico utilizado para seguir cambios a través del tiempo del punto final medido para un compuesto tóxico de referencia. En el eje X se grafica la fecha del ensayo, y en el eje Y, la concentración tóxica efectiva. Se toman como límite de alerta dos desviaciones estándar de la media histórica de la concentración letal media. Concentración letal (CL): es la concentración de una sustancia (pura o combinada), o efluente que produce la muerte del organismo. Concentración Efectiva Media (CE50): concentración del agente tóxico que causa efecto agudo (Ej. Inmovilidad) al 50 % de los organismos de prueba, en un determinado periodo de exposición. Concentración Letal media (CL50): es la concentración de la sustancia de interés, cuyo efecto tóxico potencial desea ser evaluado, que produce una tasa de mortalidad del 50% de los organismos vivos bajo las condiciones de operación de un bioensayo. Este valor es determinado estadísticamente a partir de los porcentajes de mortalidad obtenidos de la lectura final del bioensayo. Contaminante: sustancia ajena, presente en un sistema natural en una concentración más elevada de lo normal por causa de actividad antrópica directa o indirecta. En un sentido más amplio se le define como la presencia de cualquier agente físico, químico o biológico, o de combinaciones de los mismos en lugares, formas y concentraciones tales y con tal duración que sean o puedan ser nocivos para la salud, la seguridad o bienestar de la población, o perjudiciales para la vida animal y vegetal, o que impidan el uso y goce de las propiedades y lugares de recreación. Control negativo o blanco: es una unidad de prueba en la cual se espera obtener una respuesta negativa, es decir, ninguna alteración o afectación

detectable sobre el organismo de prueba. Se ejecutan igualmente para la validación del ensayo. Control positivo: evaluación de la respuesta tóxica con una sustancia de referencia, utilizada para controlar la sensibilidad de los organismos en el momento en el cual se evalúa el material problema. Crónico: ocurre durante un periodo relativamente largo de exposición (una porción significativa de la vida del organismo >10%). Daphnia pulex (cladóceros): crustáceos pequeños representantes de un eslabón intermedio importante en la cadena alimenticia de productores primarios y peces, sensibles a las sustancias tóxicas presentes en los cuerpos de agua. Descarga: aguas residuales que se vierten directa o indirectamente en algún cuerpo de agua o sistema de drenaje y alcantarillado urbano y municipal, incluyéndose los procesos de infiltración e inyección. Desposte: separación de los diferentes cortes de carne que componen la canal de un animal. Dosis letal: cantidad de material tóxico por unidad de peso corporal de un animal de prueba y que es capaz de matar a toda la población Dureza: medida de la concentración de iones de calcio y magnesio en el agua, expresada como mg/l de carbonato de calcio. Efectos letales: en bioensayos, son las alteraciones que causan la muerte del individuo debidas a la presencia de un efecto tóxico. Efectos tóxicos agudos: efectos adversos sobre un organismo vivo que se presenta en un periodo de tiempo corto.

Estudios de toxicidad: actividades de investigación tendientes a determinar la capacidad de una sustancia o mezcla de sustancias para causar efectos adversos sobre un organismo vivo. Hipoclorito de sodio: es un químico que se encuentra comúnmente en blanqueadores, purificadores de agua y productos de limpieza. La ingestión de hipoclorito de sodio puede llevar a una intoxicación. De la misma manera, la inhalación de los vapores de esta sustancia puede causar también intoxicación, especialmente si el producto se mezcla con amoníaco. Índices de toxicidad: expresan los resultados de diferentes ensayos de toxicidad como un único valor numérico que clasifica, según categorías, a la muestra. No existen reglas fijas para la designación de los índices. Muestra simple: es la que se toma interrumpidamente durante el período necesario para completar un volumen proporcional al caudal, de manera que éste resulte representativo de la descarga de aguas residuales, medido en el sitio y en el momento del muestreo. Muestra compuesta: es aquella que se forma con la mezcla de muestras simples o instantáneas tomadas de un efluente industrial, agrícola o municipal. El número de muestras simples depende de las horas por día que opere el proceso generador de la descarga. Mutagenicidad: medida de la capacidad de una sustancia química para causar cambios en el material genético. Osmorregulación: es la forma activa de regular la presión osmótica del medio interno del cuerpo para mantener la homeostasis de los líquidos del cuerpo; esto evita que el medio interno llegue a estados demasiado diluidos o concentrados. Replicado: es una cámara o recipiente de ensayo, conteniendo un número especificado de organismos en una concentración/dilución de muestra definida o

de agua de dilución como control. En un ensayo de toxicidad con cinco concentraciones de ensayo y un control que usa tres replicados, se utilizan 18 cámaras de ensayo con tres cámaras por concentración. Un replicado debe ser una unidad separada o independiente de ensayo. Teratogenicidad: capacidad de ciertas sustancias químicas de causar malformaciones en fetos animales o humanos. Toxicidad: propiedad inherente del agente químico que produce efectos dañinos a un organismo cuando éste se expone, durante cierto tiempo, a determinadas concentraciones. Toxicidad aguda: efecto adverso (letal o sub letal) inducido sobre los organismos de ensayo en prueba durante un periodo de exposición del material de ensayo, usualmente de pocos días. Toxicidad crónica: efectos tóxicos a largo plazo relacionados con cambios en el metabolismo, crecimiento o capacidad de supervivencia. Tóxico: es cualquier sustancia (pura o combinada) o efluente que al entrar en contacto con el organismo produzca daños, alteraciones bioquímicas o fisiológicas o incluso la muerte, dependiendo de la concentración y del tiempo de exposición. Tóxico de referencia: es una sustancia química utilizada en bioensayos de toxicidad, cuyo efecto en los organismos a determinadas concentraciones es conocido, y por lo tanto, permite establecer el estado de respuesta de los organismos de prueba empleados, así como comparar los resultados intra e inter laboratorio. El uso de estos tóxicos, proporciona también una evaluación general de la precisión (estabilidad y respetabilidad) del método a través del tiempo. Xenobióticos: compuestos orgánicos producidos artificialmente por medio de síntesis química para su utilización con diversos fines (Ej. Industriales o agrícolas).

RESUMEN Con esta investigación se determinó la concentración letal media del cloro mediante la utilización de organismos acuáticos como Daphnia pulex (neonatos de 6-24 horas de nacidos), ya que son organismos representativos de la cadena trófica y presentan alta sensibilidad a numerosos compuestos químicos. La determinación, se realizó por medio de pruebas de toxicidad, en un período de 48 horas (tiempo manejado por el ciclo de vida de la Daphnia pulex), para calcular la concentración del tóxico que produce la muerte del 50% de la población expuesta en este tiempo; ésta, se expresó como la concentración letal media, estableciendo sus límites superior e inferior. La investigación se llevó a cabo en el laboratorio de bioensayos de la Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria de la ULS. El procedimiento que se utilizó para la estandarización de esta fue: preparación del agua reconstituida, preparación del medio Bristol, mantenimiento de cultivos, preparación de soluciones prueba, toma y preservación de muestras ambientales para la realización de los ensayos de toxicidad, montaje de ensayos toxicológicos, sensibilidad real de la Dapnia pulex, aceptabilidad de los resultados y estimación de la concentración letal media. Se manejaron y validaron procedimientos establecidos por CETESB (Compañía de Tecnología y Saneamiento ambiental de Sao Paulo, Brasil), y se trabajó con programas estadísticos como el Probit y análisis de varianza que son utilizados en pruebas de toxicidad para los ensayos agudos estáticos. Una vez concluida la investigación se establecieron los valores y/o rangos del cloro (oscilaron entre 0,065 ppm 0.229 ppm y un valor promedio para la CL50-48 de 0.127 ppm), los rangos y/o valores del vertimiento sin tratar de este (oscilaron entre 2,266 % v/v 4,319 % v/v y un valor promedio para la CL50-48 de

3,247 % v/v) y los rangos y/o valores del vertimiento tratado (oscilaron entre 52,521 % v/v 54,897 % v/v y un valor promedio para la CL50-48 de 53,776 % v/v), lo cual demuestra que el tratamiento piloto realizado en este proyecto funcionó; ya que la CL50-48 del vertimiento aumento en un 50,529 % (v/v). Palabras claves: Cloro, hipoclorito de sodio, Daphnia pulex, toxicidad acuática, Concentraron Letal media en cuarenta y ocho horas (CL50-48), Bioensayo.

ABSTRACT In this research we determined the median lethal concentration of chlorine through the use of aquatic organisms such as Daphnia pulex (new borns from 6 to 24 hours old), because they are representative organisms of the food chain and have high sensitivity to numerous chemical compounds. The determination was performed by toxicity tests in a period of 48 hours (time driven by the life cycle of Daphnia pulex), in order to calculate the toxic concentration that causes death in 50% of the population exposed in this time; this is expressed as the median lethal concentration, setting upper and lower limits. The research was conducted in laboratory bioassays of Faculty of Environmental Engineering and Health. The procedure that was used for this standardization was: preparation of reconstituted water, environmental Bristol preparation, upkeep of the culture, preparation of test solutions, taking and preserving samples for testing for toxicity, toxicological testing assembly, real sensitivity of Daphnia pulex, acceptability of the results and estimation the median lethal concentration. We managed and validated procedures established by CETESB (Company of Technology and Environmental Sanitation in Sao Paulo, Brazil), and we work with statistical programs such as the analysis of variance and the probit, that are used in toxicity tests for acute static tests. Once the investigation was finished, we establish the values and/or ranks of chlorine (fluctuating from 0,065 ppm 0,229 ppm and an average value for the LC50-48 of 0,127 ppm), the ranks and/or values of the untreated dumping (fluctuating from 2,266% v/v 4,319% v/v and an average value for the LC50-48 of 3,247% v/v) and the ranks and/or values of the treaty dumping (fluctuating from 52,521% v/v 54,897% v/v and an average value for the LC50-48 of 53,776% v/v), which shows us that the pilot treatment performed in this project could work, because the LC50-48 increased in the dumping 50,529% (v/v).

Keywords: Chlorine, sodium hypochlorite, Daphnia pulex, aquatic toxicity, median lethal concentrations in forty-eight hours (LC50-48), Bioassay.

TABLA DE CONTENIDO INTRODUCCIÓN JUSTIFICACIÓN 1. OBJETIVOS 1.1. OBJETIVO GENERAL 1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 2. MARCO TEÓRICO 2.1. LOS BIOENSAYOS 2.1.1. Tipos de bioensayo según su técnica 2.1.2. Criterios para la evaluación de resultados en los bioensayos 2.1.3. Significado ecológico de los resultados del ensayo 2.1.4. Evaluación estadística de los ensayos 2.2. ECOSISTEMAS ACUÁTICOS 2.2.1. Tipos de ecosistemas acuáticos 2.2.2. Componentes de los ecosistemas acuáticos 2.2.2.1. Factores bióticos 2.2.2.2. Factores abióticos 2.2.3. Clasificación ecológica de los organismos de agua dulce 2.2.4. Factores ambientales acuáticos 2.3. ORGANISMO DE PRUEBA, Daphnia Pulex 2.3.1. Condiciones ideales de mantenimiento de cultivo a nivel laboratorio 2.3.2. Criterio de selección 2.4. ALGAS VERDES, Scenedesmus Acutus 2.4.1. Conteo de Algas, Cámara Neubauer 2.5. CLORO 2.5.1. Generalidades del cloro 2.5.2. Fabricación del cloro 3 3 3 4 4 8 9 10 12 19 19 19 19 19 20 21 22 25 26 27 28 30 30 32

2.5.3. Propiedades del cloro 2.5.4. Efectos ambientales del cloro, en animales y organismos acuático 2.5.5. Efectos del cloro en la salud humana 3. INDUSTRIA EVALUADA 3.1. PROCESO DE LAVADO DE LAS INSTALACIONES 4. METODOLOGÍA 4.1. DISEÑO EXPERIMENTAL 4.2. PREPARACIÓN DEL AGUA RECONSTITUIDA 4.3. PREPARACIÓN DEL MEDIO BRISTOL Y CENTRIFUGACIÓN DE ALGAS VERDES 4.4. ALIMENTACIÓN DE ORGANISMOS PRUEBA 4.5. ACLIMATACIÓN DE LOS ORGANISMOS PRUEBA 4.6. MANTENIMIENTO DEL CULTIVO DE LOS ORGANISMOS DAPHNIA PULEX 4.6.1. Separación de organismos 4.7. FASE PRUEBAS DE TOXICIDAD 4.7.1. Preparación de soluciones 4.7.2. Montaje de las pruebas de toxicidad (bioensayos) 4.7.3. Pruebas de toxicidad de sensibilidad con el tóxico de referencia dicromato de potasio (K2Cr2O7) 4.7.3.1. Pruebas preliminares (K2Cr2O7) 4.7.3.2. Pruebas definitivas (K2Cr2O7) 4.7.4. Pruebas con cloro 4.7.4.1. Pruebas preliminares (cloro) 4.7.4.2. Pruebas definitivas con Cloro 4.7.5. Toma y preservación de muestras ambiéntales para los ensayos de toxicidad 4.7.6. Análisis fisicoquímicos a los vertimientos 4.7.7. Pruebas preliminares y definitivas con el vertimiento de cloro 4.8. RESULTADOS FISICOQUÍMICOS FINALES 32 33 33 35 36 37 37 39 41 43 45 46 48 48 49 49 50 51 51 51 52 52 52 53 54 54

4.9. OBTENCIÓN DE RESULTADOS 4.10. OBTENCIÓN DEL ÍNDICE TOXICOLÓGICO 4.11. INDICE TOXICOLÓGICO DEL VERTMIENTO 4.12. COMPARACIÓN DE RESULTADOS 5. RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS 5.1. PREPARACIÓN DEL AGUA RECONSTITUIDA 5.2. PREPARACIÓN DEL MEDIO BRISTOL Y CENTRIFUGACIÓN DE ALGAS VERDES 5.3. ALIMENTACIÓN DE ORGANISMOS PRUEBA 5.4. MANTENIMIENTO DEL CULTIVO DE LOS ORGANISMOS PRUEBA, Daphnia Pulex 5.5. PRUEBAS DE TOXICIDAD DE SENSIBILIDAD CON EL TÓXICO DE REFERENCIA DICROMATO DE POTASIO (K2Cr2O7) 5.5.1. Análisis de varianza de las pruebas de la carta de control con dicromato de potasio sobre Daphnia Pulex 5.6. PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON CLORO 5.6.1. Test preliminar 5.6.2. Test definitivo 5.6.3. Análisis de varianza de las pruebas con cloro sobre Daphnia Pulex 5.7. VERTIMIENTO SIN TRATAR 5.7.1. Caracterización vertimiento sin tratar 5.7.2. Muestreo vertimiento sin tratar 5.7.3. Análisis fisicoquímicos vertimiento sin tratar 5.7.4. Análisis de la caracterización fisicoquímica vertimiento sin tratar 5.7.5. Pruebas toxicológicas vertimiento sin tratar 5.7.5.1. Test preliminar vertimiento sin tratar 5.7.5.2. Test definitivo vertimiento sin tratar 5.7.6. Análisis de varianza de las pruebas de vertimiento sin tratar sobre Daphnia Pulex 5.7.7. Indice tóxicologico vertimiento sin tratar 55 55 56 57 59 59 60 62 65 65 68 69 69 69 72 73 73 73 73 74 75 75 76 78 78

5.8. VERTIMIENTO TRATADO 5.8.1. Caracterización vertimiento tratado 5.8.2 Análisis fisicoquímicos vertimiento tratado 5.8.3. Análisis de la caracterización fisicoquímica vertimiento tratado 5.8.4 Pruebas toxicológicas vertimiento tratado 5.8.4.1. Test preliminar 5.8.4.2. Test definitivo 5.8.5. Análisis de varianza de las pruebas del vertimiento tratado sobre Daphnia Pulex 5.8.6. Indice tóxicologico vertimiento tratado 5.9. TRATAMIENTO PILOTO 5.9.1. Filtración 5.9.2. Carbón Activado Granular (CAG), como medio filtrante 5.9.2.1 Ventajas del sistema 5.9.2.2. Aplicaciones del sistema 5.9.3. Arena, como medio filtrante 5.10. DISEÑO DEL TRATAMIENTO PILOTO 5.10.1. Filtro de arena (ver anexo F) 5.10.2. Filtro de carbón activado (ver anexo F) 5.10.3. Montaje tratamiento piloto 5.11. EFICIENCIA DEL TRATAMIENTO PILOTO REALIZADO 6. CONCLUSIONES 7. RECOMENDACIONES 8. BIBLIOGRAFIA 81 81 81 82 83 83 84 86 86 88 88 88 89 89 90 90 90 91 92 93 96 100 102

LISTA DE TABLAS Tabla 1. Factores ambientales acuáticos. Tabla 2. Clasificación taxonómica. Tabla 3. Características morfológicas y del ciclo de vida. Tabla 4. Condiciones ideales de mantenimiento de La Daphnia pulex a nivel laboratorio. Tabla 5. Clasificación taxonómica de las algas verdes, scenedesmus acutus. Tabla 6. Generalidades del cloro. Tabla 7. Montaje del test general de ensayos. Tabla 8. Stock Preparación Agua Reconstituida. Tabla 9. Parámetros de control a evaluar en el agua reconstituida. Tabla 10. Preparación del medio Bristol. Tabla 11. Condiciones de mantenimiento del cultivo de Daphnia Pulex. Tabla 12. Análisis Fisicoquímicos. Tabla 13. Rangos de índices toxicológicos. Tabla 14. Registro de datos del agua reconstituida. Tabla 15. Volumen de alimento administrado a cada pecera. Tabla 16. Carta de control con dicromato de potasio en D. Pulex. Tabla 17. Sensibilidad con Dicromato de Potasio (estudios realizados en la Universidad de La Salle). Tabla 18. Promedio de la CL50-48 del cloro y su respectiva varianza (test definitivo). Tabla 19. Valor internacional de CL50-48 en Daphnia Pulex con cloro. Tabla 20. Parámetros fisicoquímicos evaluados al vertimiento sin tratar. Tabla 21. Valor promedio de los parámetros fisicoquímicos evaluados (vertimiento sin tratar). Tabla 22. Comparación de parámetros fisicoquímicos de la industria con la legislación colombiana.

Tabla 23. Mortalidad en cada concentración de prueba del ensayo. Tabla 24. Concentración Letal Media (CL50-48) y varianza del vertimiento sin tratar (test definitivo). Tabla 25. Parámetros fisicoquímicos analizados a la muestra tratada. Tabla 26. Valores promedio de los análisis fisicoquímicos. Tabla 27. Comparación de parámetros fisicoquímicos del vertimiento tratado con la legislación colombiana. Tabla 28. Mortalidad en cada concentración de prueba del ensayo. Tabla 29. Concentración Letal Media (CL50-48) y varianza del vertimiento tratado test definitivo. Tabla 30. Hoja de cálculo del filtro de arena. Tabla 31. Hoja de cálculo del filtro de CAG. Tabla 32. Eficiencia del tratamiento piloto, en cuanto a análisis fisicoquímicos.

LISTA DE ESQUEMAS Esquema 1. Mecanismo de transporte de un contaminante químico en el ambiente. Esquema 2. Determinación de la CL50 para pruebas de toxicidad aguda con múltiples concentraciones. Esquema 3. Metodología para la determinación de la concentración letal media.

LISTA DE ILUSTRACIONES Ilustración 1. Clasificación ecológica de los organismos de agua dulce. Ilustración 2. La pulga de agua o Daphnia pulex Ilustración 3. Hembra y macho Daphnia pulex. Ilustración 4. Morfología de la Daphnia pulex. Ilustración 5. Scenedesmus acutus (vista desde microscopio). Ilustración 6. Cámara de Neubauer. Ilustración 7. Zona de desposte, vista desde afuera. Ilustración 8. Zona de desposte, vista desde adentro. Ilustración 9. Cuarto frío. Ilustración 10. Exhibición y venta de cortes finos. Ilustración 11. Cuadricula cámara Neubauer. Ilustración 12. Cámara de Neubauer. Ilustración 13. 16 peceras en el mes. Ilustración 14. Separación y mantenimiento de organismos prueba. Ilustración 15. Montaje para las pruebas de toxicidad. Ilustración 16. Acuario agua reconstituida. Ilustración 17. Montaje medio Bristol. Ilustración 18. Medio Bristol listo para centrifugar. Ilustración 19. Área de ubicación de las peceras. Ilustración 20. Montaje tratamiento piloto. Ilustración 21. Montaje tratamiento piloto.

LISTA DE GRÁFICAS Gráfica 1. Sensibilidad del cultivo al toxico de referencia Gráfica 2. Concentración letal media del cloro Gráfica 3. Concentración Letal media (CL50-48) del vertimiento sin tratar sobre Daphnia pulex Gráfica 4. Clasificación del Índice Toxicológico de la industria. Gráfica 5. Concentración Letal media (CL50-48) del vertimiento tratado sobre Daphnia pulex. Gráfica 6. Resultado del Índice Toxicológico del vertimiento sin tratar y tratado Gráfica 7. Promedio de la CL50-48 del vertimiento sin tratar y tratado.

LISTA DE ANEXOS ANEXO A. Protocolo pruebas toxicológicas con Daphnia pulex. ANEXO B. Resultados de las pruebas definitivas de los ensayos con dicromato de potasio y su varianza. ANEXO C. Resultados de pruebas definitivas de los ensayos con cloro (hipoclorito de sodio) y su varianza. ANEXO D. Resultados de pruebas definitivas de los ensayos con el vertimiento sin tratar y su varianza. ANEXO E. Resultados de pruebas definitivas de los ensayos con el vertimiento tratado y su varianza. ANEXO F. Plano de filtros (arena y carbón activado granular), propuesta de tratamiento para la industria tipo.

INTRODUCCIÓN El uso de bioensayos para la evaluación de toxicidad de sustancias liberadas al medio, son herramientas ampliamente utilizadas en el campo de la ecotoxicología a nivel mundial para conocer los efectos en los diferentes ecosistemas, frente a la presencia de sustancias altamente tóxicas. Estos han sido estandarizados por organizaciones internacionales de regulación y control (CEE, ASTM, ISO, WHO, USEPA, CETESB) que las utilizan en la evaluación de la carga tóxica de vertimientos al medio acuático. La actividad humana produce gran variedad de desechos que son liberados a los ambientes terrestres, aéreos y acuáticos, generando un posible desequilibrio en los ecosistemas y más si el vertimiento presenta concentraciones difíciles de autodepurar por el sistema natural, provocan deterioro y la muerte de los componentes bióticos que en el se encuentran. En Colombia el decreto 1594 de 1984 (usos del agua y residuos líquidos), da a conocer aquellas entidades encargadas de realizar los Bioensayos o pruebas de toxicidad para establecer los valores de la concentración letal media (CL50), que afectan la calidad del recurso hídrico en cuanto al uso, para preservación de flora y fauna. Actualmente en el país las actividades que se encargan de la realización de las pruebas de toxicidad no se han implementado de manera continua con todas las sustancias clasificadas como potencialmente peligrosas en este decreto (sustancias de interés sanitario). Para minimizar el riesgo de los vertimientos, es obligatorio para todas las industrias realizar un tratamiento previo a sus cargas para cumplir con la legislación ambiental actual y así disminuir al máximo las posibles alteraciones en los ecosistemas acuáticos y cadenas tróficas presentes.

JUSTIFICACIÓN Uno de los inconvenientes más significativos con respecto al control ambiental es la contaminación de los cuerpos de agua, esto a su vez influye en todos los entornos y/ó ecosistemas con los que tiene algún tipo de contacto, afectando el equilibrio natural. Algunas de las características de estos desequilibrios son: el cambio del ph, la disminución de el oxigeno disuelto, entre otros. Generando daños a la salud de los seres vivos. Además los costos de análisis fisicoquímicos convencionales pueden resultar muy elevados y no representan de manera real el impacto de los contaminantes sobre el ambiente. Los ensayos de toxicidad con organismos acuáticos son métodos reconocidos por la comunidad científica internacional y empleados en muchos países, como herramientas para el monitoreo y control de la contaminación hídrica. Los bioensayos son aplicables porque permiten establecer la toxicidad de una sustancia, ya sea de forma inmediata (toxicidad aguda) por la muerte e inhibición de los organismos, ó porque a mediano o largo plazo (toxicidad crónica) se produce un efecto sobre el crecimiento, desarrollo y/o reproducción de los organismos. Las pruebas de toxicidad aguda permiten conocer el potencial toxicológico de un vertimiento mediante la estimación de indicadores como la concentración letal media en cuarenta y ocho horas (CL50-48). En la evaluación del vertimiento industrial, las pruebas de toxicidad son empleadas para caracterizar, jerarquizar y regular el mismo. Se realizaron pruebas de toxicidad con Daphnia pulex como bioindicador con el fin de determinar la CL50-48 del cloro que produzca la muerte del 50% de la población expuesta.

OBJETIVOS 1.1. OBJETIVO GENERAL Determinar la Concentración Letal media (CL50-48) de cloro de los vertimientos de una industria tipo (frigorífico) mediante bioensayos de toxicidad acuática utilizando Daphnia pulex. 1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Determinar la sensibilidad de los organismos por medio de la utilización de Dicromato de Potasio. Determinar la concentración letal media (CL50-48) del cloro sobre Daphnia pulex, utilizando los protocolos estandarizados por la Universidad. Diseñar un sistema piloto para el tratamiento de las muestras de la industria, con el fin de disminuir su toxicidad. Determinar la concentración letal media (CL50-48) del vertimiento industrial, que contiene cloro sobre Daphnia pulex, antes y después de diseñar el sistema piloto para el tratamiento.

2. MARCO TEÓRICO La ecotoxicología aplicada tiene como objetivo el desarrollo de protocolos de de ensayo para ser utilizados como herramientas de predicción tempranas que permitan definir umbrales permisibles. La evaluación de riesgo ecológico es un proceso de asignación de magnitudes y probabilidades a los efectos adversos de actividades antrópicas y catástrofes naturales; recurre tanto a métodos predictivos para la evaluación de la exposición. Como de los efectos de sustancias tóxicas a distintos niveles de organización y escala trófica. Los ensayos de toxicidad son los ensayos empleados para reconocer y evaluar los efectos de los contaminantes sobre la biota. En los bioensayos se usa un tejido vivo, organismo, o grupo de organismos, como reactivo para evaluar los efectos de cualquier sustancia fisiológicamente activa, bajo condiciones experimentales especificas y controladas estos efectos pueden ser tanto de inhibición como de magnificación, evaluados por la relación de los organismos, tales como muerte, crecimiento, proliferación, multiplicación, cambios morfológicos, fisiológicos o histológicos. 2.1. LOS BIOENSAYOS En un sentido general, la toxicidad de una sustancia puede ser definida como la propiedad que tiene una sustancia, elemento o compuesto, de causar daños en la salud humana o la muerte de un organismo vivo (Decreto 1594/84, art. 16); sin embargo y, en sentido amplio ésta se puede definir como la capacidad de causar algún efecto nocivo sobre algún organismo vivo. En sentido toxicológico, los bioensayos son pruebas para medir la potencia de una sustancia fisiológicamente activa, generalmente de origen desconocido, diseñados para medir los efectos de uno o mas contaminantes sobre una o mas especies de organismos.

Los estudios con bioensayos (pruebas de toxicidad) se iniciaron como medio para conocer los efectos del ambiente, sobre la actividad de los organismos. En los últimos 25 a 30 años se han utilizado pruebas de toxicidad con organismos de aguas continentales con el objeto de evaluar y reconocer los efectos de los xenobióticos sobre la biota acuática, permitiendo establecer límites de permisibilidad para distintas sustancias y evaluar el impacto de mezclas de contaminantes sobre las comunidades de los cuerpos hídricos receptores. 1 La evaluación más común de la toxicidad es la medida de la letalidad a corto plazo. Para una sustancia o vertimiento dado, esta medida implica la determinación de la concentración media que es letal para un porción fija (50%) de una población de organismos de prueba, después de una exposición continua durante un tiempo fijo (48, 96, 120 horas), denominada CL50-48. 2 En los últimos 30 años, en condiciones de laboratorio, se han utilizado ensayos de toxicidad con organismos de aguas continentales, estuarinas y marinas, con el objeto de evaluar y reconocer los efectos de xenobióticos sobre la biota acuática. Los laboratorios de toxicología ambiental y los protocolos para la ejecución de pruebas fueron conocidos en el interior del país, inicialmente en 1988 por la bióloga Clara Inés Ortiz, quien asistió al primer curso regional de Bioensayos en el Pacífico Sudeste. A partir del año 1993, cuando ya había un mayor interés sobre el tema, el Químico Pedro Miguel Escobar, con su asistencia a la Compañía Estatal de Tecnología de Saneamiento Básico y Protección del Brasil (CETESB), realizó los cursos prácticos especializados de bioensayos y pruebas de toxicidad, utilizando algas, bacteria y cladóceros. Igualmente el Químico Escobar, con el apoyo de la Corporación Autónoma Regional de Cundinamarca (CAR), realizó los primeros 1 Compañía Estatal de Tecnología de Saneamiento Básico y Protección del Brasil (CETESB), 1991. 2 Compañía Estatal de Tecnología de Saneamiento Básico y Protección del Brasil (CETESB), 2002.

bioensayos dentro de su trabajo denominado Determinación de la CL50 (Concentración Letal media) de los detergentes, mediante sistemas estáticos, utilizando Daphnia Magna, el cual le sirvió de trabajo de grado presentado para la obtención de su titulo de Licenciado en Química y Biología de la Universidad de La Salle. La Universidad del Valle y la Corporación Autónoma Regional del Valle del Cauca (CVC) han utilizado organismos acuáticos para evaluar la calidad del agua. Por su parte, en la Universidad de Antioquia se han realizado pruebas de toxicidad y ensayos biológicos entre 1989 y 1993. Con base en los primeros trabajos realizados por la CAR, a nivel investigativo se implementó el primer laboratorio de toxicología ambiental, patrocinado por el Proyecto CAR-BID, mediante convenio interinstitucional con la Universidad Nacional. Igualmente, en la investigación universitaria se realizaron los primeros ensayos de toxicidad a través de convenios como el de la CAR y la Universidad Nacional, quienes iniciaron los primeros trabajos sobre evaluación de toxicidad utilizando diversos organismos de la cadena trófica durante los años 1996, 1997 y 1998. Otras instituciones universitarias que han trabajado en el área han sido la Universidad de los Andes y la Universidad Javeriana, realizando ensayos de toxicidad aguda mediante la exposición de bacterias y Daphnia ssp. 3 En la Universidad de La Salle se creó un laboratorio especializado para bioensayos, los gestores de esta actividad fueron los docentes investigadores Rubén Darío Londoño, Yaneth Parra y Pedro Miguel Escobar. 3 Escobar Malaver, Pedro Miguel. Coinvestigadores Parra Martínez, Yaneth. Londoño Pérez, Rubén Darío, Determinación de la Concentración Letal CL50-48 del arsénico y del níquel sobre Daphnia Pulex, 2008, Universidad de La Salle, Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria.

En el año 2007 en la Universidad de La Salle, se realizó el primer montaje de bioensayos de toxicidad acuática sobre Daphnia pulex para determinar la concentración letal del mercurio, por parte de las estudiantes de la Universidad de La Salle, Alba Yaneth Bernal y Andrea Paola Rojas, bajo la dirección de Pedro Miguel Escobar. En el año 2008 en la Universidad de La Salle, se realizó el bioensayo llamado Determinación de la concentración letal media (CL50-48) del fenol en los vertimientos de la clínica veterinaria de la universidad de la salle sede floresta, por medio de bioensayos de toxicidad acuática sobre Daphnia pulex, realizado por Berta Zambrano y John Beltrán, bajo la dirección de Pedro Miguel Escobar. En el año 2008 en la Universidad de La Salle, se realizó el bioensayo titulado Determinación de la concentración letal media (CL50-48) del cromo y cobre, por medio de bioensayos de toxicidad acuática sobre Daphnia pulex, realizado por Juliana Olguín y Ángela Toro, bajo la dirección de Pedro Miguel Escobar. En el año 2008 en la Universidad de La Salle, también se realizó la tesis de bioensayos llamada Determinación de la concentración letal media (CL50-48) de Daphnia pulex por medio de bioensayos de toxicidad acuática con aluminio y plata, realizado por Andrea Alarcón y Natalia Ardila, bajo la dirección de Pedro Miguel Escobar. En el año 2008 en la Universidad de La Salle, se realizó el bioensayo titulado Determinación de la concentración letal media (CL50-48) de los vertimientos de cadmio y cinc de una industria galvanica mediante pruebas toxicológicas, realizado por Yasmin Maldonado y Angélica Castelblanco, bajo la dirección de Pedro Miguel Escobar. En el año 2008 en la Universidad de La Salle, también se realizó la tesis de bioensayos llamada Determinación de la concentración letal media (CL50-48) de

cromo y cobre en Daphnia Magna para el vertimiento de una industria de galvanotecnia y propuesta de pre-tratamiento para la disminución de la toxicidad de dicho vertimiento, realizado por Mónica Álvarez y Fernando Monge, bajo la dirección de Pedro Miguel Escobar. En el año 2008 en la Universidad de La Salle, se realizo el bioensayo titulado Determinación de la concentración letal media (CL50-48) del plomo y plata en los vertimientos de una industria galvánica, mediante ensayos toxicológicos sobre Daphnia Magna, realizado por Isabel Sierra y Felipe Zárate, bajo la dirección de Pedro Miguel Escobar. 2.1.1. Tipos de bioensayo según su técnica Ensayos Estáticos: estos consisten en colocar cámaras de prueba o montajes de las soluciones que se vayan a utilizar en el ensayo y los organismos que se van a examinar. En estos ensayos, las soluciones siempre son las mismas. Ensayos Semi-estáticos: en ellos se renueva periódicamente el medio de ensayo (ejemplo: una vez cada 24 horas). Ensayos de Flujo Continuo: en los que existe una renovación continua del medio de ensayo. Ensayos de reproducción: el período de exposición cubre al menos tres generaciones de los organismos de prueba. Permiten evaluar el comportamiento reproductivo como consecuencia de la exposición al tóxico. Ensayos de recuperación: en los que el período de exposición es seguido por la transferencia y observación de los organismos de prueba en un medio no tóxico. 4 4 Bernal Paredes, Alba Janeth. Rojas Avellana, Andrea Paola, Determinación de la Concentración Letal Media (CL50-48) del Cromo y el Cobre por Medio de Bioensayos de Toxicidad Acuática sobre Daphnia pulex, 2008, Universidad de La Salle, Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria.

2.1.2. Criterios para la evaluación de resultados en los bioensayos Los resultados de los ensayos de toxicidad pueden ser evaluados basados en los siguientes criterios: Interpretación: la muerte, crecimiento, reproducción son algunos de los parámetros usados para medir los efectos de un tóxico sobre un organismo, se espera que corresponda a los efectos observados en un ecosistema, cuando se asume que la concentración del tóxico en el ambiente es comparable con la de las pruebas realizadas en el laboratorio. Aunque es imposible reproducir exactamente todas las condiciones que hay en un ecosistema, con los resultados obtenidos se asume se pueda predecir los efectos en un ecosistema. Extrapolación: hace referencia a un criterio basado en los resultados obtenidos en las pruebas, y que puede predecir el peligro ambiental que cause un contaminante. Para un químico en particular este criterio esta relacionado con la sensibilidad de especies de importancia económica, usualmente peces. Sensibilidad: la sensibilidad de la respuesta está sujeta al nivel de organización biológica del organismo de prueba, la duración de la prueba, y a la variabilidad de la respuesta. La sensibilidad de un sistema biológico a la acción de un tóxico se da en todos los ecosistemas, pero hay especies estándar con una alta sensibilidad a diferentes tóxicos, por esta razón son ampliamente utilizadas en ensayos de toxicidad. De la forma en que se realicen los ensayos de toxicidad, los resultados podrán tener una alta correlación con los efectos adversos observables en un ecosistema. Variabilidad: la determinación de una variabilidad que sea aceptable, es una cuestión metodológica y estadística. Sin embargo, ésta es inherente a la medición de la respuesta, y al número de unidades experimentales. Es por eso que la metodología utilizada en los ensayos de toxicidad debe ajustarse correctamente para que las variaciones no sean significativas.

Replicabilidad: existen técnicas toxicológicas estandarizadas con especies de prueba debidamente reconocidas que han sido publicadas para asegurar que los datos obtenidos sean completamente reproducibles en otros laboratorios. Sin embargo, como no en todos los laboratorios pueden aplicarse estas metodologías, para evitar variabilidad en los resultados se debe procurar tener condiciones muy similares a las utilizadas en otros trabajos. 2.1.3. Significado ecológico de los resultados del ensayo En un ecosistema, se presenta un continuo ciclo de elementos esenciales y una interacción de estos elementos con otros compuestos presentes en el ecosistema. Esta interacción confiere un grado de control homeostático que asegura el mantenimiento de un máximo de biomasa. Cada una de las propiedades del ecosistema: flujo de energía, pueden ser alterada por un contaminante ambiental; y los efectos que se dan como producto de esta alteración, pueden ser cambios en la tasa de producción primaria, o en la respiración. Si un compuesto es tóxico y permanece estable en el ambiente, su peligro dependerá de la posibilidad de dispersarse y si disponibilidad para la biota presente. Un contaminante químico que llegue al suelo, al agua, a la atmósfera o a la biota se puede transportas a través de diferentes vías (por transferencia biológica o física) entre los diferentes ecosistemas. Procesos biológicos como adsorción, excreción, alimentación, influyen en el transporte de un contaminante químico. Dependiendo de la velocidad con que se den estos procesos, los tóxicos pueden acumularse en los organismos, en un fenómeno conocido como bioacumulación. Cuando se produce un incremento de este contaminante a lo largo de la cadena alimenticia el fenómeno se conoce como biomagnificación. El mecanismo y transporte de un contaminante químico en el ambiente, se observa en el esquema 1.

Esquema 1. Mecanismo de transporte de un contaminante químico en el ambiente. Fuente: Hoyos Campos, Liliana Gisela. Estandarización de bioensayos con Daphnia magna para la evaluación de toxicidad en aguas contaminadas, 1995, Universidad Nacional de Colombia. Los contaminantes químicos que se cree no representan peligro cuando están en el ambiente, pueden acumularse en un organismo en niveles tóxicos como resultado del proceso de bioacumulación. Una continua exposición a una sustancia, aún en bajas concentraciones, puede originar efectos crónicos en los organismos y efectos acumulativos en las poblaciones. Adicionalmente, la persistencia de una sustancia en el ambiente no solo favorece procesos de bioacumulación o biomagnificación, sino su dispersión. Esta persistencia, se considera, es el mayor factor para determinar el riesgo potencial. Los resultados obtenidos a través de las pruebas de toxicidad pueden proveer información acerca de la muerte de los organismos, acumulación en tejidos, daño a nivel reproductivo, mutagenicidad, carcinogenicidad, teratogenicidad y alta

susceptibilidad a cambios en el ambiente. Los efectos tóxicos que se pueden dar en un organismo en particular son cruciales, ya sea porque la reducción de una especie, puede modificar el tamaño de la población, al verse afectadas las interrelaciones entre los diferentes niveles tróficos. Si la perturbación se da respecto a una especie de relativa importancia, puede alterarse la totalidad del ecosistema. La calidad del ambiente acuático puede ser valorada no sólo por análisis químicos sino por la vigilancia de las comunidades de plantas y animales. Recientemente se ha utilizado la evaluación de la respuesta de organismos vivos de alta sensibilidad y de importancia en los ecosistemas, a la presencia de compuestos químicos que comúnmente llagan como contaminantes. Es por esto que los bioensayos en investigación que tiene relación con la polución son una buena herramienta no solo para determinar el efecto de una sustancia en un organismo, sino para la preservación de diferentes especies de importancia para el ecosistema, y protección de la estructura y función del ecosistema, la predicción de la consecuencia ecológica del contaminante, el riesgo potencial de la sustancia para otros organismos superiores y el limite en el que ella puede llegar a un ecosistema sin causar daños en el, son también elementos de evaluación con las pruebas de toxicidad. 5 2.1.4. Evaluación estadística de los ensayos La estadística desempeña un papel importante no solo para el cálculo, si no para la planificación y ejecución de las pruebas de toxicidad y para el análisis e interpretación de los resultados obtenidos en ellas. Por tanto, el diseño experimental, el muestreo, la modelación, la recolección de datos, las pruebas y los análisis deben ceñirse a principios estadísticos estrictos. En general, los métodos de análisis de los resultados están bien documentados, son aplicables a 5 Hoyos Campos, Liliana Gisela. Estandarización de bioensayos con Daphnia Magna para la evaluación de toxicidad en aguas contaminadas, 1995, Universidad Nacional de Colombia.

la mayoría de los datos obtenidos en este tipo de pruebas y pueden ser manejados por personas sin entrenamiento estadístico. El análisis de relación entre dos o más variables implica, en la mayoría de los casos, la utilización de técnicas estadísticas de regresión. Estas técnicas requieren, antes de ser aplicadas, la selección de la ecuación matemática (en adelante, el modelo) con la que se relacionaran las variables analizadas. A su vez, en la selección del modelo a utilizar, es de vital importancia el tipo de variables a relacionar. En general, las variables se clasifican en cualitativas y cuantitativas, pudiéndose distinguir en el último caso entre discretas y continuas. Las cuantitativas discretas son las que sólo pueden tomar cualquier valor en el conjunto numérico de los enteros, mientras que las continuas pueden tomar cualquier valor en el conjunto numérico de los reales. Las variables cuantitativas pueden ser analizadas en forma directa a través de análisis estadísticos de regresión, mientras que las cualitativas deben ser expresadas de forma cuantitativa antes de ser analizadas. Este último caso es el que se verifica en los ensayos en los que se evalúa la mortalidad como variable, ya que ésta solo puede tomar los estados vivo o muerto (variable cuantitativa), y debe ser expresada como porcentaje de muertos antes de poder ser analizadas por métodos de regresión. Finalmente, es importante destacar que, en lo que respecta al análisis de las de las relaciones entre la concentración de de un tóxico y la respuesta o efecto del mismo en la materia viva, existen otras aproximaciones al análisis de dichas relaciones en las que, básicamente sólo se pretende determinar la concentración a la cual no se observa un efecto nocivo del tóxico sobre el organismo expuesto, o la concentración mas baja a la cual se observa efecto tóxica. Este tipo de análisis se realiza a través del método ANOVA (análisis de varianza). En una prueba de toxicidad típica se involucra un agente o estímulo, el cual es aplicado a un organismo al que genéricamente se denomina sujeto, sobre el cual se evalúa cierta respuesta. La magnitud del estimulo puede medirse como un

peso, un volumen o una concentración. La respuesta del sujeto se valora mediante la cuantificación final de algunas características, el cambio de ella o por la ocurrencia o no de un determinado fenómeno (muerte, inhibición del crecimiento una contracción muscular, etc.). Las pruebas de toxicidad suelen diseñarse utilizando diferentes dosis, ya que la respuesta dependerá directamente de la concentración aplicada. La información obtenida de este tipo de ensayos permite la cuantificación de la relación entre las dos variables (dosis y respuesta). Normalmente, las pruebas de toxicidad se diseñan para comparar o estimar la potencia de un agente con relación a una preparación estándar o control. Es importante destacar que la respuesta a una dosis en particular se verá afectada en mayor o menor medida por factores no controlados durante el experimento. Para el análisis de las relaciones cuantitativas entre la dosis y la respuesta, es necesario recurrir a modelos matemáticos que describan dicha relación. En general, los modelos matemáticos se pueden clasificar en: Mecanístico: es un modelo que intenta describir un proceso basándose en postulados acerca de la mecánica de dicho proceso. Empírico o descriptivo: es un modela que intenta describir cuantitativamente los patrones de las observaciones sin basarse en los procesos subyacentes o mecánica del proceso. Determinístico: es un modelo en el que dado un dato en particular, la predicción que se obtiene del modelo es siempre el mismo valor. Probabilístico: es un modelo en el que dado un dato en particular, la predicción que se obtiene del modelo es un valor variable. En el caso particular de las pruebas de toxicidad, los más utilizados son los de tipo empírico o descriptivo de forma rectilínea, a los cuales se llega muchas veces luego de haber transformado una o las dos variables estudiadas. Dentro de la gran

cantidad de modelos y técnicas de análisis disponibles para evaluar los resultados de los ensayos de toxicidad, sólo se describirán aquellos asociados al análisis de los ensayos que se realizaron en esta investigación: Métodos estadísticos: para que se de el cumplimiento a los requerimientos de validez y precisión de las pruebas se debe utilizar una metodología estadística desde la planificación hasta la ejecución y, luego, el posterior análisis de los resultados. El criterio básico para seleccionar el método estadístico, es coger el que se ajuste a las condiciones experimentales y que permita obtener resultados válidos. Diseño experimental: las condiciones de experimentación tienen que ver con la reproducibilidad o replicabilidad. En este sentido, las propiedades físicas y químicas de los compuestos químicos que se utilizan deben ser muy bien conocidas y controladas, por lo que la preparación y almacenamiento de los compuestos y solventes constituyen un elemento técnico importante, además de los asociados con la producción de los organismos de prueba. Igualmente, el uso de réplicas es básico, cuando se lleva a cabo la evaluación estadística de medidas. En pruebas de toxicidad deben tenerse en cuenta algunos factores que pueden ser una fuente potencial de confusión. Entre ellos se pueden mencionar: número de repeticiones, numero de tratamientos/grupos de dosis o concentraciones. El principio básico en el diseño estadístico es la aleatorización, por ello los esfuerzos y el tiempo dedicados a cumplir con este principio producirán resultados más confiables y reproducibles, ya que el concepto de muestra aleatoria es un requisito indispensable para la validez de cualquier prueba estadística. En las pruebas de toxicidad en general se utilizan dos diseños básicos: 1. Establecimiento de una relación dosis-respuesta. 2. Análisis de varianza (ANOVA).

Como resultado del análisis de los datos de un diseño para estimar una relación dosis-respuesta, lo que se pretende obtener son las estimaciones de los parámetros del modelo seleccionado para relacionar las variables y, a continuación, utilizar el modelo con las estimaciones de los parámetros encontrados para determinar los valores de la variable concentración de tóxico que causan un grado de efecto, en particular sobre los organismos expuestos. Entre estas concentraciones, la más utilizada es la que se conoce como concentración letal 50 (CL50-48), que es la concentración que produce la respuesta esperada sobre el 50% de los organismos expuestos en un periodo determinado por ejemplo 48 horas. Establecimiento de una relación dosis-respuesta de tipo mortalidad: la selección del método a utilizar para estimar los valores de CL50-48 de pruebas de toxicidad aguda dependerá de la forma de la distribución de tolerancias, y que tan bien las concentraciones seleccionadas la caracterizan (por ejemplo, el número de mortalidades parciales). En general, se recomiendan cuatro métodos par la estimación de la CL50/CE50/CL50 los cuales son: Método probit (paramétrico): el método consiste en la aplicación de correlaciones estadísticas para estimar las consecuencias desfavorables sobre una población a los fenómenos físicos peligrosos; nos da una relación entre la función de probabilidad y una determinada carga de exposición. 6 Método de litchfield-wilcoxon (gráfico): este método consiste en la construcción de una gráfica a partir de los daros obtenidos en pruebas de toxicidad aguda de un agente tóxico. Se utiliza papel prob-log, en el cual se 6 Bernal Paredes, Alba Janeth. Rojas Avellana, Andrea Paola, Determinación de la Concentración Letal Media (CL50-48) del Cromo y el Cobre por Medio de Bioensayos de Toxicidad Acuática sobre Daphnia pulex, 2008, Universidad de La Salle, Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria.

colocan en el eje de las X el logaritmo (X) de las concentraciones usadas y en el eje de las Y el porcentaje de respuesta del efecto observado. Para el cálculo de la CL50/CE50/CL50 mediante este método, es necesario tener por lo menos, un porcentaje intermedio de efecto observado (valores entre 0% y 100% de efecto). Método de Spearman-Kärber (no paramétrico): es un método aproximado, no paramétrico, que proporciona una buena estimación de la media y la desviación estándar. Si la distribución es simétrica se obtiene una estimación de la concentración total mediana (CL50). Método gráfico: en este método, se parte de los datos obtenidos en las pruebas de toxicidad aguda, y utilizando papel logarítmico se grafican en el eje de las X las concentraciones (mg/l) y en el eje de las Y el porcentaje de mortalidad. Se colocan los puntos de los porcentajes de mortalidad observados (en escala lineal) en función de las concentraciones probadas (en escala logarítmica); se conectan los puntos obtenidos mas cercanos al 50% del efecto observado, o sea, a la mayor concentración que no causa efecto tóxico. A partir de la recta trazada, se obtiene el punto de corte correspondiente al 50% del efecto observado. Este valor corresponde a la CL50 del estímulo o agente estudiado. Cuando no se logra hacer un ajuste adecuado de los datos, se pueden utilizar otros métodos para hacer las estimaciones de la CL50. Análisis de varianza (ANOVA): en estadística el análisis de varianza (ANOVA) es una colección de modelos estadísticos y sus procedimientos asociados. Esta prueba está diseñada para comparar los resultados obtenidos para un tratamiento en particular contra un control (tratamiento con dosis cero). Para este tipo de análisis se requiere que el número de replicas por tratamiento sea superior a tres y que todos los tratamientos tengan el mismo número de replicas. En el caso que las replicas sean menor de tres no se deberá proceder con una prueba hipótesis. Para esta investigación el análisis estadístico se realizó con el método paramétrico probit, ya que se contó con el software que fue suministrado por la

Corporación Autónoma Regional para mayor precisión del calculo de la concentración letal media, y cuyo procedimiento se describe en el protocolo LB 06, dándonos un margen de confiabilidad del 95%. Igualmente los resultados del software fueron validados mediante el análisis de varianza (ANOVA) cuyo procedimiento se describe en el protocolo LB07 Análisis de Varianza (ANOVA). 7 En el esquema 2 se presenta el diagrama de flujo recomendado por la USEPA (1993) para la selección del método, basado en los requerimientos de cada uno. Esquema 2. Determinación de la CL50 para pruebas de toxicidad aguda con múltiples concentraciones. Fuente: BULUS ROSSINI, Gustavo Daniel; DÍAZ BAEZ, María Consuelo; Pica Granados, Yolanda, Capítulo 5. Métodos Estadísticos para el Análisis de Resultados de Toxicidad. En línea. Febrero 2007. <http://www.idrc.ca/en/ev-66572-201-1-do_topic.html. 2004> figura 2. 7 Orozco Holguín, Juliana. Toro Barbier, Ángela María, Determinación de la Concentración Letal Media (CL50-48) del Cromo y el Cobre por Medio de Ensayos de Toxicidad Acuática Sobre Daphnia pulex, 2008, Universidad de La Salle, Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria.

2.2. ECOSISTEMAS ACUÁTICOS Los cuerpos de agua como ríos, lagos, pantanos y demás fuentes acuáticas son ecosistemas acuáticos. Los dos tipos más destacados son: los ecosistemas marinos, y los ecosistemas de agua dulce. 3.2.1. Tipos de ecosistemas acuáticos Partiendo del movimiento del agua, se acuerda una división de los ecosistemas de agua dulce. Esta división tiene relevancia tanto para estudiar la naturaleza como para la explotación y gestión de las aguas interiores. Se presenta a continuación: Ecosistema léntico: es de agua quieta o de escaso caudal como en los lagos, estanques, pantanos y embalses. Ecosistema lótico (latín lotus): participio de lavere, lavar): sistema de agua corriente como en los ríos, arroyos y manantiales. 8 2.2.2. Componentes de los ecosistemas acuáticos A continuación se presentan los diferentes factores que componen los ecosistemas acuáticos. 2.2.2.1. Factores bióticos Son los componentes de un ecosistema que poseen vida y permiten el desarrollo de la misma. En general los factores bióticos son los seres vivos; como: animales, plantas, hongos, bacterias, etc. 2.2.2.2. Factores abióticos Son los componentes de un ecosistema que no requieren de la acción de los seres vivos, o que no poseen vida, es decir, no realizan funciones vitales dentro de sus estructuras orgánicas. 9 8 WIKIPEDIA: la enciclopedia libre (en línea), octubre 2008. disponible en Internet:<http://es. wikipedia.org/wiki/ecosistema_acuático>

2.2.3. Clasificación ecológica de los organismos de agua dulce Las condiciones físicas y químicas dominantes en los medios acuáticos determinan el tipo de organismos que viven en ese medio. Se han propuesto varias clasificaciones ecológicas de los organismos acuáticos (ver ilustración 1); la más aceptada hoy día es la que presentamos a continuación: Plancton. Comprende los organismos que viven suspendidos en las aguas y que, por carecer de medios de locomoción o ser estos muy débiles, se mueven o se trasladan a merced de los movimientos de las masas de agua o de las corrientes. Generalmente son organismos pequeños, la mayoría microscópicos. Necton. Son organismos capaces de nadar libremente y, por tanto, de trasladarse de un lugar a otro recorriendo a veces grandes distancias (migraciones). En las aguas dulces, los peces son los principales representantes de esta clase, aunque también encontramos algunas especies de anfibios y otros grupos. Bentos. Comprende los organismos que viven en el fondo o fijos a él y por tanto dependen de éste para su existencia. La mayoría de los organismos que forman el bentos son invertebrados. Neuston. A este grupo pertenecen los organismos que nada o "caminan" sobre la superficie del agua. La mayoría son insectos. Seston. Es un término adoptado recientemente y se aplica a la mezcla heterogénea de organismos vivientes y no vivientes que flotan sobre las aguas. Perifiton. Organismos vegetales y animales que se adhieren a los tallos y hojas de plantas con raíces fijas en los fondos. 10 9 Disponible en Línea. http://www.salonhogar.net/ciencias/ecosistemas_acuaticos.htm 10 MARCANO, José E. Educación Ambiental; Elemento de ecología; Ecología de las aguas dulces 2ª parte; clasificación ecológica de los organismos de agua dulce y comunidades del medio acuático. (Libro en línea), consultado octubre 2008. Disponible en Línea. <http://www.jmarcano.com/nociones/fresh2.html>

Ilustración 1. Clasificación ecológica de los organismos de agua dulce. Fuente: MARCANO, José E. Educación Ambiental; Elemento de ecología; Ecología de las aguas dulces 2ª parte; clasificación ecológica de los organismos de agua dulce y comunidades del medio acuático. (Libro en línea), consultado octubre 2008. Disponible en Línea. <http://www.jmarcano.com/nociones/fresh2.html> 2.2.4. Factores ambientales acuáticos En la siguiente tabla se describen los factores ambientales acuáticos: Tabla 1. Factores ambientales acuáticos. FACTOR AMBIENTAL Temperatura CARACTERISTICAS Determina la densidad, viscosidad y movimiento del agua. Influye en la periodicidad y reproducción de los organismos ya que posee ciertas propiedades térmicas que son: Calor específico Calor latente de fusión Conductividad térmica Calor latente de evaporación Iluminación Gases disueltos La radiación solar puede penetrar hasta determinadas profundidades, dependiendo de la turbiedad y algunos otros elementos suspendidos en el cuerpo de agua. Lo que nos regula el proceso de la fotosíntesis que realiza las plantas acuáticas y fitoplancton. El oxígeno es el elemento de mayor importancia en el sistema acuático ya que sus concentraciones constituyen con frecuencia factores limitantes. También existen muchos gases como el anhídrido sulfuroso, que es muy venenoso y constituye un valor limitante cuando se acumula en aguas estancadas ricas en restos orgánicos.

FACTOR AMBIENTAL Sales minerales CARACTERISTICAS Las sales minerales más abundantes son los carbonatos, los sulfatos y los cloruros. Los cationes de mayor importancia son el calcio (64%), el magnesio (17%), el sodio (16%) y el potasio (3%). ph El calcio juega un papel fundamental, ya que determina dos diferentes tipos de agua: a) aguas duras, cuando la concentración de calcio es inferior a 25 mg/l; b) aguas blandas, cuando la concentración de calcio es inferior a 9 mg/l. muchos moluscos, crustáceos y otros invertebrados, tienen necesidad de calcio para formar sus caparazones o conchas y por tanto puede ser factor limitante para algunas especies. La concentración de sales minerales en las aguas dulces, tienen relación con los procesos de osmorregulación de los seres vivos. Estos, presentan en muchos casos mecanismos de regulación de la presión osmótica, lo cual les permite subsistir en medio de diferente concentración a la del medio interno. Hay organismos que viven en aguas con un ph ácido; otros viven en medios acuáticos alcalinos. Así, la planta Elodea canadiensis vive en aguas con un ph entre 7.7 y 8.8. Typha angustifolia (enea) vive en aguas con un ph de 8.4 a 9.0. Los hongos, y otros organismos, viven en medios ácidos. Las aguas dulces tienen el ph entre 6.5 y 8.7; las aguas marinas entre 8 y 8.5. Fuente: La tierra y su entorno, Ecología de las aguas dulces, consulta el 27 de octubre de 2008. Disponible en Línea. <http://www.latierraysuentorno.cl/ecologia_aguas_dulces.html> 2.3. ORGANISMO DE PRUEBA, Daphnia Pulex La pulga de agua o Daphnia pulex (ver ilustración 2) es un pequeño crustáceo cladócero. Vive en lagos y lagunas alimentándose principalmente de algas, es un organismo planctónico altamente sensible y sirviendo, a su vez, de alimento a los peces, así que una alteración en el ecosistema o un efecto en ellos afectará los demás eslabones de la cadena trófica. Es un componente importante de las comunidades acuáticas y es sensible a un amplio rango de contaminantes. Su uso se encuentra estandarizado en numerosos protocolos y recomendado en las

normas legislativas europeas y españolas, para la evaluación eco-toxicología de vertidos y residuos industriales y urbanos. A continuación vemos la clasificación taxonómica de la Daphnia Pulex (tabla 2) y sus características morfológicas y del ciclo de vida: Ilustración 2. La pulga de agua o Daphnia pulex Tabla 2. Clasificación taxonómica Fuente: http://www.indiana.edu Clasificación taxonómica Reino Animalia Filo Arthropoda Subfilo Crustacea Clase Branchiopoda Subclase Phyllopoda Orden Diplostraca Suborden Cladocera Familia Daphniidae Género Daphnia Fuente: http://es.wikipedia.org/wiki/clad%c3%b3ceros Tabla 3. Características morfológicas y del ciclo de vida. Tamaño Alimento Oscila entre 0.2 y 3 mm. Microalgas o pequeñas partículas de fitoplancton de diámetro inferior a 30 micras. Reproducción La Daphnia tiene dos maneras distintas de reproducción: Una asexual y otra sexual. La primera se produce por partenogénesis y, según la edad y el tipo de alimentación de la pulga, puede llegar a dar entre 5 y 6 hasta los 100 ejemplares. En la reproducción sexual la hembra produce óvulos que luego de ser fertilizados por el macho y que se alojan en el epifido (saco que soporta los huevos) y estos son llamados epifidos. La producción de estos huevos se debe a la sabiduría de la Naturaleza que de esta manera se asegura la subsistencia de la especie cuando las condiciones de vida no son favorables. Estos pueden ser mantenidos por más de 50 años. Siempre recomiendo mantener más de un cultivo a la vez, ya que si perdemos las Daphnias de un cultivo, podremos seguir con otro.

Respiración La respiración es aerobia en su totalidad. El intercambio de gases en estos individuos se efectúa vía epipodito de los apéndices toráxicos que están transformados en las branquias. Un intercambio normal de gases entre la sangre y el medio se lleva a cabo por el constante movimiento de los apéndices toráxicos que crean una corriente continua de agua fresca (Universidad Jorge Tadeo Lozano, 1974, citado por Matuk 1996). Características morfológicas Estos organismos se caracterizan por poseer un cuerpo comprimido lateralmente y ovalado; no se distinguen segmentos como en otros crustáceos. Presentan dimorfismo sexual marcado, la hembra es más grande que el macho (ilustración 3). Presenta un caraparazón de quitina transparente, las antenas o apéndices con numerosas setas; ojos compuestos y simples (ojo nauplio). Una cavidad embriónica con huevos y embriones situados en la parte dorsal, entre el carapacho y el dorso del cuerpo. En la ilustración 4 se observa la morfología de La Daphnia Pulex. Fuente: www.elacuariodealex.com/05_alimentacion/archivos/pulga%20de%20agua.doc A continuación observamos la hembra y macho de la Daphnia pulex: Ilustración 3. Hembra y macho Daphnia pulex. Fuente: http://www.fao.org/docrep/field/003/ab473s/ab473s06.htm En la anterior ilustración podemos observar que se diferencia fácilmente la Daphnia macho y hembra, por su forma y tamaño.

Ilustración 4. Morfología de la Daphnia pulex. Fuente: http://www.fao.org/docrep/field/003/ab473s/ab473s06.htm#chvi 2.3.1. Condiciones ideales de mantenimiento de cultivo a nivel laboratorio En la siguiente tabla se describen las condiciones ideales de mantenimiento de La Daphnia pulex a nivel laboratorio: Tabla 4. Condiciones ideales de mantenimiento de La Daphnia pulex a nivel laboratorio. Temperatura 20 ºC +/- 2 ºC Calidad de luz Fluorescente, blanco-frío. Intensidad luminosa 600-1000 lux (luz blanca fría) en la superficie del líquido. Fotoperíodo 16 horas luz/18 oscuridad. Alimentación Cultivos puros de selenastrum capricornutum

Dosis de alimento Densidad poblacional Limpieza Recolección de neonatos La cantidad de alimento suministrada se calcula de la siguiente manera: V= Ax B / C Donde: V= volumen a ser adicionado A= número de organismos B= número de células por Daphnia pulex C= densidad celular de la suspensión algar El alimento es suministrado día de por medio. No mayor a 22 individuos / 2L Diariamente se deben retirar las mudas y los restos que se encuentren en el fondo de los recipientes. Cada viernes se cambia el agua de los acuarios, los cuales deben lavarse con una esponja o un paño de tela, enjuagar varias veces con agua desionizada. No se deben emplear jabones ni otros detergentes. Diariamente se retiran los neonatos con una micropipeta Pasteur de plástico, con una abertura lo suficientemente ancha como para no ocasionar daños a los neonatos. Fuente: Alarcón Orjuela, Julie Andrea. Ardila Amaya, Liz Natalia, Determinación de la Concentración Letal Media (CL50-48) de Daphnia Pulex por Medio de Bioensayos de Toxicidad Acuática con Aluminio y Plata, 2008, Universidad de La Salle, Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria. 2.3.2. Criterio de selección Los organismos pertenecientes al genero Daphnia son ampliamente utilizados en todo el mundo como especie test o de referencia, para la realización de bioensayos o ensayos de toxicidad. Algunas de las razones por las cuales este organismo es seleccionado son: Son organismos de amplia distribución, representantes importantes de la comunidad zoo-planctónica. Presentan sensibilidad muy alta a cualquier tipo de tóxicos. Son fáciles de criar en laboratorio y de manipular se adecuan sin problema a condiciones de cultivo estático, semi-estático o de flujo continuo en acuarios.

Se producen partenogenéticamente, de esta forma aseguran uniformidad de respuesta a determinadas condiciones ambientales. Presentan generaciones cortas y con alto número de crías, con lo que se puede realizar estudios sobre generaciones sucesivas en pruebas de toxicidad crónica. Los costos del cultivo y mantenimiento son bajos 11. 2.4. ALGAS VERDES, Scenedesmus Acutus Las algas seleccionadas como alimento para el mantenimiento de los cultivos de Daphnia Pulex son algas verdes (ver ilustración 5), pertenecen a la clase cenobio formado por dos células, un poco arqueadas, mide de 3 μm de ancho y 10 μm de largo cada célula. Estas se caracterizan por que presentan cloroplastos de color verde, puede encontrarse en forma unicelular o colonias no flageladas, microscópicas unicelulares, filamentosas simples o ramificadas y algunas formas desarrolladas. La mayoría forman parte del plancton y del bentos de agua dulce, las especies marinas son de mayor tamaño, y constituyen en forma secundaria el plancton marino. Algunas colonias son cenóbicas (número de células es fijo), cada célula contiene un cloroplasto plano y usualmente pirenoide. Presentan formas elipsoidales o fusiformes de 2, 4 u 8 en series lineales para formar una colonia plana; pueden presentar pared lisa o verrugosa, los polos de las células se encuentra a menudo ornamentados con espinas. 12 En la siguiente tabla podemos ver la clasificación taxonómica de las algas verdes: 11 Maldonado Malaver, Gloria Yasmín. Castelblanco Marcelo, Maria Angélica, Determinación de la Concentración Letal Media (CL50-48) de los Vertimientos de Cadmio y Cinc de una Industria Galvánica Mediante Pruebas Toxicológicas, 2008, Universidad de La Salle, Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria. 12 Disponible en Línea. <http://conabioweb.conabio.gob.mx/bancoimagenes/doctos/001_thumbs8-2.htm>

Tabla 5. Clasificación taxonómica de las algas verdes, scenedesmus acutus. Reino Plantae Clase Chlorophyceae Suborden Chlorophytina Orden Chlorococcales Familia Scenedesmaceae Género Scenedesmus Fuente: http://zipcodezoo.com/plants/s/scenedesmus_armatus/es/ Ilustración 5. Scenedesmus acutus (vista desde microscopio). Fuente: www.lanuv.nrw.de/.../gifs/scenedesmus-acutus.png 2.4.1. Conteo de Algas, Cámara Neubauer Es un instrumento utilizado en cultivos celulares para realizar conteo de células en un medio de cultivo líquido. Consta de dos placas de vidrio (ver ilustración 6), entre las cuales se puede alojar un volumen conocido de líquido. Una de las placas posee una grilla de dimensiones conocidas y que es visible al microscopio óptico. Para contar las células de un cultivo líquido, se debe agregar una gota de este entre estas dos placas y observar al microscopio óptico la cantidad de células presentes en un campo determinado de la grilla.

En base a la cantidad de células contadas, conociendo el volumen de líquido que admite el campo de la grilla, se calcula la concentración de células por unidad de volumen de la solución de medio de cultivo inicial. La profundidad de la cámara es de 0.1 mm. La cuadricula de recuento muestra 9 cuadros grandes, cada uno de un (1) mm 2 ; los cuatro cuadrados grandes de las esquinas están en 16 cuadrados con aristas de 0.25 mm. Se utiliza para el recuento de leucocitos. El cuadrado grande central esta dividido en 25 cuadrados medianos Con aristas de 0.2 mm, estando cada cuadrado mediano dividido en 16 cuadrados pequeños con aristas de 0.05 mm y una superficie de 0.0025 mm 2. Los 5 cuadrados medianos señalados se utilizan para el recuento de eritrocitos y trombocitos. Tiene especial relevancia que todos los cuadros medianos presentan en todos sus lados líneas límite triple. La línea central es la frontera y decide si las células de esta zona se deben contar o no. 13 Principio de construcción Todas las cámaras de conteo muestran el mismo principio de construcción. Ilustración 6. Cámara de Neubauer. Fuente: www.marienfeld-superior.com 13 WIKIPEDIA: la enciclopedia libre, noviembre 2008. Disponible en Línea: <http://es.wikipedia.org/wiki/c%c3%a1mara_de_neubauer>

Las dos superficies laterales más grandes están sin trabajar y sirven para la rotulación. El puente central y los dos puentes exteriores están rectificados planos y pulidos. La superficie del puente central es más profunda que los dos puentes exteriores. En el puente central (fondo de la cámara) están grabadas las redes de conteo. Cuando se coloca un cubreobjeto sobre los puentes exteriores, entre la cara inferior del cubreobjeto y el puente central de la cámara de conteo se produce una ranura capilar. 14 2.5. CLORO 2.5.1. Generalidades del cloro En la naturaleza no se encuentra en estado puro ya que reacciona con rapidez con muchos elementos y compuestos químicos, por esta razón se encuentra formando parte de cloruros (especialmente en forma de hipoclorito de sodio) y cloratos, en las minas de sal y disuelto en el agua de mar. Se emplea para potabilizar el agua de consumo disolviéndolo en la misma; también tiene otras aplicaciones como oxidante, blanqueante y desinfectante. En la siguiente tabla podemos encontrar las generalidades de este: Tabla 6. Generalidades del cloro. General Nombre Cloro Símbolo Cl Número atómico 17 Serie Química Halógenos Grupo VII A 14 Disponible en Línea. < http://www.crdi.ca/deslivresquicomptent/ev-84467-201-1-do_topic.html>

Periodo 3 Bloque P General Densidad 3,214 kg/m 3 Descubridor Carl Wilhelm Scheele (1.774) Propiedades atómicas Masa atómica 35,453 u Radio medio 100 pm Radio atómico calculado 79 pm Radio covalente 99 pm Radio de Van der Waals 175 pm Configuración electrónica [Ne]3s 2 3p 5 Estados de oxidación (Óxido) ±1, +3, +5, +7 (ácido fuerte) Estructura cristalina Ortorrómbica Propiedades físicas Estado de la materia Punto de fusión Punto de ebullición Entalpía de vaporización Entalpía de fusión gas (no magnético) 171,6 K 239,11 K 10,2 kj/mol 3,203 kj/mol Fuente: Jiménez García, Luis Felipe. Biología celular y molecular. Pag. 165. 2002 El cloro se puede encontrar en dos estados: Cloro gaseoso: A temperatura normal, el Cloro es un gas. Tiene las siguientes características: Tiene un color verde-amarillento. Es más pesado que el aire, así que normalmente se concentra a nivel del piso. Esto significa que los sótanos, áreas de almacenamiento subterráneas, los pozos para elevadores y otras áreas en su trabajo pueden convertirse en lugares peligrosos en caso de un escape o derrame accidental. El Cloro tiene un olor penetrante y huele a blanqueador.

Cloro líquido: Si el cloro es enfriado a -1.5 C (29.3 F) se convierte en un líquido. Tiene las siguientes características: Es de color ámbar. Es enviado en estado líquido para así ocupar menos espacio. Si el Cloro líquido se escapa de sus contenedores especiales, lo más seguro es que comenzará a hervir y se convertirá en gas. 15 2.5.2. Fabricación del cloro El primer proceso electrolítico para la producción de cloro fue patentado en 1851 por Charles Watt en Gran Bretaña. En 1868, Henry Deacon produjo cloro a partir de ácido clorhídrico y oxígeno a 400ºC (750ºF), con cloruro de cobre impregnado en piedra pómez como catalizador. Las celdas electrolíticas modernas pueden clasificarse casi siempre como pertenecientes al tipo de diafragma y de mercurio. Ambas producen sustancias cáusticas (NaOH o KOH), cloro e hidrógeno. 2.5.3. Propiedades del cloro El cloro presente en la naturaleza se forma de los isótopos estables de masa 35 y 37; se han preparado artificialmente isótopos radiactivos. El gas diatómico tiene un peso molecular de 70.906. El punto de ebullición del cloro líquido (de color amarillo-oro) es 34.05ºC a 760 mm de Hg (101.325 kilopascales) y el punto de fusión del cloro sólido es 100.98ºC. La temperatura crítica es de 144 ºC; la presión crítica es 76.1 atm. (7.71 megapascales); el volumen crítico es de 1.745 ml/g, y la densidad en el punto crítico es de 0.573 g/ml. Las propiedades termodinámicas incluyen el calor de sublimación, que es de 7370 (+-) 10 cal/mol a OK; el calor de vaporización, de 4878 (+-) 4 cal/mol; a 34.05 ºC; el calor de fusión, de 1531 cal/mol; la capacidad calorífica, de 7.99 cal/mol a 1 atm (101.325 kilopascales) y 0ºC, y 8.2 a 100ºC. 15 WIKIPEDIA: la enciclopedia libre, diciembre 2008. Disponible en Línea. http://es.wikipedia.org/wiki/cloro

2.5.4. Efectos ambientales del cloro, en animales y organismos acuáticos El cloro se disuelve cuando se mezcla con el agua. También puede escaparse del agua e incorporarse al aire bajo ciertas condiciones. La mayoría de las emisiones de cloro al medio ambiente son al aire y a las aguas superficiales. Una vez en el aire o en el agua, el cloro reacciona con otros compuestos químicos. Se combina con material inorgánico en el agua para formar sales de cloro, y con materia orgánica para formar compuestos orgánicos clorinados. Debido a su reactividad no es probable que el cloro se mueva a través del suelo y se incorpore a las aguas subterráneas. Las plantas y los animales no suelen almacenar cloro. Sin embargo, estudios de laboratorio muestran que la exposición repetida a cloro en el aire puede afectar al sistema inmunitario, la sangre, el corazón, y el sistema respiratorio de los animales. Es especialmente dañino para organismos que viven en el agua, y el suelo; las plantas también se ven atacadas por éste, que oxida la parte exterior de las hojas. 2.5.5. Efectos del cloro en la salud humana La exposición al cloro puede ocurrir en el lugar de trabajo o en el medio ambiente a causa de escapes en el aire, el agua o el suelo. Las personas que utilizan lejía en la colada y productos químicos que contienen cloro no suelen estar expuestas a cloro en sí. Generalmente el cloro se encuentra solamente en instalaciones industriales. El cloro entra en el cuerpo al ser respirado el aire contaminado o al ser consumido con comida o agua contaminadas. No permanece en el cuerpo, debido a su reactividad. Los efectos del cloro en la salud humana dependen de la cantidad de cloro presente, y del tiempo y la frecuencia de exposición. Los efectos también

dependen de la salud de la persona y de las condiciones del medio cuando la exposición tuvo lugar. La respiración de pequeñas cantidades de cloro durante cortos periodos de tiempo afecta negativamente al sistema respiratorio humano. Los efectos van desde tos y dolor pectoral hasta retención de agua en los pulmones. El cloro irrita la piel, los ojos y el sistema respiratorio. No es probable que estos efectos tengan lugar a niveles de cloro encontrados normalmente en la naturaleza. Los efectos en la salud humana asociados con la respiración o el consumo de pequeñas cantidades de cloro durante periodos prolongados de tiempo no son conocidos. Algunos estudios muestran que los trabajadores desarrollan efectos adversos al estar expuestos a inhalaciones repetidas de cloro, pero otros no. 16 16 Lenntech Agua Residual & Purificación del Aire Holding B.V. Disponible en Línea: http://www.lenntech.com/espanol/tabla-periodica/cl.htm

3. INDUSTRIA EVALUADA Para las pruebas de toxicidad realizadas con Daphnia pulex se tomó un vertimiento industrial que contiene cloro (hipoclorito de sodio). Para realizar los diez ensayos definitivos, se tomó el vertimiento de una industria tipo proveniente de una empresa, que en la desinfección de sus instalaciones utiliza cloro. Ésta empresa se encuentra ubicada en Villavicencio (Meta), se contó con la colaboración del gerente, el cual pidió no sea divulgado el nombre ni la ubicación exacta de la misma. Esta es una empresa que se dedica al desposte y comercialización de carnes. Se encuentra dividida en tres zonas: Desposte (ver ilustración 7) Cuarto frío (ver ilustración 9) Exhibición y venta de cortes finos (ver ilustración 10) Ilustración 7. Zona de desposte, vista desde afuera. Fuente: autora Ilustración 8. Zona de desposte, vista desde adentro

Ilustración 9. Cuarto frío. Fuente: autora Ilustración 10. Exhibición y venta de cortes finos. 3.1. PROCESO DE LAVADO DE LAS INSTALACIONES Primero aplican agua y detergente a paredes y pisos, luego refriegan con un paño las paredes y con una escoba el piso quitando manchas de sangre y retirando residuos sólidos presentes; pasados 15 minutos de la aplicación de estos, retiran completamente con agua limpia. Segundo, aplican agua y cloro en una proporción de 200 ml/10 L (hipoclorito de sodio) para la desinfección de las instalaciones; dejando actuar el desinfectante durante 30 minutos y proceden a retirar completamente con agua limpia.

4. METODOLOGÍA En esta parte se describe la forma como se realizó este proyecto de investigación, diseño experimental, preparación del agua reconstituida y medio Bristol, mantenimiento del cultivo, pruebas de sensibilidad, pruebas de toxicidad preliminar y definitiva, las replicas de los ensayos. 4.1. DISEÑO EXPERIMENTAL En esta investigación se controlaron y midieron las siguientes variables: Variable independiente: La variable que se manejó en las pruebas de toxicidad fue la concentración de las sustancias prueba o de interés (Dicromato de Potasio e Hipoclorito de Sodio) y el porcentaje de dilución del vertimiento. Buscando establecer un efecto sobre una determinada población en donde todas las unidades experimentales son homogéneas. Variables dependientes: la variable que se manejó fue la obtención de la concentración letal media del cloro en un tiempo de 48 horas de exposición por el ciclo de vida del organismo prueba (80-90 días) (CL50-48), dado que este resultado depende de los efectos que el ión tóxico del cloro le ocasiona a los organismo de prueba. Constantes: Durante la investigación fueron las siguientes: el número de organismo utilizados (20 neonatos de Daphnia Pulex por cada concentración), tiempo de exposición al tóxico (48 horas) y los parámetros fisicoquímicos requeridos durante el mantenimiento de los organismos y durante las pruebas toxicológicas (ph, dureza, temperatura y oxigeno disuelto). Estos parámetros fueron controlados con el fin de cumplir con los protocolos de la Universidad de La

Salle, validados para este tipo de ensayos. Estos protocolos (ajustados tomando como modelo los publicados por la metodología de la guía de CETESB (Brasil)), hacen parte del proyecto de investigación de los profesores Pedro Miguel Escobar Malaver, Yanneth Parra y Rubén Darío Londoño, Universidad de La Salle. Se encuentran disponibles en los archivos del laboratorio de Bioensayos de la Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria, para su consulta. En este diseño inicialmente se realizaron pruebas preliminares, utilizando rangos de concentraciones de 0.001, 0.01, 0.1, 1.0 y 10 ppm de Cloro. Posteriormente con los datos de los rangos obtenidos en el ensayo preliminar, se realizaron las diez pruebas definitivas, para obtener unos resultados estadísticamente confiables, utilizando cinco (5) organismos por recipiente, basándose en los protocolos establecidos por la Universidad de La Salle, baterías de cinco concentraciones más el control y cuatro réplicas por ensayo con un total de 24 recipientes por prueba toxicológica (ver tabla 7), 120 organismos por montaje y 20 organismos por concentración correspondiendo cada uno al 5%. Como se muestra a continuación: Tabla 7. Montaje del test general de ensayos. TEST DE ENSAYO [ ] Replicas Blanco C1 C2 C3 C4 C5 Fuente: autora

Una vez obtenidos los resultados de mortalidad se realizó el análisis probit para la obtención de la respectiva CL50-48, utilizando el protocolo LB06 Análisis de resultados, mediante el método de probit (ver anexo A) donde se dan a conocer los pasos a seguir para la obtención de la misma; la información obtenida a partir del experimento diseñado estadísticamente, fue analizado por el método conocido como Análisis de Varianza (ANOVA). Se trata de una técnica, que consiste en aislar y estimar las varianzas separadas que contribuyen a la varianza total de un experimento; es entonces posible, ensayar si ciertos factores producen resultados significativos diferentes de las variables ensayadas. En este caso, se realizó para determinar si existían o no, diferencias significativas en las mortalidades de los tratamientos, para ello se desarrollo el protocolo LB07 Análisis de Varianza ANOVA (ver anexo A), donde se describe el procedimiento para la realización del análisis. Estos protocolos hacen parte del proyecto de investigación de bioensayos y se encuentran disponibles en las diferentes tesis realizadas hasta el 2008 y en los archivos del Laboratorio de Bioensayos de la Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria, para su consulta. 4.2. PREPARACIÓN DEL AGUA RECONSTITUIDA El agua reconstituida fue realizada según metodología CETESB, protocolo L5.017 y Escobar Malaver con el fin simular las condiciones de sales disueltas encontradas en el hábitat natural de este tipo de organismos, por medio de la dureza en un intervalo que debe estar entre 40 48 mg/l CaCO3, preparada a partir de agua desionizada grado analítico. El agua reconstituida se preparó con los siguientes reactivos (ver tabla 8) y materiales:

Cloruro de Calcio (CaCl2) Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4*7H2O) Cloruro de potasio (KCl) Bicarbonato de sodio (NaHCO3) Acuario de 30 L Probeta de 500 ml Aireador de 1 salida Plástico (para cubrir los acuarios) ph-metro Oxímetro Tabla 8. Stock Preparación Agua Reconstituida. Reactivos Stokc (g/l) ml de Stokc para 20 L de agua destilada ml de Stokc para 30 L de agua destilada NaHCO3 10 100 150 CaCl2 13.5 75 112.5 KCl 10 38 57 MgSO4.7H2O 20.5 30 45 Fuente: Malaver Escobar, Pedro Miguel Una vez preparada el agua reconstituida, esta se debe oxigenar por un período mínimo de 48 horas antes de agregar los organismos. Se realizaron las pruebas de viabilidad para garantizar las óptimas condiciones del agua reconstituida. Para mantener un control y garantizar las condiciones ideales del agua para la Daphnia Pulex, se debe proceder a determinar unos parámetros de control (ver tabla 9), cada vez que se prepara el agua reconstituida.

Tabla 9. Parámetros de control a evaluar en el agua reconstituida. Parametros de Método según el Standard Rango Rango Ideal control Methods Dureza 2340 C Titulométrico EDTA 40-48 mg/l 45 mg/l Oxígeno Disuelto 4500-0 G. Electrodo de > 6 mg/l 6 mg/l Membrana ph 4500-H B Electrométrico 7.3 7.5 Unid. 7.4 Unid. Temperatura 2550 B Laboratorio 18 22 ºC 20 ºC Fuente: Bernal Paredes, Alba Janeth. Rojas Avellana, Andrea Paola, Determinación de la Concentración Letal Media (CL50-48) del Cromo y el Cobre por Medio de Bioensayos de Toxicidad Acuática sobre Daphnia Pulex, 2008, Universidad de La Salle, Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria. Para ello se desarrollo el protocolo LB01 Preparación del agua reconstituida (ver anexo A), en el cual, se describe la metodología que se debe realizar para preparar el agua reconstituida para el mantenimiento del cultivo y preparación de soluciones para las pruebas de toxicidad Este protocolo hace parte del proyecto de investigación de los profesores Pedro Miguel Escobar Malaver, Yanneth Parra y Rubén Darío Londoño y se encuentra en los archivos del laboratorio de Bioensayos de la Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria, para su consulta. Para determinar los efectos que generan la calidad del agua reconstituida preparada, sobre los organismos de prueba, se realizó un ensayo de viabilidad, que consiste en exponer algunos organismos en el agua reconstituida por un tiempo de 24 horas, determinando el porcentaje de mortalidad que debe ser menor al 10%, si se supera este porcentaje se descarta el agua reconstituida y se procederá a preparar una nueva con las anteriores características. 4.3. PREPARACIÓN DEL MEDIO BRISTOL Y CENTRIFUGACIÓN DE ALGAS VERDES Este medio se utiliza con el fin de multiplicar las algas, en condiciones estandarizadas por medio de la fotosíntesis. Hay diferentes medios para cultivar

algas verdes en el laboratorio. El más utilizado es el medio Bristol. En la siguiente tabla podemos ver la preparación del medio Bristol: Tabla 10. Preparación del medio Bristol No. Compuesto Stock ml. de Stock para 1 L de agua destilada 1 NaNO3 25.0 g/l 10 2 CaCl2.2H2O 2.5 g/l 10 3 MgSO4.7H2O 7.5 g/l 10 4 K2HPO4 7.5 g/l 10 5 NaCl 2.5 g/l 10 6 KH2PO4 17.5 g/l 10 7 KOH 15.5 g/ 500 ml 1 EDTA 25.0 g/ 500 ml 8 FeSO4.7H2O 2.49 g/ 500 ml 1 H2SO4 0.05 ml/ 500 ml 9 H3BO3 5.71 g / 500 ml 1 Solución de Elementos Traza 10 ZnSO4.7H2O 4.41 g/ 500 ml 11 MnCl2.4H2O 0.72 g/ 500 ml 12 MoO3 0.355 g/ 500 ml 13 CuSO4.5H2O 0.785 g/ 500 ml 14 Co(NO3)2.6H2O 0.245 g/ 500 ml 1 ml del stock combinado 15 CoCl2.6H2O 0.174 g/ 500 ml Fuente: ESCOBAR MALAVER, Pedro Miguel. Determinación de la toxicidad agua de los detergentes mediante sistemas estáticos, utilizando Daphnia Magna. Universidad de La Salle 1994. Se deben adicionar los volúmenes indicados de macronutrientes, más un (1) ml de los elementos traza y completar el volumen de la probeta que se desee preparar.

Posteriormente se lleva la solución ya preparada a la autoclave a una presión de 15 PSI y 250 F, luego se saca y se deja enfriar a temperatura ambiente antes de agregar los dos (2) ml. (según protocolos unisalle). A continuación se lleva a una probeta de 2 litros por un período de 15 días, con ayuda de una lámpara luminiscente de luz fría prendida las 24 horas y oxigenadas, garantizando el proceso de fotosíntesis. Para mayor información, se encuentra el protocolo LB02 Preparación del medio Bristol y centrifugación de algas verdes (ver anexo A), donde se describe la metodología para la realización del medio Bristol. Este protocolo hace parte del proyecto de investigación de los profesores Pedro Miguel Escobar Malaver, Yanneth Parra y Rubén Darío Londoño y se encuentra en los archivos del laboratorio de Bioensayos de la Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria, para su consulta. 4.4. ALIMENTACIÓN DE ORGANISMOS PRUEBA Scenedesmus acutus fue el tipo de algas verdes indicadas por los protocolos de la Universidad de La Salle, para el alimento de la Daphnia Pulex; este tipo de algas se cultivaron en el laboratorio de Bioensayos de la Universidad de La Salle por medio de la preparación del medio Bristol explicado anteriormente. Después de realizado el medio y pasado su proceso fotosintético y de centrifugación, se ejecuta un conteo de algas con la finalidad de proporcionar a los organismos la cantidad ideal, en la cual no se sobre alimentan ni se limiten. Se tuvo en cuenta que cada organismo en su mantenimiento, necesita una dosis de 3.0X10 6 células por Daphnia pulex/día, según metodología CETESB y Universidad Nacional de Colombia. Para este procedimiento se utiliza una herramienta científica que permite realizar el conteo de células por un volumen determinado (1X10 4 ml), la cámara cuenta

con una profundidad de 0.1 mm. La cuadrícula (ver ilustración 11) de recuento muestra 9 cuadros grandes, cada uno de un (1) mm 2 ; los cuatro cuadrados grandes de las esquinas señalados con una L están en 16 cuadrados con aristas de 0.25 mm. 17 Ilustración 11. Cuadricula cámara Neubauer Fuente: http://www.idrc.ca/en/ev-84467-201-1-do_topic.html La realización de este procedimiento se encuentra establecido en el protocolo LB03 Conteo de algas con la cámara Neubauer (ver anexo A), donde se describen los pasos a seguir para el desarrollo del mismo. Este protocolo hace parte del proyecto de investigación de los profesores Pedro Miguel Escobar Malaver, Yanneth Parra y Rubén Darío Londoño y se encuentra en los archivos del laboratorio de Bioensayos de la Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria, para su consulta. En la siguiente ilustración se observa la cámara Neubauer: 17 Alarcón Orjuela, Julie Andrea. Ardila Amaya Liz Natalia, Determinación de la concentración letal media (CL50 48) de Daphnia Pulex por medio de bioensayos de toxicidad acuática con aluminio y plata.

Ilustración 12. Cámara de Neubauer Fuente: http://www.idrc.ca/en/ev-84467-201-1-do_topic.html En esta fase se determinó según protocolos del convenio UN-CAR del año 1994 que la frecuencia de alimentación son los días lunes, miércoles y viernes de cada semana. 4.5 ACLIMATACIÓN DE LOS ORGANISMOS PRUEBA El cambio de grupo se realizó por 15 días. Se procedió de forma gradual a la adaptación de los organismos al nuevo grupo para evitar que estos fueran a sufrir estrés, nacieran efípidos o empezara a descender la población.

4.6. MANTENIMIENTO DEL CULTIVO DE LOS ORGANISMOS DAPHNIA PULEX El mantenimiento del cultivo, se realizó según la metodología CETESB (L5.018), para conservar un cultivo masivo de 4 edades. Los cultivos de Daphnia pulex se mantuvieron en peceras de 2 L, con agua reconstituida y 20 individuos en cada una de ellas, manejando la relación de 1/100 (1 individuo por cada 100ml de agua), con el fin de establecer el escenario óptimo para el crecimiento, alimentación y reproducción de los individuos. El cultivo se renovaba de acuerdo al ciclo reproductivo de la Daphnia Pulex, conservándose en las etapas óptimas de reproducción, manteniéndolas en peceras separados (ver ilustración 14) por edad desde 0 1 semana hasta cuatro semanas; eliminando los organismos mayores a cinco semanas y renovando el cultivo con neonatos que se obtuvieron ese día. Esto se controlaba según la fecha de separación que cada pecera tenia. El cultivo se manejo en 4 peceras por semana obteniendo 16 peceras (ver ilustración 13) en el mes con un total de 320 organismos cultivados, hasta obtener organismos de quinta generación; para mayor información revisar el protocolo LB04 Mantenimiento del Cultivo (ver anexo A), este protocolo hace parte del proyecto de investigación de los profesores Pedro Miguel Escobar Malaver, Yanneth Parra y Rubén Darío Londoño y se encuentra en los archivos del laboratorio de Bioensayos de la Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria, para su consulta. Ilustración 13. 16 peceras en el mes. Fuente: autora

Ilustración 14. Separación y mantenimiento de organismos prueba Fuente: BERNAL Y ROJAS, 2007. Modificado por OROZCO Y TORO, 2008. Se verificaba diariamente la temperatura ambiente, corroborando que se encontrara en un promedio de 20 ± 2 C. Adicionalmente con el fin de mantener condiciones óptimas para el crecimiento de los individuos, estuvieron expuestos con un fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, controlado con un temporizador, el cual apagaba la luz a las 9:00 p.m. y la volvía a encender a las 5:00 a.m., y una intensidad lumínica de alrededor de 1000 lux.

4.6.1. Separación de organismos La separación de los organismos se realizó todos los días, con ayuda de una pipeta Pasteur de plástico de 3 mililitros, con ella se extraían los neonatos de 6 a 24 horas de nacidos. La obtención de neonatos se utilizaba para la nueva generación de los cultivos, pruebas de viabilidad, pruebas de sensibilidad y, realización de las pruebas preliminares y definitivas de toxicidad. 4.7. FASE PRUEBAS DE TOXICIDAD Se realizaron las pruebas de toxicidad manejando las siguientes condiciones: Tabla 11. Condiciones de mantenimiento del cultivo de Daphnia Pulex Condición Temperatura Iluminación Edad del organismo de prueba Alimento Blanco o control Duración del ensayo Justificación Se manejo la misma temperatura con la que mantenía el cultivo, 20 +/- 2ºC esto para evitar que los organismos murieran por un cambio de temperatura. Sin iluminación, con el fin de que el organismo no se sintiera atraído por la luz y tuviese contacto con toda la solución. Neonatos < 24 horas, ya que los neonatos son más sensibles a los tóxicos. Sin alimento, ya que cuentan con nutrientes que les permiten sobrevivir sin alimento durante dos días, igualmente para descartar que el organismo fuese afectado posiblemente por este, además se estaría hallando la dosis letal y esta no es el objetivo de la investigación. En cada prueba o batería de ensayos se colocó un blanco o control, comprobando así que el organismo muriera por el tóxico y no por otras características del ambiente o del medio. 48 horas, ya que se tomó aproximadamente una décima parte del ciclo de vida del organismo. Fuente: Alarcón Orjuela, Julie Andrea. Ardila Amaya Liz Natalia, Determinación de la concentración letal media (CL50 48) de Daphnia pulex por medio de bioensayos de toxicidad acuática con aluminio y plata

A continuación se presenta la ejecución de las pruebas de toxicidad, donde se da a conocer la preparación de las soluciones, montajes de las pruebas de toxicidad y realización de las pruebas de sensibilidad con dicromato de potasio y las pruebas con sustancias puras y vertimientos de cloro. 4.7.1. Preparación de soluciones Las soluciones para todas las pruebas de toxicidad fueron preparadas con agua reconstituida, cada una con un volumen de 500 ml, las cuales se mantuvieron preservadas en refrigerador por un tiempo no mayor a seis (6) meses. Antes de la realización de los ensayos de toxicidad, las soluciones preparadas eran aclimatadas durante un período de 3 horas, para evitar la mortandad de los organismos prueba debido a un cambio de temperatura. 4.7.2. Montaje de las pruebas de toxicidad (bioensayos). Como material para la batería de ensayo, se utilizaron 24 recipientes en una bandeja (ver ilustración 15), distribuidos en cinco (5) concentraciones de las respectivas soluciones para las pruebas de sensibilidad (K2Cr2O7), sustancia pura (cloro) y muestra ambiental sin tratar y tratada (vertimiento que contiene trazas de cloro), un control y cuatro réplicas por cada concentración. Teniendo lista la batería de ensayos se procedió adicionando 10 mililitros de las concentraciones a evaluar en cada recipiente y sus respectivos controles. Ilustración 15. Montaje para las pruebas de toxicidad. 1. Se ubicó la batería de ensayo en una bandeja. 2. Se adicionó 10 ml de solución en cada recipiente según concentración y 5 neonatos.

3. Se tapó la bandeja con papel kraf. 4. Se introdujo la bandeja en una bolsa de tela. Fuente: autora La prueba se inició en el momento de adicionar un total de 20 organismos por concentración distribuidos en un número de cinco (5) neonatos en cada uno de los recipientes de las cuatro replicas, utilizándose un total de 120 organismos por batería de ensayo. La batería de ensayo se cubre totalmente con una bolsa de tela negra, y se guarda en el área de mantenimiento de cultivos a una temperatura de 20± 2 C por un periodo de 48 horas. Al término de las 48 horas se revisó, con ayuda de una lámpara con lupa, la lectura de los organismos muertos en cada recipiente, haciendo un reporte del número de ellos (ver anexos B, C, D, E y F). Este procedimiento lo podemos encontrar en el Protocolo LB05 Pruebas de Toxicidad (ver anexo A). Este protocolo hace parte del proyecto de investigación de los profesores Pedro Miguel Escobar Malaver, Yanneth Parra y Rubén Darío Londoño y se encuentra en los archivos del laboratorio de Bioensayos de la Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria, para su consulta. 4.7.4. Pruebas de toxicidad de sensibilidad con el tóxico de referencia dicromato de potasio (K2Cr2O7) La sensibilidad, tiene el propósito de garantizar no solo la confiabilidad de los datos obtenidos de las pruebas con otros tóxicos, en relación con la capacidad de respuesta de los organismos de prueba, sino el estado fisiológico del cultivo y sus condiciones.

Este paso se ejecutó utilizando la metodología descrita en el protocolo LB05 Pruebas de Toxicidad (ver anexo A), obteniendo así la carta de control. Este protocolo hace parte del proyecto de investigación de los profesores Pedro Miguel Escobar Malaver, Yanneth Parra y Rubén Darío Londoño y se encuentra en los archivos del laboratorio de Bioensayos de la Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria, para su consulta. Se expusieron neonatos de Daphnia pulex, de 24 horas de nacidos a diferentes concentraciones de dicromato de potasio y se determinó la CL50-48 que generan la muerte del 50% de los organismos expuestos en un período de 48 horas. 4.7.3.1. Pruebas preliminares (K2Cr2O7) En las que se empleo un rango consultado en diferente bibliografía y trabajos realizados anteriormente en la Universidad de La Salle, con el fin de establecer el 0% y 100% de mortalidad del tóxico de referencia Dicromato de Potasio (K2Cr2O7); las concentraciones utilizadas fueron 0.5, 0.3, 0.2, 0.1 y 0.05 ppm sobre los organismos. 4.7.3.2. Pruebas definitivas (K2Cr2O7) En estas pruebas se utilizaron los rangos seleccionados de acuerdo con los resultados de los ensayos preliminares, con esto se obtiene la concentración letal media (CL50-48) del tóxico de referencia. 4.7.4. Pruebas con cloro A partir de Hipoclorito de Sodio (NaClO), (r.a. reactivo analítico Lega Químicos, Número A354690-223 UN 3077), se realizaron estas pruebas, el cual se encontraba a una concentración de 160.550 ppm; luego se realizó con este una solución madre y se dividió en cinco concentraciones las cuales se preparaban cada vez que se realizaba un ensayo.

Esta etapa se estableció mediante la metodología descrita en el protocolo LB05 Pruebas de Toxicidad (ver anexo A), obteniendo la concentración letal media (CL50-48) del cloro con sus límites de confianza manejando la metodología descrita en el protocolo LB06 Análisis de Regresión y Análisis Probit (ver anexo A) y validando los resultados por medio de análisis de varianza (ANOVA), cuya metodología esta descrita en el protocolo LB07 Análisis de varianza (ver anexo A). Estos protocolos hacen parte del proyecto de investigación de los profesores Pedro Miguel Escobar Malaver, Yanneth Parra y Rubén Darío Londoño y se encuentran en los archivos del laboratorio de Bioensayos de la Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria, para su consulta. 4.7.4.1. Pruebas preliminares (cloro) Se prepararon 5 concentraciones iníciales con base a la concentración letal media del cloro que se encuentra en diferente bibliografía (0,001 ppm a 10 ppm), y se realizaron pruebas por cuadruplicado (según protocolos unisalle), se observa como es la mortalidad de estas (0% al 100%) y de acuerdo a los resultados se procede a aumentar o disminuir las concentraciones de acuerdo a los resultados que se obtengan luego de 48 horas. 4.7.4.2. Pruebas definitivas con Cloro En estas pruebas se utilizaron los rangos seleccionados de acuerdo con los resultados de los ensayos preliminares, quedando de esta forma las siguientes concentraciones: 0.001, 0.01, 0.1, 1 y 10 ppm con esto se obtiene la concentración letal media (CL50-48) de la sustancia pura. 4.7.5. Toma y preservación de muestras ambiéntales para los ensayos de toxicidad La recolección de las muestras ambientales se realizó en recipientes plásticos de dos litros y medio (2.5) de capacidad. Las muestras fueron tomadas de la parte del proceso de enjuague de las instalaciones en general.

Las pruebas se realizaron dentro de las 24 horas después de la recolección de las muestras evitando las posibles alteraciones de sus características, por lo que se mantuvieron refrigeradas durante su transporte al laboratorio de la Universidad de La Salle con ayuda de hielo seco y una nevera para su posterior almacenamiento en el refrigerador del laboratorio de Bioensayos de la facultad de Ingeniería ambiental y Sanitaria. 4.7.6. Análisis fisicoquímicos a los vertimientos A las muestras se le realizaron los siguientes análisis fisicoquímicos: Tabla 12. Análisis Fisicoquímicos Parametro Método y lugar de análisis Cloro Residual Laboratorio AMBITEST, ubicado en la Carrera 26 No. 21-47 (Yopal Casanare) a través del método yodométrico y utilizando el Standard Methods Edición 19, 1995, SM 4500 G. Cloro Total Laboratorio AMBITEST, ubicado en la Carrera 26 No. 21-47 (Yopal Casanare) a través del método yodométrico y utilizando el Standard Methods Edición 19, 1995, SM 4500 G. DQO El análisis se realizó en el laboratorio de la Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria de la Universidad de La Salle. La muestra fue preservada con Ácido Sulfúrico (H2SO4) hasta obtener un ph 2. Se utilizó el método de reciclo cerrado, la lectura se realizó en el espectrofotómetro (Hach), Standard Methods Edición 19, 1995, 5220D-2B. Dureza Se utilizó el método titulométrico de EDTA Standard Methods Edición 19, 1995, SM 2340-C. El análisis se realizó en el laboratorio de la Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria de la Universidad de La Salle. Conductividad Se utilizó el método Standard Methods Edición 19, 1995, SM 2510-B. El análisis se realizó en el laboratorio de la Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria de la Universidad de la Salle. Sólidos Suspendidos Se utilizó el método Standard Methods Edición 19, 1995, SM 2540-D. El análisis se realizó en el laboratorio de la Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria de la Universidad de la Salle. Oxígeno Disuelto Se utilizó el método Standard Methods Edición 19, 1995, SM 2510- B. El análisis se realizó en el laboratorio de la Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria de la Universidad de la Salle.

Parámetro ph Temperatura Método y lugar de análisis Se utilizó el método Standard Methods Edición 19, 1995, SM 4500-H+B. El análisis se realizó en el laboratorio de la Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria de la Universidad de la Salle. In situ Fuente: Autora 4.7.7. Pruebas preliminares y definitivas con el vertimiento de cloro Para lograr valores de 0% a 100% de mortalidad en estas pruebas definitivas se inicia con la preparación de soluciones del vertimiento diluidas con agua reconstituida manejando diferentes porcentajes de volumen de muestra. Las primeras concentraciones por poseer porcentajes muy altos de cloro, en las primeras horas de las pruebas se presento una mortalidad del 100%, procediendo a disminuir las concentraciones por medio de diluciones hasta obtener un rango efectivo para realizar las pruebas definitivas. Se prepararon las muestras ambientales, y se procedió a sembrar en las copas plásticas, agregando a cada copa 10 ml de muestra con sus respectivas replicas y el control (agua reconstituida). 4.8. RESULTADOS FISICOQUÍMICOS FINALES Las pruebas finales tienen la misma metodología que las pruebas preliminares. Se debe proceder a realizar la lectura de los organismos muertos después de las 48 horas siguientes a la siembra, adicionalmente se debe proceder a medir el oxígeno disuelto, la dureza y el ph, en las dos concentraciones extremo de la batería, para corroborar que el efecto tóxico fue producido por un agente químico, en este caso el cloro, y no por las constantes que se manejan en la prueba toxicológica. De igual manera las pruebas definitivas son consideradas válidas según metodología CETESB, dentro de las siguientes condiciones:

La mortalidad en los controles no debe ser mayor del 10% y preferiblemente no más del 5%. Si la mortalidad en el control sobrepasa el 10%, esta prueba se considera no representativa, se descarta y se requiere la repetición de la misma. La concentración de oxígeno disuelto en las soluciones test durante el transcurso del ensayo debe ser mayor a 4mg/L. 4.9. OBTENCIÓN DE RESULTADOS La estimación de este valor sigue un modelo matemático que asume relación continua entre dosis y respuesta. El valor se calcula con una confiabilidad del 95%. Este valor se obtiene por medio del método Probit, obteniéndose la CL50-48 con sus respectivos límites de confianza para ello se realizó el protocolo LB06 Análisis de Regresión Y Análisis Probit (ver anexo A). Después de tener este resultado se procede a realizar el análisis de varianza según el protocolo LB07 Análisis de varianza (ver anexo A), para comprobar que a diferentes concentraciones de la sustancia pura o vertimiento produce un diferente efecto en todos los organismos. Estos protocolos hacen parte del proyecto de investigación de los profesores Pedro Miguel Escobar Malaver, Yanneth Parra y Rubén Darío Londoño y se encuentran en los archivos del laboratorio de Bioensayos de la Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria, para su consulta. 4.10. OBTENCIÓN DEL ÍNDICE TOXICOLÓGICO Para el cálculo del índice toxicológico se contó con siguiente información: Caudal del vertimiento industrial Concentración Letal Media (CL 50-48) del vertimiento

Carga tóxica del efluente Para el cálculo de la carga tóxica se utilizó la siguiente ecuación: expresada en unidades tóxicas (UT). Carga Tóxica (UT) 100 CL50 Fuente: ESCOBAR, MALAVER; Pedro Miguel. Implementación de un sistema de alerta de riesgo toxicológico utilizando Daphnia pulex para la evaluación de muestras ambientales.1997. _ Q En donde: CL 50: Concentración letal media (concentración del efluente que produjo la mortalidad del 50% de los organismos expuestos en un período de 48 horas). _ Q : Caudal promedio del efluente (m 3 /mes), el cual varía según la producción de la empresa evaluada. CT: Carga Tóxica, expresada en unidades tóxicas. 4.11. INDICE TOXICOLÓGICO DEL VERTMIENTO Con el cálculo y transformación logarítmica en base 10 de la carga tóxica se obtuvo el índice toxicológico de la siguiente manera: IT=Log (1+UT) Fuente: ESCOBAR, MALAVER; Pedro Miguel. Implementación de un sistema de alerta de riesgo toxicológico utilizando Daphnia pulex para la evaluación de muestras ambientales.1997. Con el IT se clasificó el vertimiento, basado en los rangos (ver tabla13) establecidos en la tesis Implementación de un sistema de alerta de riesgo toxicológico utilizando Daphnia pulex para la evaluación de muestras ambientales, realizada por Escobar Malaver; Pedro Miguel.

Tabla 13. Rangos de índices toxicológicos Rangos Carga Tóxica 1-1.99 Despreciable 2-2.99 Reducida 3-3.99 Moderada 4-4.99 Considerable > 5 Elevada Fuente: ESCOBAR, MALAVER; Pedro Miguel. Implementación de un sistema de alerta de riesgo toxicológico utilizando Daphnia Pulex para la evaluación de muestras ambientales.1997. Unidades de toxicidad y emisiones tóxicas Concepto de unidad de toxicidad: una extrapolación altamente simplificada para pasar datos de toxicidad de laboratorio al ambiente es el cálculo de la unidad de toxicidad (UT, grado de toxicidad de un efluente, o la concentración de una sustancia expresada como una fracción del punto final de toxicidad medido: 1/CL50). Este tipo de datos resulta más visual y práctico al momento de realizar evaluaciones ambientales, ya que el valor numérico se incrementa con el aumento de la toxicidad de un determinado compuesto o muestra compleja (US EPA, 1993). La Unidades tóxicas (UT): se definen de la siguiente manera: 1 Unidad tóxica aguda (Uta) = 1 CL50 x 100 (expresada en %) 4.12. COMPARACIÓN DE RESULTADOS Las concentraciones letales medias del cloro, que se obtuvieron durante esta investigación, se compararon con otros resultados encontrados en pruebas de toxicidad realizados en laboratorios de investigación del exterior, para validar los resultados obtenidos.

mediante bioensayos de toxicidad acuática utilizando Daphnia Pulex Esquema 3. Metodología para la determinación de la concentración letal media METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA (CL50-48) DEL CLORO POR MEDIO DE BIOENSAYOS DE TOXICIDAD SOBRE Daphnia Pulex. DISEÑO EXPERIMENTAL MANTENIMIENTO Y ALIMENTACIÓN PRUEBAS DE TOXICIDAD Variables a medir y controlar Preparación medio bristol Preparación Reconstituida agua Ensayos con dicromato Bioensayo Cloro Ind. Dep. Cte. Centrifugación de algas Lectura 48 horas Determinación de la sensibilidad Concentraciones sustancias prueba ph, Dureza, OD y T. Conteo en cámara de Neubauer Pruebas preliminares Ensayo de toxicidad con sustancias puras Dicromato, Cloro, Vertimiento sin tratar, Vertimiento tratado. CL50-48 Cloro Obtención de neonatos Metología probit Pruebas definitivas Ensayo de toxicidad con vertimiento industrial Caracterización Obtención de la CL50-48 Análisis de varianza Obtención de la carga tóxica Cálculo índice toxicológico ANALISIS DE RESULTADOS Fuente: autora

5. RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS En esta investigación, los ensayos de toxicidad, se trabajaron bajo los protocolos que hacen parte del proyecto de investigación de los profesores Pedro Miguel Escobar Malaver, Yanneth Parra y Rubén Darío Londoño, Universidad de La Salle. La mayoría de los protocolos de bioensayos validados han sido ajustados tomando como modelo los publicados por la metodología de la guía de CETESB (Brasil). Un aspecto muy importante en las pruebas de toxicidad de sensibilidad es obtener resultados similares con la misma sustancia química; estandarizando las pruebas bajo los protocolos establecidos por la Universidad de La Salle, los cuales especifican un número mínimo de veinte (20) ensayos de toxicidad consecutivos con el tóxico de referencia (K2Cr2O7), antes de realizar las pruebas definitivas con el agente tóxico. Así se analizó cada resultado obtenido de acuerdo con los objetivos planteados y la metodología establecida, a continuación se dan conocer los resultados y análisis de resultados de éste proyecto de investigación: 5.1. PREPARACIÓN DEL AGUA RECONSTITUIDA El agua se preparó en un acuario con una capacidad de 20 litros, la cual era aireada constantemente para garantizar que el Oxígeno Disuelto fuera mayor de 6 mg/l, los acuarios eran tapados con plástico y sellados con cinta para evitar cualquier tipo de contaminación del agua (ver ilustración 16); garantizando una dureza entre 40 48 mg/l CaCO3 necesaria para la supervivencia de las Daphnia Pulex. En la siguiente tabla se presentan los resultados definitivos durante la investigación:

Tabla 14. Registro de datos del agua reconstituida Fecha de preparación Dureza (mg CaCO3/L) ph OD (mg O2/L) 30/06/08 42,0 7,43 6,00 07/07/08 45,0 7,49 6,42 17/07/08 42,0 7,45 6,45 26/07/08 43,0 7,46 6,52 04/08/08 42,0 7,42 6,23 18/08/08 42,0 7,43 6,45 30/08/08 43,0 7,43 6,36 08/09/08 45,0 7,48 6,18 18/09/08 43,0 7,43 6,75 27/09/08 42,0 7,45 6,23 15/10/08 42,0 7,42 6,52 30/10/08 42,0 7,42 6,61 13/11/08 43,0 7,42 6,58 21/11/08 43,0 7,45 6,43 29/11/08 45,0 7,47 6,31 10/12/08 43,0 7,41 6,14 01/01/09 43,0 7,40 6,42 Fuente: autora Ilustración 16. Acuario agua reconstituida. Fuente: autora 5.3. PREPARACIÓN DEL MEDIO BRISTOL Y CENTRIFUGACIÓN DE ALGAS VERDES Las algas utilizadas como alimento para las Daphnia pulex en está investigación son las Scenedesmus acutus. El concentrado inicial de estas algas fue suministrado por la Universidad Javeriana.

Como se observa en la ilustración 17 este fue el montaje utilizado para preparar el medio Bristol, el cual era oxigenado con aireador e iluminado con una lámpara las 24 horas del día para garantizar el proceso de fotosíntesis; este montaje se dejaba un periodo de 15 días. Ilustración 17. Montaje medio Bristol. Fuente: autora Transcurrido este tiempo el medio Bristol tomaba un color de transparente a verde oscuro, indicando que ya se encontraba en condiciones para centrifugar, es importante establecer que no se debe pasar del tiempo indicado, ya que las algas se precipitan y su color se torna marrón, y habría que desechar el montaje en este caso. Se trasvasan los 2 litros de medio Bristol del recipiente a una beaker de 2000 ml, para transferirlos a tubos de centrifuga. Se procede a ingresar los tubos a la centrifugadora, como se aprecia en la Ilustración 18, con una velocidad de 2500 rpm en un tiempo de 15 minutos según metodología CETESB.

Ilustración 18. Medio Bristol listo para centrifugar Fuente: autora Transcurrido el tiempo se retiran los tubos de la centrifuga y se procede a retirar el sobrenadante. El concentrado de algas que queda depositado en el fondo del tubo, es extraído por medio de una pipeta Pasteur y son depositadas en frascos de plástico, totalmente sellados con papel parafilm, rotulados e identificados para ser guardados en la nevera, en un periodo máximo de 20 días. 5.3. ALIMENTACIÓN DE ORGANISMOS PRUEBA A continuación se presentan los resultados obtenidos de la lectura de la cámara Neubauer, para determinar el volumen de algas que se suministró a los cultivos de Daphnia Pulex en las peceras. En el conteo realizado en el microscopio se hallaron los siguientes datos, en cada cuadricula (conteo 18/09/08):

1 2 18 24 32 20 30 33 3 17 12 7 9 7 9 14 4 5 18 26 13 15 19 19 22 21 De las células contadas en cada cuadro en forma diagonal se multiplicó por 4 o 5 dependiendo de la cuadricula; se sumaron los valores obtenidos hallando su promedio, así: Lectura1 (18 4) (32 4) (30 4) (33 4) 452 Lectura 2 (24 4) (20 4) (17 4) (12 4) 292 Lectura 3 (7 5) (9 5) (7 5) (9 5) (14 5) 230 Lectura 4 (18 4) (13 4) (19 4) (22 4) 288 Lectura 5 (26 4) (15 4) (19 4) (21 4) 324 Lecturas 1586 X 317,2 Se determinó la cantidad de células que existen en un 1 ml, partiendo que la cámara tiene una capacidad de 1 x 10 4 ml, de la siguiente manera: Xcélulas No. células 4 1 10 1ml 317,2células No. células 4 1 10 1ml No. células 3,172 10

Este valor se multiplicó posteriormente por el factor de dilución, dado así el valor real de células que existe en 1 ml. Se realizó una dilución de 0,1 ml. de alga concentrada y 2,9 ml. de agua destilada, el factor de dilución es de 30. 3,172 10 6 factordedilución 3,172 10 6 100 317,2 6 10 células 1ml Se calculó el volumen de alimento que necesita cada pecera que contiene 20 Daphnia Pulex con la siguiente fórmula: V A B C Donde: V = Volumen del concentrado de algas. A = Número de Daphnia Pulex por pecera. B Dosis óptima recomendada (3.0 x 10 6 células por Daphnia pulex /día). (Según metodología CETESB / L5.018). C = Concentración (número de células/ml) de la suspensión de algas descritas y halladas anteriormente. V V A B C 20(3 317,2 10 6 10 ) 6 0,19ml / día Con base en los resultados obtenidos en el conteo de la cámara Neubauer y al número de organismos por pecera el volumen de alimento es el que se presenta en la siguiente tabla:

Tabla 15. Volumen de alimento administrado a cada pecera Volúmen de alimento por pecera Día de alimentación Cantidad de alimento ml/día Lunes 0,19 Miércoles 0,19 Viernes 0,19 Fuente: autora 5.5. MANTENIMIENTO DEL CULTIVO DE LOS ORGANISMOS PRUEBA, Daphnia Pulex Los organismos prueba se ubicaron en el laboratorio de bioensayos, en un área aislada con acceso restringido e iluminación. Se dispuso de un estante, donde se ubicaron las diferentes peceras conteniendo los organismos para su mantenimiento, debidamente tapadas y rotuladas con la fecha en que fueron separadas (ver ilustración 19), el cual es protegido por un plástico que cubre todo el estante evitando polvo y gases externos, que puede afectar la calidad del agua y del cultivo. Ilustración 19. Área de ubicación de las peceras Fuente: autora 5.6. PRUEBAS DE TOXICIDAD DE SENSIBILIDAD CON EL TÓXICO DE REFERENCIA DICROMATO DE POTASIO (K2Cr2O7) La concentración letal media del dicromato de potasio se determinó con las concentraciones ya establecidas 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, y 0.5 respectivamente

(tomadas de diferente bibliografía), en las cuales se tuvo un porcentaje de mortalidad de 0% al 100%, estos resultados (ver tabla 16), se calcularon con el programa estadístico Probit, en el cual se suministraron los datos de los ensayos, determinando sus respectivos límites de confianza del 95%, la CL50-48 promedio, la desviación estándar, y con ellos se construyo la carta de control, que se presenta a continuación: Tabla 16. Carta de control con dicromato de potasio en D. Pulex 95 % Límite de confiabilidad Lim. Lim. F. No. de CL 50 48 Inferior Superior Calculado Ensayo Fecha (ppm) (ppm) (ppm) 1 03/07/2008 0,180 0,143 0,208 105,646 2 03/07/2008 0,274 0,199 0,408 46,460 3 04/07/2008 0,176 0,143 0,215 104,200 4 04/07/2008 0,277 0,188 0,490 84,969 5 10/07/2008 0,198 0,161 0,242 68,266 6 11/07/2008 0,260 0,218 0,318 188,400 7 11/07/2008 0,179 0,136 0,210 59,914 8 17/07/2008 0,284 0,201 0,467 60,458 9 17/07/2008 0,181 0,145 0,216 97,153 10 17/07/2008 0,291 0,199 0,515 29,152 11 18/07/2008 0,182 0,146 0,224 77,960 12 18/07/2008 0,252 0,21 0,294 197,600 13 24/07/2008 0,217 0,178 0,264 78,920 14 24/07/2008 0,176 0,120 0,248 60,436 15 25/07/2008 0,207 0,159 0,275 17,762 16 08/08/2008 0,273 0,185 0,300 22,841 17 08/08/2008 0,273 0,234 0,317 78,323 18 08/08/2008 0,229 0,167 0,315 26,657 19 08/08/2008 0,269 0,220 0,339 47,114 20 08/08/2008 0,266 0,219 0,331 60,400 Varianza F.0.05 Teórico 2.77 Promedio 0.232 0.179 0.310 75.631 2.77 Fuente: autora Se determinó que el rango de sensibilidad se encuentra entre 0,179 y 0.310 ppm, con una CL50 de 0,232 ppm; los valores por debajo de 0,179 ppm muestran una

CL50 (ppm) Determinación de la concentración letal media (CL50-48) del cloro en el efluente de una industria tipo mayor sensibilidad, esto se aprecia en los ensayos No. 3 y 14, periodo donde se presentaron situaciones adversas en el laboratorio, como la presencia de olores ofensivos debido a la descomposición del alimento para las larvas y por el mal funcionamiento del extractor de olores. La gráfica 1 muestra los resultados de las pruebas de sensibilidad realizadas durante el proyecto de investigación, arrojando datos de CL50-48. Gráfica 1. Sensibilidad del cultivo al toxico de referencia Concentración Letal Media (CL50) de Dicromato de Potasio 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 No. Réplicas CL50 Lim. Inf. Lim. Sup. Prom. CL50 Fuente: autora En la gráfica presentada anteriormente se puede observar que la sensibilidad de los organismos fue relativamente constante, ya que observamos que mantuvo un comportamiento siempre por arriba y por abajo con relación al valor promedio. Durante el estudio que se ha realizado en la universidad, con los organismos Daphina pulex, se observa que el rango de sensibilidad frente al dicromato de potasio (K2Cr2O7) ha ido variando (ver Tabla 17) ya que anteriormente en el Laboratorio de Ingeniería Ambiental los cultivos eran expuestos a olores de

detergentes aromatizantes, vapores durante los análisis de aguas residuales, ruido, entre otros, factores que desestabilizan el cultivo; también influye el periodo climático, ya que al finalizar cada época (invierno o verano) estas varían su metabolismo y se adaptan a las temperaturas registradas en el ambiente. En la siguiente tabla se encuentra la recopilación de datos: Tabla 17. Sensibilidad con Dicromato de Potasio (estudios realizados en la Universidad de La Salle). Año CL50-48 (ppm) Limite inferior (ppm) Limite superior (ppm) Referencia 1997 0.117 0.0381 0.1969 Escobar, 1997 2007 0.394 0.221 0.563 Bernal y Rojas, 2007 2007 0.097 0.068 0.121 Orozco y Toro, 2007 2008 0.153 0.1170 0.1872 Alarcón y Ardila, 2008 2009 0.232 0.179 0.310 López Fuente: modificado por autora, 2009. Los valores de sensibilidad encontrados en este proyecto están dentro o cercanos a los hallados en bioensayos realizados anteriormente en la Universidad de La Salle. 5.6.1. Análisis de varianza de las pruebas de la carta de control con dicromato de potasio sobre Daphnia Pulex Siguiendo la metodología del protocolo LB07 de Análisis de Varianza (ver anexo A), se realizó el análisis correspondiente de varianza para la carta control con dicromato de potasio sobre Daphnia Pulex (ver anexo B). Para la realización del ANOVA de cada una de la pruebas (ver tabla 16), se postuló la hipótesis nula y la hipótesis alternativa de la siguiente forma: Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos.

H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Para el análisis del resultado se debe tener en cuenta la siguiente condición: Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alternativa. Fc< Ft: se acepta la hipótesis nula y se rechaza la hipótesis alternativa. Como lo muestra la tabla 16, Fc > Ft, en las 20 pruebas de la carta control, por lo tanto se rechaza la hipótesis nula y se garantiza la validez de los datos. 5.6. PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON CLORO 5.6.1. Test preliminar Para determinar la CL50-48 del cloro en el test preliminar se tomaron las concentraciones de 0,001 ppm, 0,01 ppm 0,1 ppm 1 ppm y 10 ppm (halladas en bibliografía de ensayos con cloro) de una solución patrón de Hipoclorito de sodio (NaClO). Se realizaron 5 ensayos, esto con el fin de ajustar los rangos de la CL50-48. Durante la lectura de estas pruebas se encontró, que la mortalidad del 100% de los organismos se presentaba en la concentración de 10 ppm y en 0.001 ppm 0%. Por lo tanto el rango de concentraciones para realizar las pruebas definitivas se encontraba entre 0.001 y 10 ppm lo cual indica que el test preliminar arrojo de una vez el resultado esperado para realizar las pruebas definitivas. 5.6.2. Test definitivo Con el rango arrojado por el test preliminar se realizaron concentraciones en forma logarítmica así: 0.001 ppm, 0.01ppm, 0.1 ppm, 1 ppm y 10 ppm

Esto con el fin de dar un valor más aproximado y real de la CL50-48 para el cloro. Estas concentraciones fueron utilizadas según metodología CETESB ya que el programa probit trabaja mejor con números logarítmicos. Para ello varios métodos han sido desarrollados; en la presente investigación se contó con el software de la metodología Probit, en la cual se digitan los datos donde se determinan los limites de confianza y la CL50-48. De las 15 pruebas de toxicidad que se realizaron en el mes de septiembre, se determinó para cada una la CL50-48 con sus límites de confianza inferior y superior respectivamente; para hallar la concentración letal media definitiva del cloro, se promediaron los resultados, como se muestra en la siguiente tabla: Tabla 18. Promedio de la CL50-48 del cloro y su respectiva varianza (test definitivo). 95 % Límite de confiabilidad Varianza Lim. Lim. F. No. de CL50-48 Inferior Superior Calculado Ensayo Fecha (ppm) (ppm) (ppm) 1 10/09/2008 0,068 0,030 0,152 73,200 2 10/09/2008 0,160 0,081 0,315 99,085 3 10/09/2008 0,064 0,032 0,128 149,76 4 11/09/2008 0,063 0,034 0,124 211,200 5 11/09/2008 0,107 0,050 0,225 103,800 6 15/09/2008 0,160 0,081 0.315 231,200 7 15/09/2008 0,156 0,086 0,289 228,000 8 15/09/2008 0,160 0,091 0,287 130,600 9 15/09/2008 0,144 0,073 0,284 199,971 10 16/09/2008 0,123 0,064 0,245 130,745 11 16/09/2008 0,144 0,073 0,284 199,971 12 16/09/2008 0,130 0,065 0,256 236,400 13 17/09/2008 0,160 0,081 0,315 231,200 14 17/09/2008 0,144 0,073 0,284 199,971 15 17/09/2008 0,125 0,063 0,249 140,400 F.0.05 Teórico 2.77 Promedio 0,127 0,065 0,229 171,033 2.77 Fuente: autora

CL50 (ppm) Determinación de la concentración letal media (CL50-48) del cloro en el efluente de una industria tipo Los resultados de la concentración letal media del cloro en esta investigación, con sus límites de confianza son: Límite inferior: 0,065 ppm de Cloro CL50-48: 0,127 ppm de Cloro Límite superior: 0,229 ppm de Cloro Lo dicho anteriormente, indica que la toxicidad del cloro en estos organismos es alta ya que se necesita una porción demasiado pequeña para que ser afectados. En la gráfica 2, se representan las distribuciones de las pruebas realizadas para determinar la concentración letal media (CL50-48) con la utilización de cloro (hipoclorito de sodio) como sustancia pura y sus respectivos límites. Gráfica 2. Concentración letal media del cloro Concentración Letal Media (CL50) del Cloro 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 CL50 (ppm) Lim. Inf. Lim. Sup. Prom. CL50 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Réplicas Fuente: autora

Como se observa en la gráfica anterior, los resultados proyectados por el programa probit con un límite de confiabilidad del 95%, en el análisis de la Concentración Letal (CL50-48) del cloro da un promedio de 0,127 ppm, con unos límites de confianza que oscilan de 0.065 ppm a 0.229 ppm. A continuación se muestra un valor de CL50-48 en Daphnia pulex con cloro: Tabla 19. Valor internacional de CL50-48 en Daphnia pulex con cloro. CL50-48 (ppm) 0,005 a 0,150 País Autor/Entidad Documento Chile Corporación Rita - Chile Toxicidad del cloro en medio ambiente fuerte agente oxidante. Fuente: www.toxicologia.cl/descargas/fichas/cloro%20de%20calcio_ficha Los valores de CL50-48 hallados en este proyecto, están dentro de los datos internacionales. 5.6.3. Análisis de varianza de las pruebas con cloro sobre Daphnia pulex Se desarrollo la metodología del protocolo LB07 Análisis de Varianza (ver anexo A), para los ensayos de toxicidad con cloro sobre Daphnia pulex (ver anexo C). Para la realización del ANOVA de cada una de la pruebas (ver tabla 18), se postuló la hipótesis nula y la hipótesis alternativa de la siguiente forma: Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos. H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Para el análisis del resultado se debe tener en cuenta la siguiente condición: Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alternativa. Fc< Ft: se acepta la hipótesis nula y se rechaza la hipótesis alternativa.

Como lo muestra la tabla 18, Fc > Ft, en las 15 pruebas del test definitivo con cloro, por lo tanto se rechaza la hipótesis nula y se garantiza la validez de los datos. 5.7. VERTIMIENTO SIN TRATAR 5.7.1. Caracterización vertimiento sin tratar La toma de la muestra del vertimiento que contiene cloro (hipoclorito de sodio), se realizó a la salida del proceso de lavado de las instalaciones de la industria, antes de ser vertido al alcantarillado. 5.7.2. Muestreo vertimiento sin tratar Se recolectaron tres muestras simples en la industria tipo, en recipientes plásticos de 2 L. para cada una. 5.7.3. Análisis fisicoquímicos vertimiento sin tratar Se midieron los siguientes parámetros fisicoquímicos (los métodos utilizados están enunciados en la tabla 12 de este documento), para cada una de las muestras: Tabla 20. Parámetros fisicoquímicos evaluados al vertimiento sin tratar. Parámetro Unidades Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Cloro Residual mg Cl/L 381** 377** 382** Cloro Total mg Cl/L 409** 408** 410** DQO mg O2/L 1972* 1979* 1977** Dureza mg 2793* 2801* 2800** CaCO3/L Conductividad S/cm 65195* 65205* 65200** Sólidos Suspendidos mg/l 2375* 2362* 2367** Totales Oxígeno Disuelto mg O2/L 0* 0* 0** ph Unidades 10.55* 10.54* 10.56** Temperatura ºC 19.5*** 19*** 19*** * Análisis realizados en el laboratorio de Ingeniería Ambiental y Sanitaria de la Universidad de La Salle ** Análisis realizados en el laboratorio AMBITEST *** Análisis realizados in situ Fuente: autora

Tabla 21. Valor promedio de los parámetros fisicoquímicos evaluados (vertimiento sin tratar). Parámetro Unidades Valor promedio Cloro Residual mg Cl/L 380 Cloro Total mg Cl/L 409 DQO mg O2/L 1976 Dureza mg CaCO3/L 2798 Conductividad S/cm 65200 Sólidos Suspendidos mg/l 2368 Totales Oxígeno Disuelto mg O2/L 0 ph Unidades 10,55 Temperatura ºC 19 Fuente: autora 5.7.4. Análisis de la caracterización fisicoquímica vertimiento sin tratar La conductividad es alta, por lo que podemos decir que hay gran presencia de sales, el ph es alcalino, la cantidad de cloro residual y total está altamente concentrada en la muestra. Comparando los resultados de la caracterización realizada a la industria, con la normatividad colombiana (ver tabla 22) encontramos que frente al Decreto 1594 de 1984, la empresa cumple con los parámetros de sólidos suspendidos totales y temperatura e incumple con el ph; los demás parámetros no son evaluados por la norma. Tabla 22. Comparación de parámetros fisicoquímicos de la industria con la legislación colombiana. Parámetro Decreto 1594/84 Valor Cumple No cumple Cloro Residual NV Cloro Total NV DQO NV Dureza NV

Parámetro Decreto 1594/84 Valor Cumple No cumple Oxígeno Disuelto NV ph 5 9 unid. X Temperatura < 40 ºC X NV: no valorado por la norma Fuente: autora 5.7.5. Pruebas toxicológicas vertimiento sin tratar Para determinar la CL50-48 del vertimiento sin tratar, se realizó el test preliminar usando concentraciones en volumen. El objetivo es determinar la CL50-48 de este tipo de industria que dentro de su vertimiento contenga cloro. 5.7.5.1. Test preliminar vertimiento sin tratar Para determinar la CL50-48 del vertimiento sin tratar en el test preliminar 1 se tomaron las concentraciones en volúmenes entre 20% (v/v) y 100% (v/v) de concentración, se observó que todos los organismos utilizados tuvieron una mortalidad del 100%, por lo tanto los resultados no se tuvieron en cuenta y se descartaron. Se realizó un test preliminar 2 con un rango de concentraciones en un volumen de 1%(v/v) hasta 20%(v/v), así: 1%(v/v), 5%(v/v), 10%(v/v), 15%(v/v) y 20%(v/v) Durante la lectura de estas pruebas (test preliminar 2) se encontró, que la mortalidad del 100% de los organismos se presentaba en las concentraciones de 20% (v/v) y 15% (v/v), y en 1% (v/v) de 13%. Por lo tanto el rango de concentraciones para realizar las pruebas definitivas se encontraba entre 1 % (v/v) y 15% (v/v).

5.7.5.2. Test definitivo vertimiento sin tratar Teniendo el rango de concentraciones en volumen, se realizaron 10 pruebas toxicológicas definitivas manejando el siguiente rango. 1%(v/v), 3%(v/v), 5%(v/v), 10%(v/v) y 15%(v/v) Se descarto la concentración de 20%(v/v) ya que en todas las pruebas del test preliminar, todos los organismos murieron. Durante la lectura de estas pruebas se observo lo siguiente: Tabla 23. Mortalidad en cada concentración de prueba del ensayo. [ ] % (v/v) Mortalidad (%) 1 15 3 49 5 60 10 83 15 100 Fuente: autora Por lo que se deduce que la CL50-48 del vertimiento sin tratar esta entre el 1%(v/v) y el 3%(v/v). De las 10 pruebas de toxicidad que se realizaron en el mes de diciembre, se determinó para cada una la CL50-48 con sus límites de confianza inferior y superior respectivamente; para hallar la concentración letal media definitiva del cloro, se promediaron los resultados, como se muestra a continuación:

CL50 (ppm) Determinación de la concentración letal media (CL50-48) del cloro en el efluente de una industria tipo Tabla 24. Concentración Letal Media (CL50-48) y varianza del vertimiento sin tratar (test definitivo). 95 % Límite de confiabilidad Lim. Lim. F. No. de CL50-48 Inferior Superior Calculado Ensayo Fecha % (v/v) % (v/v) % (v/v) 1 5/12/2008 2,945 1,971 3,987 69,000 Varianza F.0.05 Teórico 2 5/12/2008 3,138 2,190 4,164 108,480 3 5/12/2008 2,842 1,899 3,842 104,88 4 5/12/2008 3,696 2,677 4,837 108,480 5 5/12/2008 3,267 2,306 4,315 96,240 6 11/12/2008 3,554 2,547 4,674 98,454 2,77 7 11/12/2008 3,138 2,190 4,164 41,723 8 11/12/2008 3,230 2,223 4,328 148,542 9 11/12/2008 3,413 2,397 4,548 53,866 10 11/12/2008 3,249 2,260 4,328 62,435 Promedio 3,247 2,266 4,319 89,210 2,77 Fuente: autora Gráfica 3. Concentración Letal media (CL50-48) del vertimiento sin tratar sobre Daphnia pulex. Concentración Letal Media (CL50) del Vertimiento sin Tratar 5 4 3 2 1 CL50 (ppm) Lim. Inf. Lim. Sup. Prom. CL50 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Réplicas Fuente: autora

En la tabla 24 y en la gráfica 3 se muestran los resultados proyectados por el programa probit con un limite de confiabilidad del 95% para la CL50-48 del vertimiento sin tratar del test definitivo donde la CL50-48 arrojo como valor máximo 4.319%(v/v) y mínimo 2.266%(v/v), para 10 pruebas toxicológicas realizadas, observando así que los datos estuvieron relativamente constantes. De estas pruebas se obtuvo un promedio de Concentración Letal Media (CL50) de 3.247%(v/v). 5.7.6. Análisis de varianza de las pruebas de vertimiento sin tratar sobre Daphnia pulex Siguiendo la metodología del protocolo LB07 Análisis de Varianza (ver anexo A), se realizó el análisis correspondiente para los ensayos con el vertimiento sin tratar de la industria sobre Daphnia pulex (ver anexo D). Postuló la hipótesis nula y la hipótesis alternativa de la siguiente forma: Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos. H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Para el análisis del resultado se debe tener en cuenta la siguiente condición: Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alternativa. Fc< Ft: se acepta la hipótesis nula y se rechaza la hipótesis alternativa. Como lo muestra la tabla 24, Fc > Ft, en las 10 pruebas del test definitivo con vertimiento sin tratar de la industria, por lo tanto se rechaza la hipótesis nula y se garantiza la validez de los datos. 5.7.7. Índice toxicológico vertimiento sin tratar Con la determinación del índice toxicológico se demuestra que los ensayos de toxicidad son una herramienta eficaz para clasificar aquellas industrias que utilizan

en su proceso de producción sustancias de interés sanitario. Estas sustancias afectan la flora, la fauna y en general los cuerpos de agua, donde son descargados sus vertimientos. Se obtuvo la carga e índice toxicológico de la muestra de la industria con el fin de clasificar y evaluar el vertimiento que contiene cloro; teniendo en cuenta el caudal del vertimiento industrial, la Concentración Letal Media del vertimiento y carga tóxica del efluente. La carga toxica del efluente se calculó con la siguiente ecuación: Donde: Carga Tóxica (UT)= 100 CL50 Q CL 50: Concentración letal media (concentración del efluente que produjo la mortalidad del 50% de los organismos expuestos en un período de 48 horas). _ Q : Caudal promedio del efluente (m 3 /mes), el cual varía según la producción de la empresa evaluada. CT: Carga Tóxica, expresada en unidades tóxicas. Carga Tóxica (UT)= 100 3,24 14,4 m 3 mes Carga Tóxica (UT)= 443, 486 Índice Toxicológico del vertimiento sin tratar Con el cálculo y transformación logarítmica en base 10 de la carga tóxica se obtuvo el índice toxicológico de la siguiente manera:

Índice Toxicológico Determinación de la concentración letal media (CL50-48) del cloro en el efluente de una industria tipo IT IT IT Log(1 Log(1 2,647 CT) 443,486UT) Basado en los rangos establecidos (ver tabla 13) en la tesis Implementación de un sistema de alerta de riesgo toxicológico utilizando Daphnia Pulex para la evaluación de muestras ambientales, realizada por Escobar Malaver; Pedro Miguel, se clasificó el índice toxicológico del vertimiento de la industria (ver gráfica 4). Gráfica 4. Clasificación del Índice Toxicológico de la industria. Índice Toxicológico Industria 7 6 5 4 3 2 1 0 Despreciable Industria Reducida Moderada Considerable Elevada Despreciable Reducida Moderada Considerable Elevada Catga Tóxica Fuente: autora El vertimiento de la industria según el índice toxicológico arrojado y comparado con la tabla 13, presenta una carga tóxica reducida. Teniendo en cuenta este índice toxicológico, es importante que de todas formas la industria reduzca su carga y por ende el índice toxicológico de su vertimiento.

5.8. VERTIMIENTO TRATADO 5.8.1. Caracterización vertimiento tratado La toma de muestra del vertimiento que contiene cloro se realizó a la salida sistema de tratamiento piloto realizado en este proyecto (ver ilustración 20). Ilustración 20. Montaje tratamiento piloto Fuente: autora 5.8.2 Análisis fisicoquímicos vertimiento tratado Después del tratamiento piloto del vertimiento que contiene cloro se midieron parámetros fisicoquímicos (ver tabla 25) (los métodos utilizados y el lugar de análisis están enunciados en la tabla 12 de este documento), para cada una de las recolecciones de muestra. Tabla 25. Parámetros fisicoquímicos analizados a la muestra tratada Parámetro Unidades Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Cloro Residual mg Cl/L **95 **98 **98 Cloro Total mg Cl/L **103 **105 **107 DQO mg O2/L *1538 1532* **1541 Dureza mg *153 *158 **160 CaCO3/L Conductividad S/cm *7226 *7226 **7232 Sólidos mg/l *561 *564 **564 Suspendidos Totales Oxígeno Disuelto mg O2/L *0 *0 **0 ph Unidades *9.56 *9.42 **9.28 Temperatura ºC ***19 ***19 ***19 * Análisis realizados en el laboratorio de Ingeniería Ambiental y Sanitaria de la Universidad de La Salle ** Análisis realizados en el laboratorio AMBITEST *** Análisis realizados in situ Fuente: autora

Tabla 26. Valores promedio de los análisis fisicoquímicos. Parámetro Unidad Valor promedio Cloro Residual mg Cl/L 97 Cloro Total mg Cl/L 105 DQO mg O2/L 1541 Dureza mg CaCO3/L 157 Conductividad S/cm 7228 Sólidos Suspendidos mg/l 563 Totales Oxígeno Disuelto mg O2/L 0 ph Unidades 9,42 Temperatura ºC 19 Fuente: autor 5.8.3. Análisis de la caracterización fisicoquímica vertimiento tratado La conductividad es alta, por lo que podemos decir que hay gran presencia de sales, el ph es ligeramente alcalino, la cantidad de cloro residual y total con respecto al vertimiento sin tratar se redujo para el primero en un 25,5% y para el segundo en un 25,7%. Comparando los resultados de la caracterización realizada al vertimiento tratado, con la normatividad colombiana encontramos que frente al Decreto 1594 de 1984 (ver tabla 27), cumple con sólidos suspendidos totales y temperatura e incumple con el parámetro de ph, los demás no son evaluados por la norma. Tabla 27. Comparación de parámetros fisicoquímicos del vertimiento tratado con la legislación colombiana Parámetro Decreto 1594/84 Valor Cumple No Cumple Cloro Residual NV Cloro Total NV DQO NV Dureza NV Conductividad NV

Parámetro Decreto 1594/84 Valor Cumple No cumple Sólidos Suspendidos Remoción > X Totales 50% en carga Oxígeno Disuelto NV ph 5 9 Unid. X Temperatura > 40 ºC X NV: no valorado por la norma Fuente: autora 5.8.4 Pruebas toxicológicas vertimiento tratado Para determinar la CL50-48 del vertimiento tratado, se realizó el test preliminar usando concentraciones en volumen. El objetivo es determinar la CL50-48 de este tipo de industria después de someter el vertimiento a un tratamiento. 5.8.4.1. Test preliminar Para determinar la CL50-48 del vertimiento tratado en el test preliminar 1 se tomaron las concentraciones en volúmenes entre 20% (v/v) y 100% (v/v) de concentración, se observó que la mortalidad del 100% de los organismos se presentó en la concentración de 60%(v/v), mientras que en 20%(v/v) de concentración no se presento mortalidad de organismos prueba. Se realizó un test preliminar 2 con un rango de concentraciones en un volumen de 40%(v/v) hasta 60%(v/v), así: 40%(v/v), 45%(v/v), 50%(v/v), 55%(v/v) y 60%(v/v) Durante la lectura de estas pruebas (test preliminar 2) se encontró, que la mortalidad del 100% de los organismos se presentaba en la concentración de 60% (v/v), mientras que en las concentraciones de 40% (v/v) y 45% (v/v) se presentó mortalidad del 25% de organismos prueba. Por lo tanto el rango de concentraciones para realizar las pruebas definitivas fue de 50% (v/v) y 60% (v/v).

5.8.4.2. Test definitivo Teniendo el rango de concentraciones en volumen, se realizaron 10 pruebas toxicológicas definitivas manejando el siguiente rango. 50%(v/v), 52%(v/v), 55%(v/v), 57%(v/v) y 60%(v/v) Durante la lectura de estas pruebas se observo lo siguiente: Tabla 28. Mortalidad en cada concentración de prueba del ensayo. [ ] % (v/v) Mortalidad (%) 50 16 52 39 55 52 57 75,5 60 98,5 Por lo que se deduce que la CL50-48 del vertimiento tratado esta entre el 50%(v/v) y el 55%(v/v). Tabla 29. Concentración Letal Media (CL50-48) y varianza del vertimiento tratado test definitivo. 95 % Límite de confiabilidad Varianza Lim. Lim. F. F.0.05 No. de CL50-48 Inferior Superior Calculado Teórico Ensayo Fecha % (v/v) % (v/v) % (v/v) 1 10/01/09 53,717 52,550 54,757 26,538 2 10/01/09 53,839 52,574 54,959 4,011 3 10/01/09 53,871 52,343 55,227 28,655 4 10/01/09 53,995 52,805 55,078 21,666 5 10/01/09 53,832 52,579 54,983 34,114 6 12/01/09 53,783 52,427 55,001 17,261 2,77 7 12/01/09 53,463 52,308 54,476 39,044 8 12/01/09 53,991 52,834 55,049 47,800 9 12/01/09 53,849 52,643 54,930 19,824 10 12/01/09 53,425 52,151 54,509 93,218 Promedio 53,776 52,521 54,897 33,213 2,77 Fuente: autora

Los resultados de la concentración letal media del vertimiento tratado en esta investigación, con sus límites de confianza son: Límite inferior: 52,521% (v/v) CL50-48: 53,776 % (v/v) Límite superior: 54,897% (v/v) Gráfica 5. Concentración Letal media (CL50-48) del vertimiento tratado sobre Daphnia pulex. 55,5 55 54,5 54 53,5 53 52,5 52 51,5 51 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CL50 (ppm) Lim. Inf. Lim. Sup. Prom. CL50 Fuente: autora En la tabla 29 y en la gráfica 5 se muestran los resultados proyectados por el programa probit con un limite de confiabilidad del 95% para la CL50-48 del vertimiento tratado del test definitivo donde efectivamente la CL50-48 arrojo como valor máximo 54,897% (v/v) y mínimo 52,521% (v/v), para 10 pruebas toxicológicas realizadas. De estas pruebas se obtuvo un promedio de Concentración Letal Media (CL50) de 53,776% (v/v), observando de la misma manera que los datos de CL50 estuvieron constantes en un valor de 53% (v/v).

5.8.5. Análisis de varianza de las pruebas del vertimiento tratado sobre Daphnia pulex Siguiendo la metodología del protocolo LB07 Análisis de Varianza (ver anexo A), se realizó el análisis correspondiente para los ensayos con el vertimiento tratado de la industria sobre Daphnia pulex (ver anexo E). Postuló la hipótesis nula y la hipótesis alternativa de la siguiente forma: Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos. H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Para el análisis del resultado se debe tener en cuenta la siguiente condición: Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alternativa. Fc< Ft: se acepta la hipótesis nula y se rechaza la hipótesis alternativa. Como lo muestra la tabla 29, Fc > Ft, en las 10 pruebas del test definitivo con vertimiento sin tratar de la industria, por lo tanto se rechaza la hipótesis nula y se garantiza la validez de los datos. 5.8.6. Índice toxicológico vertimiento tratado Se obtuvo la carga e índice toxicológico de la muestra de la industria con el fin de clasificar y evaluar el vertimiento tratado que contiene cloro; teniendo en cuenta el caudal del vertimiento industrial, la Concentración Letal Media del vertimiento y carga tóxica del efluente. La carga toxica del efluente se calculó con la siguiente ecuación: Donde: Carga Tóxica (UT)= 100 CL50 Q

CL 50: Concentración letal media (concentración del efluente que produjo la mortalidad del 50% de los organismos expuestos en un período de 48 horas). _ Q : Caudal promedio del efluente (m 3 /mes), el cual varía según la producción de la empresa evaluada. CT: Carga Tóxica, expresada en unidades tóxicas. Carga Tóxica (UT)= 100 33,776 14,4 m 3 mes Carga Tóxica (UT)= 23, 777 Índice Toxicológico del vertimiento tratado Con el cálculo y transformación logarítmica en base 10 de la carga tóxica se obtuvo el índice toxicológico de la siguiente manera: IT IT IT Log(1 Log(1 1,394 CT) 23,777UT) De acuerdo con la tabla 13, basada en los rangos establecidos en la tesis Implementación de un sistema de alerta de riesgo toxicológico utilizando Daphnia pulex para la evaluación de muestras ambientales, realizada por Escobar Malaver; Pedro Miguel, se clasificó el índice toxicológico del vertimiento de la industria. El vertimiento de la industria, según el índice toxicológico arrojado y comparado con la tabla 13, presenta una carga tóxica despreciable. Teniendo en cuenta este valor, es importante y necesario resaltar que el tratamiento efectuado al vertimiento es un método efectivo para tratar esta clase de vertimientos y por lo tanto es de gran importancia para que la industria lo tome en cuenta para obtener

una reducción importante con respecto a la carga tóxica y a su vez al índice toxicológico. 5.9. TRATAMIENTO PILOTO Para el manejo de los vertimientos industriales que contienen cloro (hipoclorito de sodio) se encontró en diferente bibliografía que el carbón activado granular como medio filtrante tiene una excelente remoción con respecto a este, es la técnica mas eficiente. Este lecho filtrante se puede usar en tanques o filtros. El sistema de diseñó se construirá con 2 filtros en serie: arena y carbón activado; los materiales filtrantes estarán soportados sobre lechos de grava de diferentes diámetros. 5.9.1. Filtración La filtración es una operación unitaria, en la que una suspensión de sólido-líquido pasa a través de un medio poroso (lecho filtrante), que retiene los sólidos y deja pasar el líquido. Elementos que intervienen en la filtración: Medio filtrante Fluido con sólidos en suspensión Fuerza, una diferencia de presión que obligue al fluido a avanzar Dispositivo mecánico, llamado filtro que sostiene el medio filtrante, contiene el fluido y permite la aplicación de la fuerza 5.9.2. Carbón Activado Granular (CAG), como medio filtrante El sistema con Carbón Activado Granular (CAG) elimina los contaminantes del agua en tratamiento por medio de absorción, mediante la cual un ión contaminante cargado negativamente es atraído por el carbón activado el cual está cargado positivamente. Los compuestos orgánicos son removidos del agua por esta

absorción y los residuos de desinfectantes como el cloro y cloraminas son eliminados mediante una reducción catalítica. El CAG es ubicado regularmente en una torre de filtración por gravedad en los cuales circula el agua no tratada. Los filtros de carbón remueven también mecánicamente tierra, sedimentos, algas, bacterias, gusanos microscópicos, cryptosporídium y asbestos. Cuando el área superficial del carbón granular se obstruye de contaminantes por la absorción, el diferencial de presión se incrementa y deberá ser necesario retrolavar la cama del filtro. 5.9.2.1 Ventajas del sistema Los sistemas de CAG se adecuan convenientemente para la eliminación de componentes orgánicos disueltos responsables del olor, sólidos en suspensión y la eliminación de residuos de cloro de las aguas industriales. CAG de alta calidad en el medio con una extensa área superficial, un alto valor de yodo y bajo contenido de humedad y cenizas en cada sistema. Los sistemas CAG pueden ser diseñados a la medida de los requerimientos del proceso y del sitio de instalación. Cuando se utilizan los sistemas CAG para el pretratamiento del agua, se incrementa la vida útil y la eficiencia de los sistemas de intercambio iónico y ósmosis inversa. Diseño y tamaño optimizado teniendo en perspectiva todas las condiciones de operación lo cual resulta en un reducido costo de capital, varios años de eficiente operación y considerables ahorros. 5.9.2.2. Aplicaciones del sistema Los sistemas de filtración con Carbón Activado Granular pueden ser el único paso de tratamiento o pueden estar en combinación con otro proceso para remover cloro libre y compuestos orgánicos disueltos de 18 : 18 Napier-Reid Water & Wastewater Treatment. Disponible en Línea. http://www.napierreid.com/include/pdf/sp/gac.pdf

Aguas Municipales Aguas Residuales Municipales Aguas Superficiales Aguas Subterráneas Aguas Residuales Industriales 5.9.3. Arena, como medio filtrante La arena lavada y clasificada según su densidad es usada para la remoción de sedimentos. Es un medio inerte y tiene un largo periodo de vida, siendo muy resistente a la presión o turbulencia, características de los retrolavados. La filtración con arena forma una barrera gruesa al paso del fluido. 19 5.10. DISEÑO DEL TRATAMIENTO PILOTO En esta parte se describirán detalladamente los cálculos para el diseño de las unidades. 5.10.1. Filtro de arena (ver anexo F) En la tabla siguiente tabla se encuentra la hoja de cálculo para el diseño del filtro de arena: Tabla 30. Hoja de cálculo del filtro de arena. Simb. Fórmula Valor Unidades Caudal Q 0,020 m 3 /h Velocidad de filtración Vf 7,5 a 15 7,5 m 3 /m 2 h Área A Q/Vf 0,0027 m 2 Diámetro D 4* A 0,06 m 19 Disponible en internet. http://www.ciberteca.net/equipos-para-purificadoras-y-embotelladoras-de-aguapurificada-y-mineral/medios-filtrantes-de-filtos/medios-filtrantes.htm

arena * V arena 1,76 Kg grava * V grava 0,85 Kg Determinación de la concentración letal media (CL50-48) del cloro en el efluente de una industria tipo Simb. Fórmula Valor Unidades Altura h Asumida 0,90 m Densidad arena arena 1600 Kg/ m 3 Densidad grava grava 1700 Kg/ m 3 Altura grava h grava 0,2 a 0,5 0,2 m Altura vacía h vacia 1/3 *h 0,30 m Altura arena h arena h h grava h vacia 0,40 m Volumen arena V arena A * h arena 0,0011 m 3 Volumen grava V grava A *h grava 0,0005 m 3 Masa de arena m arena Masa de grava m grava Fuente: autora.02 m 3 /h 5.10.2. Filtro de carbón activado (ver anexo F) En la siguiente tabla se encuentra la hoja de cálculo para el diseño del filtro de carbón activado: Tabla 31. Hoja de cálculo del filtro de CAG. Simb. Fórmula Valor Unidades Caudal Q m 3 /h 0,02 Vf 2 a 5 Velocidad de filtración m 3 /m 2 h 2 Área A Q/Vf m 0,01 2 Diámetro D 4* A Altura h Asumida Densidad arena arena 0,11 1,10 450 m m Kg/ m 3

Simb. Fórmula Valor Unidades Densidad grava grava 1700 Kg/ m 3 Altura grava h grava 0,2 a 0,5 0,2 m Altura vacía h vacia 1/3 *h 0,55 m Altura arena h arena h h grava h vacia 0,35 m Volumen arena V arena A * h arena 0,004 m 3 A *h grava Volumen grava V grava 0,002 m 3 arena * V arena Masa de arena m arena 1,6 Kg grava * V grava Masa de grava m grava Fuente: autora 3,4 Kg 5.10.3. Montaje tratamiento piloto Se coloca primero el filtro de arena, ya que esta forma una barrera gruesa al paso del fluido reteniendo sólidos en suspensión; enseguida va el filtro de carbón activado (ver ilustración 21), el cual remueve el cloro presente en el vertimiento. Ilustración 21. Montaje tratamiento piloto Fuente: autora

5.11. EFICIENCIA DEL TRATAMIENTO PILOTO REALIZADO Se obtuvo eficiencia tanto en análisis fisicoquímicos como en reducción de la carga tóxica e incremento de la CL50-48 de este vertimiento que contiene trazas de cloro. En cuanto a análisis fisicoquímicos, en la tabla 32 se presenta la eficiencia en porcentaje del tratamiento piloto y su respectivo cumplimiento con la norma. Tabla 32. Eficiencia del tratamiento piloto, en cuanto a análisis fisicoquímicos. Parámetro Vertimiento sin Tratar Vertimiento Tratado Unidades Eficiencia (%) Dec. 1594 de 1984 C NC N V Cloro Residual 380 97 mg Cl/L 74,47 X Cloro Total 409 105 mg Cl/L 74,33 X DQO 1976 1541 mg O2/L 22,01 X Dureza 2798 157 mg 94,38 X CaCO3/ L Conductividad 65200 7228 S/cm 88,91 X Sólidos Suspendidos Totales C: cumple NC: no cumple NV: no valorado por la norma 2368 563 mg/l 76,22 X Fuente: autora Se observa que para el cloro residual, cloro total y sólidos suspendidos totales la remoción es mayor al 74%; la dureza y la conductividad tiene una remoción mayor al 88%, esto comprueba la efectividad del sistema para la remoción del cloro. En cuanto a la carga tóxica del vertimiento sin tratar y tratado, a continuación se presenta en la gráfica 6 una comparación de esta:

Rango Determinación de la concentración letal media (CL50-48) del cloro en el efluente de una industria tipo Gráfica 6. Resultado del Índice Toxicológico del vertimiento sin tratar y tratado Carga Tóxica 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 2,647 Sin Tratar Vertimiento 1,394 Tratado Sin Tratar Tratado Fuente: autora Comparando estos resultados con los rangos de carga tóxica de la tabla 13; el vertimiento industrial presenta una carga tóxica reducida (2-2,99), y después del tratamiento piloto que se le realizó a la muestra, arroja como resultado una carga tóxica despreciable (1-1,99), lo cual indica que el tratamiento muestra resultados satisfactorios ya que logra la reducción de esta. Con respecto a la CL50-48 del vertimiento sin tratar y tratado, se obtuvo un importante incremento de esta, ya que paso de concentraciones de entre 1% (v/v) y 10% (v/v) a concentraciones de entre 50% (v/v) y 60% (v/v). Tubo un incremento del 50%, cantidad importante para afirmar que el tratamiento piloto sirvió para todos los aspectos a reducir en este proyecto. En la siguiente gráfica se presenta una comparación de la CL50-48 del vertimiento sin tratar y tratado:

Promedio CL50-48 (%(v/v)) Determinación de la concentración letal media (CL50-48) del cloro en el efluente de una industria tipo Gráfica 7. Promedio de la CL50-48 del vertimiento sin tratar y tratado. Promedio CL50-48 del Vertimiento sin Tratar y Tratado 60 50 40 30 20 10 0 3,247 Sin Tratar Vertimiento 53,776 Tratado Sin Tratar Tratado Fuente: autora Se obtuvo un incremento de 50% (v/v) entre la CL50-48 del vertimiento tratado y sin tratar, lo que quiere decir que se tuvo que agregar más muestra para realizar los ensayos toxicológicos. Los resultados anteriormente mostrados indican que el tratamiento piloto realizado al vertimiento presenta eficiencias buenas para los vertimientos (sin tratar y tratado).

6. CONCLUSIONES El valor de la (CL50-48) para el cloro es de 0.127 ppm, con unos limites de confiabilidad del 95% (limite inferior de 0,065 ppm, limite superior de 0,229 ppm) los cuales muestran que efectivamente la CL50-48 hallada en este proyecto se encuentra entre estos, evidenciando que el ensayo es confiable. Al hacer comparación con la normatividad (decreto 1594 de 1984), se encontró que no hay regulación de este halógeno por parte de la autoridad ambiental, por lo que es necesario incluirlo para la protección de nuestro ambiente. La sensibilidad obtenida para el cultivo de Daphnia pulex expuesta a dicromato de potasio (tóxico de referencia), arrojo un valor para la CL50-48 de 0,231 ppm. Se estableció que la sensibilidad del cultivo Daphnia Pulex al Dicromato de Potasio, se encuentra dentro del rango de datos hallados antes en proyectos de la Universidad de La Salle. Se realizó el análisis de la muestra del vertimiento sin tratar obteniéndose la CL50-48, teniendo como resultado 3,247% (v/v), indicando los límites de tolerancia (confiabilidad del 95%) mediante el programa probit arrojando los siguientes resultados: límite inferior: 2,266% (v/v), límite superior: 4,319% (v/v). Se realizó el análisis de la muestra del vertimiento tratado obteniéndose la CL50-48, teniendo como resultado 53,776% (v/v), indicando los límites de tolerancia (confiabilidad del 95%) mediante el programa probit arrojando los siguientes resultados: límite inferior: 52,521% (v/v), límite superior: 54,897% (v/v).

Se evidenció que después de realizar el tratamiento piloto al vertimiento, la eficiencia de este en parámetros fisicoquímicos fue superior al 85% en remoción; además se comparó, la CL50-48 del vertimiento sin tratar con la del vertimiento tratado, comprobando que ésta aumento de 3,247% (v/v) a 53,776% (v/v). Se determinó el índice toxicológico para la industria, arrojando como resultado 2,647 de carga tóxica catalogada como reducida, demostrando que su efecto dañino es bajo, pero que se puede hacer más para que este tenga la más baja carga tóxica. Luego del tratamiento piloto se observo una reducción importante del índice toxicológico arrojando como resultado el vertimiento sin tratar 2,647 (carga tóxica reducida) y el vertimiento tratado 1,394 (carga tóxica despreciable), demostrando que el sistema de tratamiento funciono para reducir este factor. El Índice Toxicológico demuestra que los ensayos de toxicidad son una herramienta eficaz para clasificar las industrias que utilizan en su proceso productivo sustancias de interés sanitario. Siendo esta una herramienta y medida rápida, fácil y práctica para la incorporación de estos resultados y estos métodos de investigación en la normatividad colombiana. Tomando como base los resultados presentados, se considera a la Daphnia pulex (organismo de prueba) una herramienta confiable y económica para la evaluación y clasificación de vertimientos industriales. El trabajo a nivel laboratorio permitió determinar que el proceso de filtración a través de un filtro de arena y un filtro de carbón activado es aplicable para obtener una efectiva remoción de cloro presente en un vertimiento.

En todos los análisis de varianza para cada uno de los test de toxicidad, se rechaza la hipótesis nula, ya que el F calculado es mayor al F teórico. Se comprobó la reducción de la carga contaminante del cloro presente en el vertimiento de la industria con una eficiencia de remoción de 74,47% para cloro residual y 74,33% para cloro total. Para garantizar una mayor protección de la fauna y flora acuática, se deben tener en cuenta los resultados no sólo de los análisis fisicoquímicos, sino también los de los análisis toxicológicos, ya que garantizan la supervivencia de las especies presentes en los ecosistemas acuáticos para así tener mayor cobertura de los posibles daños causados por estos vertimientos. La industria dentro de su efluente cumple con los valores de sólidos suspendidos (Remoción > 50% en carga) y temperatura (<40 C) según el decreto 1594 de 1984, para el resto de parámetros fisicoquímicos la industria no cumple o no son evaluados por esta norma. Al cambiar las condiciones ambientales del laboratorio, se incremento la mortalidad de los organismos prueba, lo que nos muestra que estos son muy susceptibles a los factores ambientales y antrópicos, como: el ph, los olores ofensivos (detergentes, cigarrillo, pescado en descomposición), mal funcionamiento del extractor, la falta de oxigeno disuelto, los cambios bruscos de temperatura, la dureza del agua, presencia de sustancias ajenas al medio, la alteración del alimento, los cambios en el fotoperíodo, etc. Las sustancias potencialmente tóxicas pueden encontrarse en concentraciones tan bajas, o en condiciones ambientales tales, que son indetectables con los métodos químicos convencionales, de aquí la

necesidad de los bioensayos, ya que además de detectar concentraciones mínimas de un contaminante, también son un método rápido, económico y confiable. Además, con la ayuda de la caracterización fisicoquímica da una visión más real del estado de un vertimiento y/o de un cuerpo de agua. Los bioensayos de toxicidad son una herramienta efectiva en la evaluación de la calidad ambiental de efluentes industriales, aguas superficiales y sedimentos receptores, estos métodos biológicos de evaluación dan una respuesta global a los contaminantes disueltos en las aguas.

7. RECOMENDACIONES Se deben hacer más ensayos toxicológicos con diferentes sustancias de interés sanitario, tomando diferentes microorganismos de la cadena trófica para garantizar la validez de los mismos; para que posteriormente sean aplicados en la creación de normas estatales mas estrictas en el control de vertimientos y protección de la fauna y flora, asociados con los ecosistemas acuáticos. Se sugiere la validación de los datos obtenidos en el ensayo de la sustancia evaluada (cloro), ya que muchas industrias utilizan esta para la desinfección de sus instalaciones y la normatividad (decreto 1594 de 1984) no tiene en cuenta esta en sus sustancias de interés sanitario; y de la misma manera estos resultados sirvan como base para una posible modificación en la legislación, que garantice la preservación de la biota acuática. Los bioensayos se deben realizar con todas las sustancias de interés sanitario presentes en el decreto 1594 de 1984 y agregar otras de interés que no se tienen en cuenta allí para garantizar la supervivencia de los ecosistemas acuáticos en el país. Los reactivos que se utilicen durante el proceso de bioensayo, deben ser analíticos y de marca reconocida, para garantizar que las soluciones sean de calidad y que no varíen los resultados por fallas de los reactivos. Manejar para cada tóxico material independiente, para evitar la contaminación de los mismos y garantizar la autenticidad de los datos.

El material utilizado en cualquier fase del ensayo debe ser lavado con abundante agua (no usar jabones, ni nada que altere la veracidad de los resultados), ya que estas pulgas son sensibles a cualquier olor. Así se garantiza que no existirá contaminación por sustancias ajenas en los cultivos, algas, agua de reconstituida, entre otros.

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Decreto 1594 de 1984 Por el cual se reglamenta parcialmente el título I de la Ley 9 de 1979, así como el capitulo II del título VI - parte III - libro II y el título III de la parte III libro I - del Decreto 2811 de 1974 en cuanto a usos del agua y residuos líquidos. Junio 26 de 1984. Bogotá D.C. DÍAZ BÁEZ, María Consuelo. y Dutka, B.J. Práctica de Laboratorio- Toxicidad con Bacterias, Daphnia Magna. Bogotá. Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ingeniería. Unidad Académica Ingeniería Ambiental. 1996. Escobar, Malaver; Pedro Miguel. Implementación de un sistema de alerta de riesgo toxicológico utilizando Daphnia pulex para la evaluación de muestras ambientales. Santafé de Bogotá. 1997. Escobar Malaver, Pedro Miguel. Coinvestigadores Parra Martínez, Yaneth. Londoño Pérez, Rubén Darío, Determinación de la Concentración Letal CL50-48 del arsénico y del níquel sobre Daphnia Pulex, 2008, Universidad de La Salle, Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria. Hoyos campos, Liliana Gisela. Estandarización de bioensayos con Daphnia magna para la evaluación de toxicidad en aguas contaminadas, 1995, Universidad Nacional De Colombia. INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMÁS TECNICAS Y CERTIFICACION. Gestión ambiental: agua. Guía para la realización de ensayos de toxicidad en organismos acuáticos (Bioensayos). Bogotá: ICONTEC., 2000. Jiménez García, Luis Felipe. Biología celular y molecular. Pag. 165. 2002

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ANEXOS

ANEXO A Protocolo Pruebas Toxicológicas con Daphnia Pulex

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS CONTENIDO PREPARACION DEL AGUA RECONSTITUIDA Dapnia Pulex LB01 Página 1 de 6 Versión 0 1. Objetivo 2. Materiales 3. Reactivos 4. Principio del método 5. Definiciones 6. Procedimiento 7. Bibliografía 8. Anexo A Preparación del agua reconstituida (dureza) Anexo B Formato LB002. Parámetros de Control Agua Reconstituida 1. OBJETIVO Preparar el agua reconstituida para la aclimatación, estandarización, mantenimiento de cultivo del organismo prueba y realización de ensayos de toxicidad, con el fin de mantener condiciones óptimas del ecosistema en el laboratorio. 2. MATERIALES Acuarios de 20 litros Aireadores de una salida Oxímetro HI 8043 422987 (Hanna) ph metro SG 2 ELK (Mettler Toledo) Agua destilada Kid de dureza 1.08039.00001 (Aquamerk) Probeta de 100 ml Pipeta graduada de 10 ml Pipeta graduada de 1 ml Pipeteador 3. REACTIVOS Bicarbonato de Sodio (NaHCO3) Cloruro de Calcio (CaCl 2 ) Cloruro de Potasio (KCl) Sulfato de Magnesio Heptahidratado (MgSO4*7H2O)

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS LB01 PREPARACION DEL AGUA RECONSTITUIDA Página 2 de 6 Versión 0 4. PRINCIPIO DEL METODO El agua reconstituida de 40 a 48 mg/l según metodología CETESB, protocolo L5.017, se prepara con el fin de aclimatar, mantener los organismos prueba ( cladóceros del género Daphnia) y realizar las pruebas de toxicidad, bajo condiciones de laboratorio, incorporando así a la investigación un ecosistema artificial en el cual, las características del medio se encuentran controladas, para regular el cultivo sin que este presente alteraciones (decoloración, reproducción o muerte) por el cambio del mismo; esta debe ser de calidad constante. 5. DEFINICIONES Agua Desionizada: Agua producida por intercambio iónico con resinas catiónicas y aniónicas con ayuda de la unidad de osmosis inversa la cual reduce el contenido de sales totales en mas del 90%. Agua Reconstituida: Agua Preparada con reactivos establecidos, con el fin de generar condiciones ambientales presentes en ecosistemas; sus funciones son: mantenimiento el cultivo de organismos prueba, preparación de soluciones y realización de bioensayos Dureza: Medida de la concentración de iones de calcio y magnesio en el agua, expresada como mg/l de carbonato de calcio Aireación: Adición de aire al agua, con lo que se incrementa el oxigeno disuelto al agua reconstituida Constantes de laboratorio: variables que tienen un valor fijo dentro de las pruebas de toxicidad, para no producir alguna alteración en el cultivo del organismo prueba. Entre ellas esta: dureza, temperatura, oxigeno disuelto y ph.

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS LB01 PREPARACION DEL AGUA RECONSTITUIDA Página 3 de 6 Versión 0 6. PROCEDIMIENTO 6.1. Llenar el acuario con 10 litros de agua desionizada de calidad grado analítico. 6.2. Adicionar al acuario los volúmenes indicados para cada uno de los reactivos NaHCO 3, CaCl 2, KCl, MgSO4*7H2O, presentados en el anexo A. Con la ayuda de probeta de 100 ml, pipetas graduadas de 10 y 1 ml. Los cuales son indispensables para preparar el medio de crecimiento de organismos y realizar soluciones problema (CETESB; L5.017) 6.3. Completar a 20 litros el acuario con agua desionizada para diluir completamente los reactivos, generando un agua reconstituida de dureza 40 a 48 mg/ CaCO 3. 6.4. Aumentar el oxigeno disuelto aireando el agua reconstituida de manera continua por 24 horas, con el fin de llegar a la saturación. 6.5. Realizar la lectura siguiendo los protocolos del estándar methods de los parámetros de control los cuales se deben encontrar en los siguientes rangos: Parámetros de Método según el Standard Rango Rango Ideal Control métodos Dureza 2340 C Titulométrico EDTA 40 48 mg/l 45 mg/l Oxigeno Disuelto 4500-0 G. Electrodo de > 6 mg/l 6 mg/l membrana. ph 4500-H + B Electrométrico. 7.3 7.5 7.4 Temperatura 2550 B Laboratorio y de campo. 18 22 C 20 C 6.6. Consignar esta información en el formato LB 002. Anexo B 6.7. Antes de utilizar el agua reconstituida realizar nuevamente la medición del oxigeno disuelto y la dureza, estas variables deben estar: Concentración de oxigeno por encima de 6 mg/l Dureza total entre un rango de 40 y 48 mg/l

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS LB01 PREPARACION DEL AGUA RECONSTITUIDA Página 4 de 6 Versión 0 6.8. Cuando alguno de estos parámetros de control, se encuentra fuera de los intervalos el agua debe ser descartada. 6.9. Antes de usar el agua reconstituida, para el mantenimiento de cultivo, dilución de las muestras ambientales y preparación de soluciones, se debe comprobar por medio de un prueba de control (test de viabilidad), los efectos adversos sobre los organismos expuestos, para ello se toman recipientes plásticos y en cada uno de ellos se introduce cinco (5) neonatos, al cabo de 24 o 48 horas, se realiza la lectura comprobando que la cantidad de organismos vivos sea mayor al 90%, si no constituye otro motivo para descartar el agua reconstituida. 6.10. Cuando, se tiene la certeza absoluta que el agua reconstituida cumple los parámetros establecidos y no provoca la muerte de los individuos, esta puede ser utilizada para el mantenimiento del cultivo. 7. BIBLIOGRAFIA ESCOBAR MALAVER, Pedro Miguel; GARCIA, Eduardo. Determinación de la toxicidad agua de los detergentes mediante sistemas estáticos, utilizando Daphnia magna. Universidad de la Salle; Facultad de ciencias de la educación; departamento de Química y Biología. Bogotá D.C., 1993. Anexo 4 CETESB. Pruebas de Toxicidad aguda. Protocolos L5.017/ 92 Proyecto CAR BID Contrato 298 94. Estudio de evaluación de toxicidad relativa de sustancias tóxicas en vertimientos y cuerpos receptores. Elaboró: Alba Janneth Bernal Paredes 41012014 Andrea Paola Rojas Avella 41001100 Primera Revisión: Pedro Miguel Escobar Malaver Segunda Revisión: Rubén Darío Londoño

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS LB01 PREPARACION DEL AGUA RECONSTITUIDA Página 5 de 6 Versión 0 8. ANEXOS ANEXO A PREPARACIÓN DE AGUA DE DUREZA No. Reactivo Stock (g/l) ml de Stock/20L H2O Destilada 1 2 3 4 NaHCO 3 (8 ml)* 10 100 CaCl 2 (6 ml)* 13,5 75 KCl (3 ml)* 10 38 MgSO 4 (2.5 ml)* 20 30 Rango ph 7.3 7.5 7.8-8 * Cantidad necesaria para aumentar la dureza en 5 mg/l Fuente: Compañía de Tecnología y Saneamiento Ambiental de Sao Paulo, Brasil, Protocolo L5.017/ 1992

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS LB01 PREPARACION DEL AGUA RECONSTITUIDA Página 6 de 6 Versión 0 ANEXO B FORMATO LB002 LB002 PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO AREA DE BIOENSAYOS REGISTRO DE DATOS PARAMETROS DE CONTROL AGUA RECONSTITUIDA Fecha de preparación: Dureza: ODinicial : Volumen de preparación: ph: Temperatura: OD 24 horas: Observaciones: Elaboro: Fuente: Autoras, Grupo de Investigación en Bioensayos.

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS CONTENIDO PREPARACION DEL MEDIO BRISTOL Y CENTRIFUGACION DE ALGAS VERDES Selenastrum Capricornutum, Scenedesmus Quadricauda LB02 Página 1 de 8 Versión 0 1. Objetivo 2. Materiales 3. Reactivos 4. Principio del método 5. Definiciones 6. Procedimiento 7. Bibliografía 8. Anexo A Preparación del medio Bristol Anexo B Formato LB003. Preparación de soluciones 1. OBJETIVO Preparar el medio Bristol para multiplicar las algas verdes Selenastrum Capricornutum, Scenedesmus Quadricauda, por medio de la fotosíntesis con ayuda de nutrientes y luz artificial, las cuales servirá como alimento del cultivo masivo del microorganismo prueba. (Daphnia pulex). 2. MATERIALES Probeta de 2 litros (Brand) Aireador de una (1) sola entrada (atman) Agua desionizada Lámpara luminiscente Beaker de 2000 y 50 ml Probeta de 10 ml Pipeta graduada de 10 ml Pipeta graduada de 1 ml Pipeta Pasteur de vidrio Pipeteador Tubos de ensayo Centrifugadora DINAC II Brand 3. REACTIVOS NaNO 3 KOH KH 2 PO 4 CaCl 2.2H 2 O EDTA MnCl 2. 4H 2 O MgSO 4.7H 2 O FeSO 4. 7H 2 O ZnSO 4. 7H 2 O K 2 HPO 4 H 2 SO 4, MoO 3, NaCl H 3 BO 3 CoCl 2. 6H 2 O CuSO 4. 5H 2 O Co (NO 3 ) 2. 6H 2 O

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS PREPARACION DEL MEDIO BRISTOL Y CULTIVO DE ALGAS VERDES Selenastrum Capricornutum, Scenedesmus Quadricauda LB02 Página 2 de 8 Versión 0 4. PRINCIPIO DEL METODO El medio Bristol según la metodología Dutka (1989) se realiza con el fin de multiplicar las algas verdes Selenastrum Capricornutum, Scenedesmus Quadricauda, en condiciones de laboratorio por medio de la fotosíntesis, con ayuda de una lámpara luminiscente y nutrientes para la reproducción de las mismas, las cuales después de un proceso están listas para la administración del alimento dependiendo la cantidad calculada con ayuda de la Cámara Neubauer. 5. DEFINICIONES Medio Bristol: solución de macro y micro nutrientes necesarios el incremento de las algas verdes, en condiciones estandarizadas. Micronutrientes: Nutrientes que requiere una planta en menor cantidades (boro, cobre, zinc, molibdeno, cloro, ferro), para su crecimiento. Macronutrientes: Nutrientes que requiere una planta en mayor cantidades (boro, cobre, zinc, molibdeno, cloro, ferro), para su crecimiento. Elementos Traza: son elementos químicos requeridos para la vida de los organismos en muy pequeñas cantidades. Se trata de elemento esenciales y a veces también se les denomina oligoelementos Fitoplancton: esta constituido por algas microscópicos que flotan libremente en las diversas capas de agua; existen en formas unicelulares, colonias o filamentosas. Son las responsables por la base de la cadena alimenticia del medio acuático. Fotosíntesis: Síntesis de compuestos químicos por la acción de la luz, llevada a cabo por las células vegetales que contienen clorofila, especialmente la producción de compuestos orgánicos (principalmente carbohidratos) a partir de dióxido de carbono y una fuente de hidrógeno (tal como el agua), con liberación simultánea de oxigeno. Aireación: Adición de aire al medio Bristol, para la realización de la fotosíntesis.

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS PREPARACION DEL MEDIO BRISTOL Y CENTRIFUGACION DE ALGAS Selenastrum Capricornutum, Scenedesmus Quadricauda LB02 Página 3 de 8 Versión 0 6. PROCEDIMIENTO 6.1. Preparación de reactivos del medio Bristol (metodología Dutka 1989) 6.1.1. Disolver la cantidad de reactivos en el volumen indicado de agua desionizada, teniendo el stock de macro y micro - nutrientes en el anexo A 6.1.2. Anotar la fecha de preparación y el ph de las soluciones en el formato de identificación de reactivos preparados Anexo B formato LB003 6.1.3. Preservar estas soluciones mediante refrigeración por un tiempo máximo de 6 meses 6.2. Preparación del medio del medio Bristol (metodología Dutka 1989) 6.2.1 Tomar 1500 ml de agua desionizada en un Beaker de 2000 ml. 6.2.2 Adicionar las diferentes alícuotas de macro y micro nutrientes expuestas en el anexo A. 6.2.3 Transferir la solución a una probeta de de 2000 ml, completando con agua desionizada hasta su volumen graduado. 6.2.4 Llevar la solución Bristol una vez preparada a un erlenmeyer de 2000 ml, colocar un tapón de papel kraff y esterilizar en autoclave por un periodo de 15 minutos a 121ºC y 15 libras de presión. 6.2.5 Una vez esterilizado y enfriado el medio a temperatura constante Adicionar una alícuota de 2 ml del cultivo de algas verdes Selenastrum Capricornutum, Scenedesmus Quadricauda, de la semana anterior, por medio de una pipeta Pasteur. Y transferir a una probeta de 2000 ml. 6.2.6 Tapar la probeta con un corcho evitando así la contaminación del cultivo por agentes externos.

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS PREPARACION DEL MEDIO BRISTOL Y CENTRIFUGACION DE ALGAS Selenastrum Capricornutum, Scenedesmus Quadricauda LB02 Página 4 de 8 Versión 0 6.2.7 Oxigenar e iluminar con ayuda de un aireador y una lámpara luminiscente de manera continua las 24 horas, proporcionando así las condiciones necesarias para que se multipliquen por medio de la fotosíntesis. No se puede apagar en ningún momento el aireador y la lámpara. 6.2.8 El montaje del medio Bristol se muestra a continuación: Foto 1. Medio Bristol inicial Foto 2. Medio Bristol para centrifugar Fuente: Autoras; Grupo de Investigación en Bioensayos 6.2.9 El medio Bristol se debe mantener en las condiciones anteriormente descritas en un tiempo no mayor de 15 días. Tornándose en color verde en su totalidad 6.2.10 Trasvasar el medio Bristol a un Beaker de 2000 ml, y de este transferirlo a tubos de centrifuga en volúmenes de 10 ml con ayuda de la probeta (foto 3). 6.2.11 Llevar los tubos de ensayo a la centrifugadora DINAC II Centrifugue (Brand) por quince (15) minutos, con 2500 rpm, con el fin de concentrar el cultivo de algas verdes Selenastrum Capricornutum, Scenedesmus Quadricauda. (foto 4).

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS PREPARACION DEL MEDIO BRISTOL Y CENTRIFUGACION DE ALGAS Selenastrum Capricornutum, Scenedesmus Quadricauda LB02 Página 5 de 8 Versión 0 Foto 3. Medio Bristol listo para centrifugación Foto 4. Introducción de los tubos de ensayo a la centrifugadora Fuente: Las Autoras; Grupo de Investigación en Bioensayos 6.2.12 Retirar los tubos de la centrifugadora DINAC II y eliminar el sobrenadante (foto 5) 6.2.13 Extraer el concentrado de las algas con ayuda de la pipeta Pasteur (foto 6) 6.2.14 Almacenar el concentrado de algas en frascos destinados para el mismo. (foto 7) 6.2.15 Sellar los frascos de almacenamiento con papel parafilm, rotular, identificando fecha de siembra y refrigerar a 4 C (foto 8) 6.2.16 Realizar el conteo algal mediante el procedimiento LB03, con el fin de determinar la cantidad de células de algas y frecuencia de alimentación del cultivo de organismos. Foto 5. Comparación tubos de ensayo antes y después de centrifugación. Eliminación sobrenadante Foto 6. Extracción de algas de los tubos de ensayo

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS PREPARACION DEL MEDIO BRISTOL Y CENTRIFUGACION DE ALGAS Selenastrum Capricornutum, Scenedesmus Quadricauda LB02 Página 6 de 8 Versión 0 Foto 7. Almacenamiento de algas concentradas Foto 8. Frascos de almacenamiento sellados con papel parafilm, listas para refrigerar Fuente: Las Autoras; Grupo de investigación en Bioensayos 7. BIBLIOGRAFIA ESCOBAR MALAVER, Pedro Miguel; GARCIA, Eduardo. Determinación de la toxicidad agua de los detergentes mediante sistemas estáticos, utilizando Daphnia magna. Universidad de la Salle; Facultad de ciencias de la educación; departamento de Química y Biología. Bogotá D.C., 1993. Anexo 4 CETESB. Pruebas de Toxicidad aguda. Protocolos L5.017/ 92 Proyecto CAR BID Contrato 298 94. Estudio de evaluación de toxicidad relativa de sustancias tóxicas en vertimientos y cuerpos receptores. VILLEGAS GONZALEZ, Guillermo. Protocolos analíticos para agua. Corporación Autónoma Regional de Cundinamarca; Subdirección Científica. Bogotá D.C., 1999.1ª edición Elaboro: Alba Janneth Bernal Paredes 41012014 Andrea Paola Rojas Avella 41001100 Primera Revisión: Pedro Miguel Escobar Malaver Segunda Revisión: Rubén Darío Londoño

PROGRAMADE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS PREPARACION DEL MEDIO BRISTOL Y CENTRIFUGACION DE ALGAS Selenastrum Capricornutum, Scenedesmus Quadricauda LB02 Página 7 de 8 Versión 0 8. ANEXOS ANEXO A PREPARACIÓN DEL MEDIO BRISTOL No. COMPUESTO STOCK ml de Stock para 1 litro de agua destilada 1 NaNO 3 25.0 gr/l 10 2 CaCl 2.2H 2 O 2.5 gr/l 10 3 MgSO 4.7H 2 O 7.5 gr/l 10 4 K 2 HPO 4 7.5 gr/l 10 5 NaCl 2.5 gr/l 10 6 KH 2 PO 4 17.5 gr/l 10 7 KOH 15.5 gr/ 500 ml EDTA 25.0 gr / 500 ml 1 8 FeSO 4. 7H 2 O 2.49 gr / 500 ml H 2 SO 4 0.05 ml / 500 ml 1 9 H 3 BO 3 5.71 gr / 500 ml 1 SOLUCION DE ELEMENTOS TRAZA 10 ZnSO 4. 7H 2 O 4.41 gr / 500 ml 11 MnCl 2. 4H 2 O 0.72 gr / 500 ml 12 MoO 3 0.355 gr / 500 ml 13 CuSO 4. 5H 2 O 0.785 gr / 500 ml 14 Co (NO 3 ) 2. 6H 2 O 0.245 gr / 500 ml 15 CoCl 2. 6H 2 O 0.174 gr / 500 ml 1 ml del stock combinado Fuente: Determinación de la toxicidad agua de los detergentes mediante sistemas estáticos, utilizando Daphnia magna. Universidad de la Salle Adicionar los volúmenes indicados de macronutrientes, mas un (1) ml de los elementos traza y completar el volumen de la probeta que se desee preparar Agitar y ajustar el ph Anotar el ph y la fecha de preparación

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS PREPARACION DEL MEDIO BRISTOL Y CENTRIFUGACION DE ALGAS Selenastrum Capricornutum, Scenedesmus Quadricauda LB02 Página 8 de 8 Versión 0 ANEXO B Formato LB003 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO AREA DE BIOENSAYOS IDENTIFICACIÓN DE SOLUCIONES PREPARADOS Nombre de la solución: Fecha de preparación: ph: Determinación: Volumen a preparar: Preparado por: Fuente: Autoras; Grupo de Investigación en Bioensayos.

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS CONTEO DE ALGAS CON LA CAMARA NEUBAUER LB03 Página 1 de 10 Versión 0 CONTENIDO 1. Objetivo 2. Materiales 3. Definiciones 4. Procedimiento 5. Ejemplo 6. Bibliografía 1. OBJETIVO Determinar la cantidad de células algales (cultivo de algas verdes Selenastrum Capricornutum, Scenedesmus Quadricauda) que se debe suministrar las Daphnia pulex, los días de limpieza del cultivo, mediante la utilización de la cámara Neubauer. 2. MATERIALES Papel de arroz Microscopio trinocular CME Leica Cámara Neubauer Frasco de solución de algas Selenastrum Capricornutum, Scenedesmus Quadricauda a evaluar Micropipeta Brand Pipeta Pasteur Pipeteador Agua desionizada 3. DEFINICIONES Cámara Neubauer: Es una cámara que se utiliza para realizar el conteo de glóbulos, en una cantidad fija de líquido. La profundidad de la cámara es de 0.1 mm. La cuadricula de recuento muestra 9 cuadros grandes, cada uno de un (1) mm 2 ; los cuatro cuadrados grandes de las esquinas señalados con una L están en 16 cuadrados con aristas de 0.25 mm. Se utiliza para el recuento de leucocitos. El cuadrado grande central esta dividido en 25 cuadrados medianos.

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS CONTEO DE ALGAS CON LA CAMARA NEUBAUER LB03 Página 2 de 10 Versión 0 Con aristas de 0.2 mm, estando cada cuadrado mediano dividido en 16 cuadrados pequeños con aristas de 0.05 mm y una superficie de 0.0025 mm 2. Los 5 cuadrados medianos señalados con una E se utilizan para el recuento de eritrocitos y trombocitos. Tiene especial relevancia que todos los cuadros medianos presentan en todos sus lados líneas límite triple. La línea central es la frontera y decide si las células de esta zona se deben contar o no. Microscopio Trinocular: El microscopio es un instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeños para ser vistos a simple vista. Pipeta Pasteur: Son de vidrio sódico-cálcico, para uso único, ISO 7712, con punta larga y fina, con estrangulación en el tubo de aspiración apta para colocar un tapón de algodón, sin tapón de laboratorio Micropipeta: Instrumento de laboratorio empleado para medir absorber pequeños volúmenes de líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicas científicas. Agua Desionizada: Agua producida por intercambio iónico con resinas catiónicas y aniónicas con ayuda de la unidad de osmosis inversa la cual reduce el contenido de sales totales en mas del 90%. Factor de dilución: El factor de dilución es igual a el volumen final de la dilución dividido entre la cantidad alicuotada para la dilución.

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS CONTEO DE ALGAS CON LA CAMARA NEUBAUER LB03 Página 3 de 10 Versión 0 4 PROCEDIMIENTO A continuación se describe el procedimiento a realizar con la cámara de Neubauer, con capacidad de 1 x 10-4 ml. 4.1. Limpiar la cámara Neubauer con papel de arroz (figura 1) Figura 1. Limpieza de la Cámara Neubauer en los canales transversales y longitudinales Fuente web.idrc.ca/openebooks/147-7/ 4.2. Colocar el cubreobjetos sobre los canales de la cámara (figura 2) 4.3. Agitar manualmente el frasco con la solución de algas verdes concentradas, a evaluar, hasta observar coloración homogénea o disolver los agregados celulares. 4.4. Tomar una alícuota de 0.1 ml del concentrado de algas, con ayuda de una micropipeta Brand o pipeta Pasteur 4.5. Colocar la punta de la micropipeta o pipeta Pasteur en el borde del cubreobjetos.(figura 3)

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS CONTEO DE ALGAS CON LA CAMARA NEUBAUER LB03 Página 4 de 10 Versión 0 Figura 2. Colocación del cubreobjetos en la Cámara Fuente web.idrc.ca/openebooks/147-7/ Figura 3. adición del concentrado de algas en el borde del cubreobjeto Fuente web.idrc.ca/openebooks/147-7/ 4.6. Dejar ingresar la solución a la cámara por capilaridad en un tiempo de 2 minutos sin que pase a los canales laterales, no se puede dejar burbujas dentro de la cámara. 4.7. Colocar la cámara de Neubauer en la platina del microscopio trinocular y enfocar con el objetivo 10X (foto 1) 4.8. Localizar el cuadro central de la rejilla, el cual esta dividido en 25 cuadros, teniendo cada uno un área de 0.04 mm2 (foto 2) Foto 1. Cámara Neubauer, en la platina del Foto 2. Localización de la rejilla central con microscopio trinocular ayuda del microscopio Fuente: Autoras; Grupo de Investigación en Bioensayos

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS CONTEO DE ALGAS CON LA CAMARA NEUBAUER LB03 Página 5 de 10 Versión 0 4.9. Cambiar de lente al objetivo de 40x y realizar 5 lecturas de forma diagonal, teniendo presente que las células que se encuentren sobre las líneas de la cuadricula deben ser descartadas; la lectura se realiza en el orden señalado como se observa en el siguiente diagrama 1 1 2 x x x x x x x x 3 x x x 4 x x 5 x x x x x x x x Diagrama 1: Lectura en la Cámara de Neubauer Fuente: Las autoras; Grupo de investigación en Bioensayos.

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS CONTEO DE ALGAS CON LA CAMARA NEUBAUER LB03 Página 6 de 10 Versión 0 4.10. De las células contadas en cada cuadro en forma diagonal se multiplica por 4 o 5 dependiendo de la cuadricula; se suman los valores obtenidos hallando su promedio. 4.11. Si se tienen entre 200 y 250 células; realizar una dilución de las algas verdes Selenastrum Capricornutum, Scenedesmus Quadricauda a evaluar en agua desionizada. 4.11.1. Estas diluciones pueden ser 0.1 ml de concentrado de algas / 0.9 ml de agua desionizada y así sucesivamente, hasta obtener un numero de algas entre 40 y 80 por cada cuadricula. 4.12. Con la dilución se realiza los procedimientos de 4.5 a 4.9. 4.13. Registrar esta información en el formato LB004 (ver anexo A) 4.14. Se determina la cantidad de células que existen en un 1 ml, partiendo que la cámara tiene una capacidad de 1 x 10-4 ml, de la siguiente manera: XCelulas 4 1 10 ml No. celulas 1ml 4.13. Este valor se multiplica posteriormente por el factor de dilución, dado así el valor real de células que existe en 1 ml 4.14. Calcular el volumen de alimento que necesita cada pecera que contiene 20 Daphnia pulex con la siguiente fórmula: V A B C Donde: V = Volumen del concentrado de algas A = Número de Daphnia pulex por acuario.

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS CONTEO DE ALGAS CON LA CAMARA NEUBAUER LB03 Página 7 de 10 Versión 0 B = Dosis óptima recomendada (3.0 x 10 6 células por Daphnia pulex /día). (según metodología CETESB / L5.018) C = Concentración (número de células/ml) de la suspensión de algas descritas y halladas anteriormente. 4.15. Determinar la cantidad de alimento que se debe suministrar en cada pecera que contiene 20 Daphnia pulex y su frecuencia de alimentación, siendo el más recomendado tres veces por semana (lunes, miércoles y viernes). los días de limpieza. 5. EJEMPLO De una lectura realizada en el laboratorio de obtuvieron los siguientes resultados: 1 2 59 40 61 52 69 46 3 48 61 32 26 31 32 37 4 5 61 54 34 49 42 64 40 62 Fuente: Autores; Grupo de investigación en Bioensayos

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS CONTEO DE ALGAS CON LA CAMARA NEUBAUER LB03 Página 8 de 10 Versión 0 Con esta información pasamos a calcular la sumatoria y su promedio, respectivamente, de la siguiente manera: lectura1 lectura 2 lectura 3 lectura 4 lectura 5 (59 (40 (32 (61 (54 4) 4) 5) 4) 4) (61 (52 (26 (34 (49 4) 4) 5) 4) 4) (69 (48 (31 (42 (64 4) 4) 5) 4) 4) (46 (61 (32 (40 (62 4) 4) 5) 4) 4) 940 804 (37 5) 708 944 790 lecturas 4186 X 837.2celulas Con el promedio de células obtenido, se determina por medio de una conversión el numero de células en 1 ml así: 837.2células 1 10 4 ml No. decélulas 1ml No.células 8.372 6 10 Este Numero de células se multiplica por el factor de dilución, que se obtiene de la siguiente manera: Se realiza una dilución 2/10, de alga concentrada y 2,9 ml. de agua destilada, el factor de dilución es de 30.

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS CONTEO DE ALGAS CON LA CAMARA NEUBAUER LB03 Página 9 de 10 Versión 0 8.372 10 6 factordedilución 8.372 10 6 5 4.19 7 10 células 1ml Con este valor, se reemplaza en la fórmula: V V A B C 20 (3 4.19 6 10 ) 7 10 1.43ml dia Así se obtiene el volumen de concentrado de algas que se debe administrar a una pecera con 20 organismos prueba el cual en este caso seria 1.43 ml de algas por cada día. Por lunes por miércoles y viernes. 6. BIBLIOGRAFÍA DIAZ BÁEZ, María Consuelo; PICA GRANADOS Yolanda; RONCO Alicia. Ensayos toxicológicos y métodos de evaluación de calidad de aguas; conteo con la cámara de Neubauer. Canadá; IDRC, 2004. 90p. www.google.com/cámaraneubauer/procedimientoparaelconteodeglobulos CETESB. Pruebas de Toxicidad aguda. Protocolos L5.017/ 92 Proyecto CAR BID Contrato 298 94. Estudio de evaluación de toxicidad relativa de sustancias tóxicas en vertimientos y cuerpos receptores. Elaboro: Alba Janneth Bernal Paredes 41012014 Andrea Paola Rojas Avella 41001100 Primera Revisión: Pedro Miguel Escobar Malaver Segunda Revisión: Rubén Darío Londoño

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS 7. ANEXOS CONTEO DE ALGAS CON LA CAMARA NEUBAUER FORMATO LB004 REGISTRO DE CÉLULAS EN CÁMARA NEUBAUER LB03 Página 10 de 10 Versión 0 PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO AREA DE BIOENSAYOS REGISTRO DE CÉLULAS EN CÁMARA NEUBAUER LECTURA 1er. valor 2do. valor 3er. valor 4to. valor 1er. valor Sumatoria Primera 4 X 4 X 4 X 4 X 4 X Segunda 4 X 4 X 4 X 4 X 4 X Tercera 5 X 5 X 5 X 5 X 5 X Cuarta 4 X 4 X 4 X 4 X 4 X Quinta 4 X 4 X 4 X 4 X 4 X Promedio Valor 1 Día 2 Días 3 Días 4 Días 5 Días Fecha de preparación del cultivo: CANTIDAD POR DÍA 1 Daphnia pulex 20 Daphnia pulex Fuente: Autoras; Grupo de Investigación en Bioensayos.

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS MANTENIMIENTO DEL CULTIVO, Daphnia Pulex LB04 Página 1 de 12 Versión 0 CONTENIDO 1. Objetivo 2. Materiales 3. Definiciones 4. Principio del método 5. Procedimiento 6. Bibliografía 7. Anexo A Mantenimiento, separación y conservación del cultivo en peceras 8. Anexo B Ciclo de renovación del cultivo 1. OBJETIVO Realizar el mantenimiento y limpieza del cultivo de los organismos prueba Daphnia pulex, bajo condiciones de laboratorio. 2. MATERIALES Peceras Bandeja para el conteo y separación de microorganismo modelo Mallas de filtro Pipetas Pasteur plásticas de 3 ml Cristalizadores de 60mm y 70mm Lavadores con agua desionizada Agua reconstituida (dureza 40 48 mg/l) Agua de la llave Toallitas absorbentes 3. DEFINICIONES Cladóceros: Subgrupo de Braquiópodos, conformado por animales de tamaño pequeño. Se les encuentra mayormente en agua dulce.

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS MANTENIMIENTO DEL CULTIVO, Daphnia Pulex LB04 Página 2 de 12 Versión 0 Daphnias: Crustáceos planctónicos, pertenecientes al orden Cladóceros, que viven en las aguas dulces. En épocas favorables se reproducen por partenogénesis originando sólo hembras que incrementan de forma rápida la población. Efipios: Cápsula protectora, la cual se encuentra en la cámara incubadora de las Daphnia pulex, engrosando sus paredes, en ella se desarrollan los machos de esta especie, cuando cambian las condiciones favorables del ambiente o el cultivo. Su característica principal es su color oscuro y se observan dos huevos grandes Bandeja para el conteo y separación de microorganismos: Utensilio de color blanco; utilizado para la separar neonatos y contar las madres de la especie Daphnia pulex, los días de limpieza. Pipetas Pasteur plásticas de 3 ml: Pipeta plástica, en la cual se establece puede establecer el tamaño de la boca de succión dependiendo del microorganismos que se este separando y recolectando (neonatos y madres de la especie Daphnia pulex) Mantenimiento: Operación realizada con el fin de conservar el cultivo de los organismos en óptimas condiciones de reproducción, evitando alteraciones del mismo por la presencia de efipidos y madres que ya culminaron su etapa reproductiva. Limpieza: Acción realizada con el propósito de mantener las peceras donde se encuentra el cultivo en óptimas condiciones sin residuos de alimentación y caparazones de los microorganismos. Neonatos: Crustáceos de la especie Daphnia pulex, de 6 a 24 horas de nacidos en condiciones controladas de laboratorio. Daphnias Madres: Crustáceos planctónicos que se encuentra en el ambiente óptimo para su reproducción partenogenética, en condiciones controladas.

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS MANTENIMIENTO DEL CULTIVO, Daphnia Pulex LB04 Página 3 de 12 Versión 0 4. PRINCIPIO DEL METODO El mantenimiento del cultivo de organismos Daphnia pulex, se realiza según la metodología CETESB (L5.018), para conservar un cultivo masivo de 4 edades, manteniendo la posibilidad de usar neonatos del primero al cuarto parto, donde su etapa reproductiva es la mas alta. Eliminando cualquier alteración que puede producir bajas en la reproducción de los organismos entre ellas: Presencia de efipidos (machos). Residuos que pueden entrar en contacto con las Daphnia pulex y provocar mortandad de las mismas. Falta de oxigeno o alimentación en el cultivo 5. PROCEDIMIENTO 5.1. MANTENIMIENTO 5.1.1. El cultivo de Daphnia pulex se deben mantener en peceras de 2 litros con el fin de establecer el escenario óptimo para el crecimiento de los individuos. Según metodología (EPA 1994) 5.1.2. En cada una de ellas se deben mantener 20 individuos, manejando la relación de 1/100 (1 individuo por cada 100ml de agua reconstituida), con una dureza total que puede variar entre 40 y 48 mg./l para su desarrollo. (se debe tener en cuenta los parámetros de control establecidos en el protocolo LB01) 5.1.3. Cada pecera debe permanecer tapada para ello se puede utilizar plástico evitando el polvo, sustancias químicas y vapores que puede afectar la calidad del agua y la alteración del cultivo.

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS MANTENIMIENTO DEL CULTIVO, Daphnia Pulex LB04 Página 4 de 12 Versión 0 5.1.4. Renovar el cultivo teniendo en cuenta el ciclo reproductivo de la Daphnia pulex, conservándose en las etapas óptimas de reproducción, manteniéndolas en peceras separados por edad desde 0 1 semana hasta cuatro semanas; eliminando los organismos mayores a cinco semanas y renovando el cultivo con neonatos que se obtuvieron ese día. (CETESB /L5.018, 1992). 5.1.5. Esta renovación se debe realizar de manera continua hasta obtener organismos de quinta generación bajo condiciones estandarizadas de laboratorio, teniendo esta descendencia se procede a realizar las pruebas toxicológicas preliminares de sensibilidad como se muestra en el anexo A. 5.1.6. El cultivo se debe manejar en 4 peceras por semana, obteniendo 16 peceras en el mes con un total de 320 organismos prueba. Esto se debe realizar después de su aclimatación como se muestra en el anexo B, anexo C y Foto 1. 5.1.7. Conservar el cultivo a una temperatura de 20 2 C, para ello se debe ubicar un termómetro en el sitio de almacenamiento. Revisándolo y registrando continuamente en el formato LB004 (Foto 2) 5.1.8. Se debe manejar foto - periodo 16 de luz / 8 de oscuridad a y una intensidad lumínica de alrededor de 800 lux 5.2. LIMPIEZA 5.2.1. La limpieza del área de trabajo se debe realizar solo con agua, no se debe usar detergentes, desinfectantes, bactericidas, etc. 5.2.2. Limpiar diariamente las peceras, con el fin de eliminar los caparazones de los organismos y los restos (comida) que se pueden encontrar en el fondo. 5.2.3. Pasar el agua de las peceras con el cultivo a la bandeja de separación. (Foto 3) 5.2.4. Realizar la separación entre neonatos de 6 a 24 horas de nacidos y adultas (madres) en cristalizadores separados de 60 y 70mm. 5.2.5. Realizar el conteo del cultivo tanto de neonatos como la corroboración de las madres. Consignar esta información en el formato LB005.

PROGRAMADE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS MANTENIMIENTO DEL CULTIVO, Daphnia Pulex LB04 Página 5 de 12 Versión 0 5.2.6. Lavar las peceras con abundante agua de la llave; enjuagarlas con agua destilada y purgarlas con agua reconstituida (no se puede emplear ningún tipo de detergentes). 5.2.7. Filtrar el agua en un tamiz y recuperar el volumen de cada pecera 5.2.8. Cambiar una parte mínima ( 1/6) del volumen; por agua reconstituida nueva y fresca, esto se realiza los días miércoles y viernes 5.2.9. Realizar los lunes el mismo procedimiento cambiando 1000 ml del volumen total de la pecera. 5.3. RECOLECCION Y MANIPULACION DE ORGANISMOS PRUEBA Daphnia pulex 5.3.1. Extraer los organismos modelo ( neonatos de 6- a 24 horas de nacidos empleando una pipeta Pasteur de plástico de 3 mililitros, la cual, debe tener una abertura suficiente para no ocasionarle daños a ningún microorganismo 5.3.2. No se pueden formar burbujas dentro de las pipetas Pasteur. 5.3.3. Colocar los microorganismos dentro y no sobre el agua reconstituida en cristalizadores de 60mm y 70mm, porque la tensión superficial afecta la flotabilidad de los organismos y tiende a irse hacia la superficie (en los cristalizadores no se pueden formar burbujas) 5.3.4. Realizar la separación y recolección de los neonatos de manera cuidadosa evitando el estrés que se puede provocar a los organismos modelo por la transferencia de un cristalizador a otro. Estos serán utilizados para las pruebas de toxicidad, renovación de cultivo y pruebas de viabilidad. 5.3.5. Alimentar los cultivos de las peceras, teniendo en cuenta el Protocolo LB03 (conteo de algas con la cámara Neubauer) 5.3.6. Guardar las peceras en el sitio de almacenamiento y taparlo con plástico evitando el polvo, sustancias químicas y vapores que pueden estar en el ambiente del laboratorio. (Foto 4)

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS MANTENIMIENTO DEL CULTIVO, Daphnia Pulex LB04 Página 6 de 12 Versión 0 Foto 1. Mantenimiento del cultivo debidamente identificadas y rotuladas Foto 2. Sitio de almacenamiento del cultivo Foto 3. Separación y recolección de neonatos Foto 4. Sitio de almacenamiento tapado con y Daphnia Pulex madres plástico, evitando cualquier alteración del cultivo Fuente: Autoras; Grupo de Investigación en Bioensayos.

PROGRAMADE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS MANTENIMIENTO DEL CULTIVO, Daphnia Pulex LB04 Página 7 de 12 Versión 0 6. BIBLIOGRAFIA ESCOBAR MALAVER, Pedro Miguel. Implementación de un sistema de alerta de riesgo toxicológico utilizando Daphnia Pulex para la evaluación de muestras ambientales. Santafé de Bogotá; 1997. CETESB. Mantenimiento del cultivo. Protocolo L5.018, 1992 Proyecto CAR BID Contrato 298 94. Estudio de evaluación de toxicidad relativa de sustancias tóxicas en vertimientos y cuerpos receptores. Elaboro: Alba Janneth Bernal Paredes 41012014 Andrea Paola Rojas Avella 41001100 Primera Revisión: Pedro Miguel Escobar Malaver Segunda Revisión: Rubén Darío Londoño

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS MANTENIMIENTO DEL CULTIVO, Daphnia Pulex LB04 Página 8 de 12 Versión 0 Formato LB004 REGISTRO DE LA TEMPERATURA EN EL ÁREA DE MANTENIMIENTO DEL CULTIVO LB004 PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO AREA DE BIOENSAYOS REGISTRO DE LA TEMPERATURA EN EL ÁREA DE MANTENIMIENTO DEL CULTIVO FECHA TEMPERATURA PROMEDIO SEMANAL PROMEDIO Elaboro: Fuente: Autoras; Grupo de investigación en Bioensayos.

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS MANTENIMIENTO DEL CULTIVO, Daphnia Pulex LB04 Página 9 de 12 Versión 0 Formato LB005 CONTEO DE NEONATOS Y CORROBORACIÓN DE LAS MADRES. LB005 PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO AREA DE BIOENSAYOS REGISTRO DE CONTEO DE NEONATOS Y CORROBORACIÓN DE LAS MADRES Fecha: Número de pecera: Madres Observaciones: Neonatos Elaboro: Fuente: Autoras; Grupo de investigación en Bioensayos.

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS MANTENIMIENTO DEL CULTIVO, Daphnia Pulex LB04 Página 10 de 12 Versión 0 Anexo A Aclimatación de cultivos 1 Generación 4 peceras cada una con 20 individuos 1P 2P 3P 4P 2 Generación 4 peceras cada una con 20 individuos 1P 2P 3P 4P 3 Generación 4 peceras cada una con 20 individuos 1P 2P 3P 4P 4 Generación 4 peceras cada una con 20 individuos 1P 2P 3P 4P 5 Generación Neonatos para realización de pruebas de toxicidad Renovación del Cultivo Renovación del cultivo e iniciación de pruebas toxicológicas Fuente: Autoras, Grupo de Investigación en Bioensayos.

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS ANEXO B MANTENIMIENTO DEL CULTIVO, Daphnia pulex LB04 Página 11 de 12 Versión 0 Recolección de Organismos modelo Humedal Guaymaral Aclimatación de las 8 Daphnia Pulex Hembras adultas, representadas por la letra H cada una en un cristalizador 1H 2H 3H 4H 5H 6H 7H 8H 1 Semana 2 Semana 4 peceras cada una con 20 individuos 1P 3P 2P 4P 4 peceras cada una con 20 individuos 1P 3P 2P 4P 3 Semana 4 peceras cada una con 20 individuos 1P 3P 2P 4P 4 peceras cada una con 20 individuos 4 Semana 1P 2P 3P 4P Renovación del Cultivo Renovación y mantenimiento del cultivo del organismo prueba Daphnia pulex Fuente: Autoras, Grupo de Investigación en Bioensayos.

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS Anexo C MANTENIMIENTO DEL CULTIVO, Daphnia Pulex LB04 Página 12 de 12 Versión 0 Inicio de reproducción de 10 a 12 días de nacidas 0 24 horas 1 Semana 2 Semana Se pasan 20 indiv. 3 Semana Inicio de cultivo con nuevo neonatos Generación de Organismos 4 Semana Ensayos de Viabilidad Pruebas toxicológicas Disminuye su etapa de reproducción Eliminación de Daphnia Pulex Madres Anexo C. Ciclo Reproductivo de organismos modelo Daphnia pulex Fuente: Autoras, Grupo de Investigación en Bioensayos.

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS LB05 PRUEBA DE TOXICIDAD Página 7 de 8 Versión 0 5.3.1. Obtener la concentración letal media (CL50-48), con sus respectivo límite superior e inferior con una confiabilidad del 95% por medio de el método Probit, para ello remítase la protocolo LB006 Análisis de Regresión y Análisis Probit 5.3.2. Realizar el análisis de varianza (ANOVA) del resultado con el procedimiento descrito en el protocolo LB07 análisis de varianza Notas: 1. La mortalidad en los controles no debe ser mayor que el 10% y preferiblemente no más que el 5%. 2. Si la mortalidad en el control sobrepasa el 10%, esta prueba se considera no representativa y se requiere la repetición de la misma. 3. La concentración de oxigeno medida en el bioensayo después de 48 horas debe ser mayor de 2 mg/l. 1 4. Se debe realizar semanalmente una prueba de sensibilidad con los rangos establecidos del dicromato de potasio; el resultado de la concentración letal media (CL50-48) del tóxico de referencia debe estar dentro de los límites superiores e inferiores establecidos en la carta de control. 6. BIBLIOGRAFIA 1 ESCOBAR MALAVER, Pedro Miguel. Implementación de un sistema de alerta de riesgo toxicológico utilizando Daphnia pulex para la evaluación de muestras ambientales. Santafé de Bogotá; 1997. CETESB. Pruebas de Toxicidad aguda. Protocolos L5.017 y L5.022 1992 Proyecto CAR BID Contrato 298 94. Estudio de evaluación de toxicidad relativa de sustancias tóxicas en vertimientos y cuerpos receptores. Elaboro: Alba Janneth Bernal Paredes 41012014 Andrea Paola Rojas Avella 41001100 Primera Revisión: Pedro Miguel Escobar Malaver Segunda Revisión: Rubén Darío Londoño

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS 7. ANEXOS LB05 PRUEBA DE TOXICIDAD Página 8 de 8 Versión 0 LB001 PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO AREA DE BIOENSAYOS REGISTRO DE DATOS DEL TEST DE TOXICIDAD AGUDA Ficha del test estático definitivo con: Muestra: Datos fisicoquímicos de la muestra Conductividad: Dureza: ph: Tratamiento de la muestra Sedimentación: Filtración: Ajuste de ph: Inicio de la prueba: / /, a las horas Fin de la prueba : / /, a las horas Agua de dilución: ph:, Dureza:, Fecha de Preparación: / RESULTADOS Concentración nominal No. de organismos muertos Medidas finales 1 2 3 4 OD ph No. Observado de muertes / No. Total de organismos % mortalidad obtenido Elaboro: ESCOBAR MALAVER, Pedro Miguel. Implementación de un sistema de alerta de riesgo toxicológico utilizando Daphnia pulex para la evaluación de muestras ambientales. Santafé de Bogotá; 1997

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS ANÁLISIS DE RESULTADOS, MEDIANTE EL METODO DE PROBIT LB06 Página 1 de 22 Versión 0 CONTENIDO 9. Objetivo 10. Definiciones 11. Principio del modelo matemático 12. Procedimiento 13. Bibliografía 14. Anexo A Relación entre el Probit empírico y el porcentaje de mortalidad Anexo B Representación gráfica del cálculo de la CL50 Anexo C Determinación del Chi-cuadrado (X 2 ). Anexo D Factor (p) para el Probit calculado (Y). 1. OBJETIVO Evaluar los resultados de los ensayos por medio de un modelo estadístico 2. DEFINICIONES Concentración: La concentración es la magnitud física que expresa la cantidad de un elemento o un compuesto por unidad de volumen. Dosis: Contenido de principio activo, expresado en cantidad por unidad de toma, por unidad de volumen o de peso en función de la presentación, que se administrará de una vez. Efecto: Consecuencia positiva o negativa, de la ocurrencia de un evento. Modelo: Conceptualización de un evento, un proyecto, una hipótesis, el estado de una cuestión, que se representa como un esquema con símbolos descriptivos de características y relaciones más importantes con un fin: ser sometido a modelización como un diseño flexible, que emerge y se desarrolla durante el inicio de la investigación como una evaluación de su relevancia.

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS ANÁLISIS DE RESULTADOS, MEDIANTE EL METODO DE PROBIT LB06 Página 2 de 22 Versión 0 Toxicidad aguda: La toxicidad aguda tiene por objeto determinar los efectos de una dosis única y muy elevada de una sustancia. Usualmente, el punto final del estudio es la muerte del animal y la toxicidad aguda se expresa por la dosis letal 50, que viene a representar más o menos la dosis de la sustancia que produce la muerte en el 50% de los animales. Probit: Modelo estadístico que analiza las pruebas de toxicidad. El método consiste en la aplicación de correlaciones estadísticas para estimar las consecuencias desfavorables sobre una población a los fenómenos físicos peligrosos; nos da una relación entre la función de probabilidad y una determinada carga de exposición. 3. PRINCIPIO DEL MODELO MATEMATICO En un experimento típico de pruebas de toxicidad se tiene la siguiente situación: Concentración de la sustancia o dosis (d). Número de individuos (n). Número de organismos muertos o afectados (r). Porcentaje de efecto (p). p r n 100 La representación gráfica de p vs. d, o relación dosis-respuesta, genera una curva parabólica que muchas veces presenta dificultades en la construcción de un modelo lineal. Una forma de abordar este problema es transformando d a una escala logarítmica (X = log10 (d)), lo cual mostrará una relación dosis-respuesta de forma S o sigmoidea normal, como se muestra en la figura 1; de esta manera la distribución de p vs. X será de tipo normal.

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS ANÁLISIS DE RESULTADOS, MEDIANTE EL METODO DE PROBIT LB06 Página 3 de 22 Versión 0 Figura 1. Relación dosis-respuesta Posteriormente, mediante las tablas de Probit se transforma p (porcentaje de efecto) a unidades Probit (buscando en una tabla de distribución normal el valor de z correspondiente a una probabilidad acumulada igual a p y sumándole a continuación cinco unidades), se obtiene una distribución de puntos en un sistema bivariado de tipo lineal, los cuales se procesan según un análisis de regresión típico. Vale la pena enfatizar que el Probit es una transformación sobre la tasa de efecto (p), y la ecuación generada es de la forma: y a bx Donde: y (expresado en unidades Probit) = z + 5 z= Variable normal estándar = z O tal que la Prob (z z O ) = p a y b son los estimadores de los parámetros de la recta de regresión Asi, cuando p= 50% entonces y = 5, por lo tanto: X 5 = log 10 CL 50, entonces CL 50 = 10 5

LB06 PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO ANÁLISIS DE RESULTADOS, MEDIANTE EL Página 4 de 22 DE BIOENSAYOS METODO DE PROBIT Versión 0 Para facilitar los cálculos, simplemente se puede usar un software como el suministrado por la US Environmental Protection Agency (US EPA): Probit Analysis Program, El procedimiento Probit permite encontrar estimadores m-verosímiles de parámetros de regresión y de tasas naturales (por ejemplo, tasas de mortalidad) de respuesta para ensayos biológicos, analizando porcentajes de efecto vs. dosis dentro del marco de la regresión. 4. PROCEDIMIENTO 4.1. Para el cálculo de la CL50 por este método es necesario contar, por lo menos, con dos porcentajes intermedios del efecto esperado (valores entre 0 y 100%). 4.2. Con los resultado obtenidos en los ensayos de toxicidad aguda con Daphnia pulex se debe construir una tabla que contenga los siguientes datos: Concentración de la sustancia ensayada en % Logaritmo en base 10 de las concentraciones (x) Numero de organismos en cada concentración Número de organismos muertos en cada concentración (r). Porcentaje de mortalidad en cada concentración (P). Probit empírico (PE). Probit esperado o calculado (Y). Los cinco primeros resultados corresponden a datos experimentales; el Probit empírico se obtiene de la tabla del anexo A con el porcentaje de mortalidad observada en cada una de las concentraciones. Concentración del agente tóxico (%) Tabla 1: Cálculo de la CL50 por el método Probit Núm. de Núm. de organismos muertos (N) (r) Log10 de la concentración (X) Porcentaje de mortalidad (P) Probit empirico (PE) Probit calculado (Y)

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS ANÁLISIS DE RESULTADOS, MEDIANTE EL METODO DE PROBIT LB06 Página 5 de 22 Versión 0 4.3. A partir de estos datos se elabora una gráfica en papel cuadriculado, colocando en el eje x el logaritmo de las concentraciones y en el eje Y el Probit empírico (figura 1 Anexo B), y se ajusta la recta a través de estos puntos. En el gráfico se traza una línea a partir del Probit 5,0 hasta cortar la línea trazada; el valor correspondiente en el eje x se denomina m y el antilogaritmo de este valor corresponderá a la CE50 o CL50. Para el cálculo del Probit esperado o calculado, debe hallarse el valor de S correspondiente a la tasa de incremento del log de la concentración (x) por unidad de incremento del Probit. 4.4. Para el cálculo del Probit esperado o calculado, debe hallarse el valor de S correspondiente a la tasa de incremento del log de la concentración (x) por unidad de incremento del Probit 4.5. En la recta trazada se calcula la pendiente, tomando el porcentaje donde se halló el mayor y el menor efecto, así como los probits correspondientes a estos valores, remplazando en la siguiente formula: S = (X x) / (PE Pe) Donde: X: Mayor concentración x: Menor concentración PE: Probit empírico correspondiente a la mayor concentración Pe: Probit empírico correspondiente a la menor concentración

LB06 PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE ANÁLISIS DE RESULTADOS, MEDIANTE EL Página 6 de 22 BIOENSAYOS METODO DE PROBIT Versión 0 4.6. A partir de estos datos se elabora una gráfica en papel cuadriculado, colocando en el eje x el logaritmo de las concentraciones y en el eje Y el Probit empírico (figura 1 Anexo B), y se ajusta la recta a través de estos puntos. En el gráfico se traza una línea a partir del Probit 5,0 hasta cortar la línea trazada; el valor correspondiente en el eje x se denomina m y el antilogaritmo de este valor corresponderá a la CE50 o CL50. Para el cálculo del Probit esperado o calculado, debe hallarse el valor de S correspondiente a la tasa de incremento del log de la concentración (x) por unidad de incremento del Probit. 4.7. Para el cálculo del Probit esperado o calculado, debe hallarse el valor de S correspondiente a la tasa de incremento del log de la concentración (x) por unidad de incremento del Probit 4.8. En la recta trazada se calcula la pendiente, tomando el porcentaje donde se halló el mayor y el menor efecto, así como los probits correspondientes a estos valores, remplazando en la siguiente formula: S = (X x) / (PE Pe) Donde: X: Mayor concentración x: Menor concentración PE: Probit empírico correspondiente a la mayor concentración Pe: Probit empírico correspondiente a la menor concentración

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS ANÁLISIS DE RESULTADOS, MEDIANTE EL METODO DE PROBIT LB06 Página 7 de 22 Versión 0 4.9. Así, los valores del Probit esperado o calculado (Y) para cada concentración podrán ser calculados utilizando la siguiente expresión: Y 5 x S m 4.10. Una vez calculados se colocan en la columna correspondiente de la tabla 1. 4.11. La prueba de hipótesis utilizada para establecer la asociación entre la concentración de la sustancia tóxica y la respuesta en unidades probit es la prueba de CHI-cuadrado (X 2 ). Los datos para el cálculo de este valor se colocan en una tabla 2 (anexo C) de la siguiente forma: Concentración de la sustancia estudiada en % Logaritmo decimal de la concentración (x). Probit calculado o esperado (Y). Numero de organismos (N) Mortalidad observada (r) Porcentaje de efecto esperado (P). 4.12. La mortalidad esperada (NP') se calcula multiplicando (N) por (P'). 4.13. El cálculo de la desviación de la mortalidad se obtiene hallando la diferencia entre la mortalidad observada y la esperada. La contribución al Chi cuadrado de cada uno de los valores se calcula: ( r NP) 2 / NP(1 P) 4.14. Y para el cálculo de los grados de libertad (n): n K 2 donde K es el número de concentraciones utilizadas

LB06 PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE ANÁLISIS DE RESULTADOS, MEDIANTE EL Página 8 de 22 BIOENSAYOS METODO DE PROBIT Versión 0 4.15. Con los datos obtenidos de realiza la siguiente tabla 3 para el calculo del intervalo de confianza: Grados de libertad(n) Tabla 3. Valores de X2 para una P=0.05. X2 4.16. Para el cálculo de los límites es necesario establecer el error estándar. El error estándar del log de la concentración letal para el 50% de los organismos se obtiene a través de la siguiente expresión: EE log 2 2 2 10 CL50 S 1/ SNp ( m x) / SNp( x x ) 0.5 4.17. Inicialmente, se construye una tabla en la cual se incorporen los siguientes datos: Logaritmo decimal de las concentraciones (x). Numero de organismos por concentración (N). Probit esperado o calculado (Y). Factor p, el cual se obtiene de la tabla 4 del Anexo C con el valor Y. Productos Np, Npx y Npx2, obtenidos de los datos de la misma tabla Sumatoria de los productos correspondientes a los valores SNp, SNpx y S Npx2 Factor p debe ser obtenido en la tabla entrando el valor de Probit calculado Producto Np resultante de la multiplicación de los valores de número de organismos por el factor p y su respectiva sumatoria. Producto Npx resultante de la multiplicación del producto anterior por el logaritmo de las concentraciones con su respectiva sumatoria. Producto Npx2 resultante de la multiplicación del producto anterior por el logaritmo de la concentración con su respectiva sumatoria.

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE ANÁLISIS DE RESULTADOS, MEDIANTE EL BIOENSAYOS METODO DE PROBIT 4.17. Con todos los datos se obtiene la siguiente tabla 5: LB06 Página 9 de 22 Versión 0 Log 10 de la concentración (x) Tabla 5. Cálculo del error estándar del log10 CL50. Núm. De Probit Factor Producto Producto organismos calculado (p) (Np) (Npx) (N) (Y) Producto (Npx 2 ) 4.18. Al tener la CL50 y no olvidando que el intervalo de confianza es 95% tendremos la concentración letal con sus limites inferior y superior respectivamente. Para el desarrollo de esta investigación se adquirió el Software de Probit, el cual determinar la CL50-48 y los limites de confianza mas rápido, y su procedimiento es el siguiente: 4.19. Se instala el programa en un computador que cuente con un software de Windows 98 en adelante, creándose una carpeta de Probit en el escritorio. 4.20. Dentro de esta carpeta quedaran registrados varios archivos; se dirige al archivo con nombre PROBFIS2 y se da doble clic donde se abre una ventana de la siguiente manera:

LB06 PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE ANÁLISIS DE RESULTADOS, MEDIANTE EL Página 10 de 22 BIOENSAYOS METODO DE PROBIT Versión 0 Da dos opciones para manejar el programa, la (1) es para introducir los datos con el teclado, la (2) para introducirlos en fila. Es este paso se escribe (1), y sale: Ahora se le da un nombre al archivo que se crea con los resultados que determina el programa, así:

LB06 PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE ANÁLISIS DE RESULTADOS, MEDIANTE EL Página 11 de 22 BIOENSAYOS METODO DE PROBIT Versión 0 Ahora el programa pide que se inserten el numero de concentraciones, sin el control, numero de muertes en el control, numero de organismos en el control, así: Ahora se procede a insertar los datos de las concentraciones comenzando por la concentración menor, el numero de muertes en cada una y el numero de tratamientos, así: Así, sucesivamente hasta completar los datos de las 5 concentraciones. Al terminar este paso se da enter y se cierra esta ventana, en la carpeta de probit aparece un archivo con el nombre que se le designo a esa batería donde dará los resultaos de la CL50 son los limites de confianza.

LB06 PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE ANÁLISIS DE RESULTADOS, MEDIANTE EL Página 12 de 22 BIOENSAYOS METODO DE PROBIT Versión 0 Este procedimiento se debe realizar para cada batería de ensayo, quedaran registrados los resultados en su respectivo archivo. 5. EJEMPLO Se realizo una prueba de toxicidad, de la cual se obtuvieron los siguientes porcentajes de mortalidad: Ejemplo de cálculo de la CL50 por el método Probit. Concentración Log10 de la Núm. de Núm. de del agente concentración organismos muertos tóxico (%) (X) (N) (r) Porcentaje de mortalidad (P) Probit empirico (PE) Probit calculado (Y) 100 2,0 20 15 75 5,67 5,53 50 1,7 20 9 45 4,87 4,96 25 1,4 20 5 25 4,33 4,40 12,5 1,1 20 2 10 3,72 3,84 6,25 0,8 20 1 5 3,36 3,27 No se debe olvidar que los cinco primeros resultados corresponden a datos experimentales; el Probit empírico se obtiene de la tabla de anexo A con el porcentaje de mortalidad observada en cada una de las concentraciones. A partir de estos datos se elabora una gráfica en papel cuadriculado, colocando en el eje x el logaritmo de las concentraciones y en el eje Y el Probit empírico (figura 1 Anexo B), y se ajusta la recta a través de estos puntos. En el gráfico se traza una línea a partir del Probit 5,0 hasta cortar la línea trazada; el valor correspondiente en el eje x se denomina m y el antilogaritmo de este valor corresponderá a la CL50. Teniendo en este caso un m = 1.72, por lo tanto la CL50 = 52.5 mg/l. En la recta trazada se calcula la pendiente, tomando el porcentaje donde se halló el mayor y el menor efecto, así como los probits correspondientes a estos valores: x x m M 0.8 2.0 PE PE 3.30 5.55 Si: S ( X x) /( PE PE)

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS Siendo: ANÁLISIS DE RESULTADOS, MEDIANTE EL METODO DE PROBIT LB06 Página 13 de 22 Versión 0 xm = xm = PE = PE = Mayor concentración. Menor concentración. Probit empírico correspondiente a la mayor concentración. Probit empírico correspondiente a la menor concentración. Tendremos: S S (2.0 0.533 0.8) /(5.55 3.30) Obteniendo así la tabla del Chi-cuadrado (X 2 ) como se observa en al Anexo E. Se remplaza en la ecuación los valores: n n K 5 2 2 3 En la tabla 4 se determina el valor de X2 para tres grados de libertad, el valor obtenido es 7,82; al compararlo con el valor obtenido en la tabla, se observa que: 7.82 > 0.482 Por lo tanto, la recta está bien ajustada; en caso contrario, trazar nuevamente la recta y volver a calcular el Chi cuadrado. Tabla 5.7. Valores de X2 para una P=0.05. Grados de libertad(n) x2 1 3,34 2 5,99 3 7,82 4 9,49 5 11,4 6 12,6 7 14,4 8 15,5 9 16,9 10 18,8

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE ANÁLISIS DE RESULTADOS, MEDIANTE EL BIOENSAYOS METODO DE PROBIT Cálculo del intervalo de confianza LB06 Página 14 de 22 Versión 0 Para el cálculo de los límites es necesario establecer el error estándar. El error estándar del log de la concentración letal para el 50% de los organismos se obtiene a través de la siguiente expresión: EE log 2 2 2 10 CL50 S 1/ SNp ( m x) / SNp( x x ) 0.5 Así se construye la grafica: Cálculo del error estándar del log10 CL50. Log 10 de la Núm. de Probit Factor concentración organismos calculado (p) (x) (N) (Y) Producto (Np) Producto (Npx) Producto (Npx2) 2,0 20 5,53 0,569 11,38 22,76 45,52 1,7 20 4,96 0,635 12,70 21,59 36,70 1,4 20 4,40 0,558 11,16 15,62 21,87 1,1 20 3,84 0,388 7,76 9,54 9,39 0,8 20 3,27 0,194 3,88 3,10 2,48 (Σ) 46,88 71,61 115,96 En este caso sería: S= 0.533 x= Npx / Np= 1.527 m= 1.72 Np= 46.88 Npx= 71.61 Npx 2 =115.96 Np(x-x 2 ) = Npx2 {( Npx)2/ Np} = 6.574 Sustituyendo estos valores en la expresión: EE log CL 10 50 0.0875 Así, el EE de CL50 será: EECL50 log 10 EE log 10 CL50 10 m

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS Donde: ANÁLISIS DE RESULTADOS, MEDIANTE EL METODO DE PROBIT LB06 Página 15 de 22 Versión 0 log10 2.3026 EE log 10 m 10 CL 51.97 50 0.0875 Sustituyendo los valores en la expresión: EECL 50 32.96 Como la: CL 50 51.97 Intervalodeconfianza al95% 51.97 32.46 51.97 32.46 37.14 m 84.43 EECL 50 Por tanto, la CL50 con los respectivos límites será: Limite inferior: 41.9 ppm CL 50: 52.5 ppm Limite Superior: 63.1 ppm Utilizando el Software con los datos de el ejemplo anterior seria:

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO DE BIOENSAYOS ANÁLISIS DE RESULTADOS, MEDIANTE EL METODO DE PROBIT LB06 Página 16 de 22 Versión 0 Al terminar de digitar los datos en el programa, se cierra esta ventana y al abrir el archivo de nombre B los datos salen registrados de la siguiente manera: CONCENTRAZIONE LOG(CONC) N.TRATTATI N.MORTI osservati attesi 6.25 0.7959 20. 1. 0.68 12.50 1.0969 20. 2. 2.20 25.00 1.3979 20. 5. 5.28 50.00 1.6990 20. 9. 9.73 100.00 2.0000 20. 15. 14.27 Controllo 20. 0. 0.00 ======================================================================