Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamón Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas

Transcripción

1 Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamón Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas Dra. Ana María Lugo-Chinchilla Enero

2 Agradecimientos Agradezco la ayuda de todos estudiantes, profesores y técnicos de laboratorio que de una manera u otra colaboraron en la producción de este manual. En especial agradezco a las siguientes personas: Dra. Zulma Rivera, Catedrática Asociada, Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas, Universidad Interamericana de Puerto Rico, Recinto de Bayamón. (Editora). Dr. Juan Manuel Barbosa, profesor a tiempo parcial, Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas, Universidad Interamericana de Puerto Rico, Recinto de Bayamón. (Editor). Dr. Oscar Ruiz, Catedrático Auxiliar, Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas, Universidad Interamericana de Puerto Rico, Recinto de Bayamón. (Bioinformática). Sra. Hilda Cedeño, Técnico de Laboratorio de Biología, Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas, Universidad Interamericana de Puerto Rico, Recinto de Bayamón. (Asistencia en General). Srta. Irma Soto, estudiante, Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas, Universidad Interamericana de Puerto Rico, Recinto de Bayamón. (Asistencia en General). Srta. Yarelys Robles, estudiante, Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas, Universidad Interamericana de Puerto Rico, Recinto de Bayamón. (Fotografía y Asistencia en General). Srta. Silkia Rivera, estudiante, Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas, Universidad Interamericana de Puerto Rico, Recinto de Bayamón. (Asistencia en General). 2

3 Tabla de Contenido Página Agradecimientos 2 Tabla de contenido 3 Prontuario del curso BIOL Reglas de seguridad 7 Informes de Laboratorio 9 Ejercicio #1: Medición, Instrumentación, Presentación de Resultados 12 Ejercicio #2: Técnicas para el establecimiento de cultivos celulares 14 Ejercicio # 3: Fraccionamiento Celular 18 Ejercicio # 4: Transformación Bacteriana 29 Ejercicio # 5: Purificación de Proteínas GFP 33 Ejercicio # 6: Electroforesis de Proteínas 38 Ejercicio # 7: Extracción de DNA 42 Ejercicio # 8: PCR 44 Ejercicio # 9: Efecto del alcohol en la Membrana 53 Ejercicio # 10: DNA Fingerprinting 56 Ejercicio # 11: Enzimas 60 Ejercicio # 12: Ensayo de Fagocitosis 64 Ejercicio # 13: Bioinformatica 78 Ejercicio # 14: Biorremediación 81 3

4 UNIVERSIDAD INTERAMERICANA DE PUERTO RICO Recinto de Bayamón División de Artes y Ciencias Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas PRONTUARIO I. TÍTULO DEL CURSO: Laboratorio de Destrezas II: Técnicas de Biología Celular y Molecular. II. CÓDIGO Y NÚMERO: Biol III. REQUISISTOS: Laboratorio de Destrezas II (Biol. 2013) IV. DESCRIPCIÓN DEL CURSO: Uso de técnicas de biología celular y molecular aplicables a la biotecnología y a la investigación científica. Se incluye la bioremediación y la bioinformática. Cuatro horas semanales. 2 créditos V. OBJETIVOS A. TERMINALES: 1. Manejar las técnicas para el estudio de las biomoléculas. 2. Comparar los resultados obtenidos del estudio de las biomoléculas. 3. Evaluar la(s) técnica(s) apropiada(s) para la solución de un problema científico o proceder en una investigación. B. OBJETIVOS CAPACITANTES: 1. Utilizar las siguientes técnicas: electroforesis, transformar bacterias, purificación de proteínas, extracción y amplificación de DNA. 2. Practicar procesos de bioremediación. 3. Valorar la importancia de la bioremediación en el manejo de crisis ambientales. 4. Analizar los resultados obtenidos en un experimento. 5. Formular conclusiones basadas en el análisis de los resultados. 6. Preparar un informe científico. 7. Identificar la técnica apropiada para el análisis del DNA o de las proteínas. 8. Análisis de macromoléculas utilizando técnicas computacionales. VI. CONTENIDO: 1. Reglas de seguridad en celular y molecular; Formato de los informes de laboratorio 2. Repaso de medición e instrumentación; Presentación e interpretación de resultados 3. Extracción de DNA: genómico 4. Aislamiento de plasmidios 4

5 5. Bioinformática 6. Enzimas de restricción y metilación 7. Transformación de bacterias 8. Purificación de proteínas mediante columna de separación 9. Extracción de proteínas y SDS-PAGE I 10. SDS- PAGE II 11. PCR 12. Bioremediación VII. EVALUACIÓN: A. Criterios de Evaluación: 1. Trabajo diario: Puntualidad y Asistencia; Dominio del procedimiento a realizarse; Seriedad en clase; Observar reglas de seguridad (bata, zapatos, guantes); Trabajo en equipo 10% 2. Informes de laboratorio 50% 3. Examen Final 25 % 4. Trabajo de Investigación 15% B. Curva: A B C D 59-0 F VIII. RECURSOS Y MATERIALES DIDÁCTICOS A. Texto: Manual de Laboratorio de Destrezas III: Diseñado por la Dra. Ana María Lugo en colaboración de facultad del Recinto de Bayamón. Se requiere el uso de bata de laboratorio, zapatos cerrados y pelo recogido. B. Referencias: (Proyecto de Bioremediación 5

6 Itinerario de Laboratorios Período Actividad Asignación 1 INTRODUCCIÓN Discusión de: Prontuario, Reglas de seguridad, formato informes de laboratorio 2 LABORATORIO 1 Repaso de medición e instrumentación Presentación e interpretación de resultados 3 LABORATORIO 2: Cultivo de Células Eucariotas: Técnicas asépticas y preparación medios de cultivo 4 LABORATORIO 3: Fraccionamiento Celular 5 LABORATORIO 4: Transformación bacteriana (GFP) 6 LABORATORIO 5: Purificación de la proteína GFP Crecimiento bacterial y Concentración bacterial 7 LABORATORIO 5 Parte II c. Lisis bacterial 8 LABORATORIO 5: Parte III Cromatografía de columna 9 LABORATORIO 6: Extracción de proteínas de músculo 10 LABORATORIO 6 Parte II: Electroforesis de proteínas (SDS-PAGE) 11 LABORATORIO 7: Extracción DNA de fresas Electroforesis de DNA y PCR (Traer fresas frescas) 12 LABORATORIO 8: Efecto del alcohol en membranas biológicas Traer bata y zapatos cerrados; traer sus laptops Entrega inf. Lab #1 (100pts) Traer coliflor y espinaca frescas Entrega inf. Lab #2 (100pts) Entrega inf. Lab #3 (100pt) Entrega inf. Lab #4 (100pt) Entrega inf. Lab #5 (200pt) Entrega inf. Lab #6 (200pts) Traer remolacha fresca y de pote Entrega inf. Lab #7 (100pt) 13 LABORATORIO 9: Enzimas Entrega inf. Lab #8(100pts) 14 REPASO Entrega inf. Lab #9(100pt) 15 EXAMEN 6

7 Informes de Laboratorio Una parte importante del desarrollo científico es la divulgación de los hallazgos. Mediante esta divulgación, conocemos lo que otros han hecho y podemos fortalecer nuestra gestión, como científicos. La base de la divulgación es el informe técnico o informe de laboratorio. A través de este informe puedes resumir lo que hiciste para contestar, al menos, cinco preguntas clave: Cuál es la situación sobre la cual quieres experimentar? (Introducción) Por qué se hizo el ejercicio de laboratorio? (Objetivos) Cómo se llevó a cabo el ejercicio? (Materiales y métodos) Cuáles fueron los datos obtenidos (Resultados) Qué importancia o significado tienen los resultados? (Discusión y conclusiones) Es importante señalar que en cualquier experimento podrás obtener resultados diferentes a los esperados. Después de todo, si supieras los resultados de antemano, para qué experimentar? Bajo ningún concepto esto debe entenderse como un fracaso. Más aún, es mediante el análisis y la experimentación repetida que estamos tratando de entender. Muchos hallazgos de valor en las ciencias naturales se dieron por accidentes o casualidades que ocurrieron a estudiosos que supieron determinar el significado de los experimentos que condujeron. El informe de laboratorio es el material que presentarás a tu instructor como prueba de que hiciste el experimento. Dicho informe debe basarse en los datos y observaciones que hayas anotado en tu libreta de laboratorio. Dicho informe deberá ser entregado en la fecha acordada por el profesor. El informe se entregará digital. La libreta de laboratorio que utilizarás durante todo el semestre y que tu instructor podría recoger en cualquier momento del semestre deberá: 1. Estar identificada con tu nombre, número de sección y nombre del instructor. 2. Tener las páginas enumeradas de antemano y cosidas (no de hoja suelta) y no tener páginas arrancadas. 3. Escrita con tinta (azul o negra), nunca con lápiz. Si es necesario corregir algún dato que ya escribiste, deberás tacharlo pasando una sola raya sobre el error (de modo que el dato permanezca legible) escribiendo el dato correcto al lado del dato erróneo y colocando tus iniciales sobre ambos datos (ver ejemplo en el Apéndice). 4. Estar siempre en tu posesión. De esta manera, la podrás utilizar cada vez que necesites anotar datos y evitarás tener que anotarlos en hojas de papel sueltas o en tu mano, de donde se pueden perder o borrar fácilmente. 5. Recoger los datos que generen otros miembros del grupo al que pertenezcas y que sean necesarios para tus análisis fuera del salón de clases. En este curso se te requerirá someter informe de laboratorio siguiendo los formatos científicos utilizados más comúnmente. El informe recoge los puntos más significativos del trabajo que realizaste y establece claramente qué se hizo, quién lo hizo, por qué se hizo, cómo se hizo, cuáles fueron los resultados y cuál es el significado de esos resultados. El informe debe contener alguna información general que tu instructor solicitará. 7

8 Las partes de un informe técnico del laboratorio son: 1. Título: refleja en el contenido del experimento de forma que el lector pueda interesarse en la lectura. El título debe ser corto pero informativo. 2. Lista de autores: todos aquellos que participaron en la redacción, diseño o realización del experimento deben aparecer como autores del trabajo. Es importante que todos los miembros del grupo sean reconocidos. 3. Resumen: el resumen debe contener información suficiente sobre la introducción, los materiales y métodos, los resultados y la discusión. No debe pasar de un párrafo. 4. Introducción: debe ser una descripción breve de lo que se conoce con relación al problema bajo estudio, de modo que el lector sepa qué se ha hecho y qué se sabe con relación al problema. La introducción debe exponer claramente por qué es necesario completar el experimento que te propones realizar e incluir los objetivos. Estos objetivos deben ser redactados antes de hacer el experimento, y deben ser realistas en términos de tiempo y capacidad analítica del laboratorio. 5. Materiales y métodos: esta parte del informe recoge la manera en que se condujo el experimento para contestar las preguntas formuladas o alcanzar los objetivos propuestos. La manera en que redactas esta parte del informe debe ser tan clara como para que cualquier otra persona, con acceso a los mismos reactivos y materiales, pueda obtener resultados similares. Este concepto se conoce como reproducibilidad y es una idea clave en las ciencias naturales. Los materiales y métodos deben aparecer de forma resumida detallando lo que se hizo, cómo se hizo y en qué forma se hizo (por ejemplo, añadí 5 ml de agua al tubo que contenía el reactivo de cobre y mezclé por 30 segundos). Si utilizas un instrumento especifico (puede haber más de uno en el salón) debes mencionar en tu informe cuál fue el modelo utilizado. 6. Resultados: esta parte del informe recoge, precisamente, los datos que generamos del experimento. Es importante reconocer que no necesariamente estos resultados deben concordar con lo que esperamos. Siempre que puedas, debes presentar los datos en forma gráfica (tablas o cuadros, gráficas o dibujos). Estos permite la representación concisa y clara de muchos datos en poco espacio. En la medida en que puedas, debes incluir en el informe de laboratorio las fórmulas y cálculos matemáticos utilizados para obtener los resultados. 7. Discusión de los resultados: en esta parte del informe debes explicar los resultados y cuál es su significado. Siempre que sea posible, debes comparar los resultados obtenidos con los resultados esperados y tratar de explicar las posibles razones para las discrepancias entre las cifras. Es aquí que podrás demostrar tu capacidad analítica e intuitiva. 8. Referencias: debes citar las referencias de todo lo que hayas usado para comparar, obtener información o guiarte en la realización del experimento. Mínimo 2. Es importante señalar que el trabajo de laboratorio en este curso te permitirá desarrollar destrezas analíticas que te servirán para entender mejor los procesos biológicos y te prepararán adecuadamente para cursos futuros. En algunos casos dependerás de tus compañeros de grupo para obtener e interpretar los datos obtenidos. Es muy importante que intercambies y discutas con ellos tus resultados. Sácale el mejor provecho a tu experiencia y acude a tu instructor en caso de dudas. 8

9 Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamón Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas NOMBRE Biología Celular y Molecular #SS Dra. Ana María Lugo FECHA Laboratorio 4605 Ejercicio #1: Repaso de medición e instrumentación; Presentación e interpretación de resultados OBJETIVOS DEL LABORATORIO 1. Aprender a manejar correctamente micropipetas, pipetas, probetas con el propósito de preparar soluciones. 2. Preparación de soluciones dado por cientos de concentraciones 3. Preparación de soluciones de determinada molaridad. 4. Preparación de diluciones en serie. 5. Repaso de Excel y preparación de gráficas MATERIALES: Los estudiantes formaran grupos de 4/ mesa. MATERIAL CANTIDAD Marcadores* 1 por estudiante * Micropipetas (1000, 200, 100, 10, 2 ul) 1 /mesa Puntas para micropipetas (1000,200 y 10) 1 caja de c/u por mesa Agua destilada 1 tanque por salón Colorante vegetal concentrado 1/mesa Vasos (Beakers) de 100 ml 2/mesa Microtubos no estériles de 1.5 ul 50/ mesa Alcohol 95 % 1 litro por salón Probetas de 100 ml 2/mesa Goteros 2/mesa Pipetas Pasteur con bulbos 2 por mesa Sal (NaCl) 100 gramos /salón Balanza (previamente calibradas) 4 Papel de pesada 1 caja Patos para pesar la sal 8 Papel parafina / tijera 1 rollo por salón Matraces de 100 ml con 100 ml solución con Colorante rojo 8 matraces (800 ml solución) Tubos con 5 ml de agua (rotular Pen/Str) 8 tubos ( 40 ml) Tubos con 10 ml solución amarilla (rotular FBS) 8 tubos ( 80 ml) 9

10 Pipetas de 10 ml/ con su pipeteador mecánico 20 Pipetas de 1 ml/con su pipeteador mecánico 50 Tubos de 10 ml 35 * Materiales a ser traídos por los estudiantes Ejercicio 1: Presición en tus medidas de volumen. Utilización de micropipetas: Luego de que el profesor dé una breve explicación sobre el manejo de las micropipetas realice el siguiente ejercicio: 1. Prepara en un beaker de 100 ml, una solución de tinte vegetal. Mezcla 100 ml de agua destilada y añádele algunas gotas de tinte vegetal para que coloree el agua. Esta solución será utilizadaza por todos los miembros de tu grupo. 2. Cada estudiante deberá rotular varios microtubos con los siguientes volúmenes: a ul = 1 ml b. 500 ul c. 250 ul d. 200 ul e. 100 ul f. 50 ul g. 10 ul h. 1 ul 3. Utilizando la micropipeta de 1000 para llenar con la solución de tinte los tubos a, b y c. 4. Utilizando la micropipeta de 200 para llenar el tubo d. 5. Utilizando la micropipeta de 100 llena los tubos e y f. 6. Utilizando la micropipeta de 10 llena el tubo g. 7. Utilizando la micropipeta de 2 llena el tubo h. 8. Compara el volumen de tus tubos con el de los tubos controles preparados por el profesor. De esta forma podrás estar seguro (a) de que utilizas bien este instrumento. Si alguna de tus medidas está mal tomada, hazla nuevamente. Ejercicio 2: Preparación de soluciones Ha realizar en grupo. Prepararás 100 ml de alcohol 70 % a partir de alcohol 95 %. Espacio para cómputos: 1. Con ayuda de tus compañeros realiza los cómputos necesarios para hacer esta solución. Confirma tus cálculos con el profesor. 2. Utiliza la probeta de 100 ml para hacer tu solución. Explica: 10

11 Ejercicio 3: Preparación de Soluciones Ha realizar por grupo: Prepara 100 ml de una solución de sal al 10 %. Espacio para cómputos: 1. Con ayuda de tus compañeros realiza los cómputos necesarios para hacer esta solución. Confirma tus cálculos con el profesor. 2. Utiliza la probeta de 100 ml para hacer tu solución. Explica: 11

12 Ejercicio 4: Preparación de medio de cultivo En este ejercicio simularemos la preparación de un medio de cultivo. Haremos esto ya que los materiales verdaderos son muy costosos y debemos manejarlos de forma estéril. Prepararás con tu grupo el medio de cultivo conocido como RPMI. Este medio deberá ser suplementado con 1% de Penicilina-Estreptomicina/antimicótico y con 10 % de FBS (suero fetal bovino). Materiales: ml del medio RPMI (matraces de 100 ml con solución colorante rojo) 2. Solución de 100 % de Penicilina /Estreptomicina/antimicótico (tubos de 5 ml solución transparente). 3. FBS puro (tubos con 10 ml solución amarilla) 4. Pipetas de 10 ml 5. micropipeta de 1000 ul 6. Parafina Realiza los cálculos para hacer 100 ml de RPMI, 1 % Pen / Strep y 10 % FBS. Confirma tus cómputos con el profesor. Cómputos: Explica como harás tu medio 12

13 Ejercicio 5: Diluciones en serie. A partir del medio RPMI que preparaste, prepara diluciones 1/10, 1/100, 1/1000 y 1/10,000. Utiliza 4 tubos, 1 pipeta de 10 ml y 4 pipetas de 1 ml (o 4 puntas azules y la micropipeta de 1000 ul), 40 ml de agua destilada y por supuesto tu stock del medio RPMI. Explica como harás las diluciones de tu medio. Puedes hacer un diagrama. Consulta tu racionamiento con tu profesor. Ejercicio 6: Preparación de una solución x molar. a. Eres un biólogo y trabajas en cultivo de células. Suponte que tienes que preparar una solución de la droga Nx a una concentración de 1 (molar) M. El peso molecular (PM) de Nx es de Quieres preparar 10 ml totales. Explica cómo lo harías. Recuerda que : 1M = PM/1 litro. b. Cómo prepararías 10 ml de un stock 10-3 M (mm) de la misma droga (Nx). PM=363.8 Recuerda que 1 gramo = 1000 mg. 13

14 Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamón Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas Laboratorio de Destrezas III Autor: Dra. Ana María Lugo Técnicas para el establecimiento de Cultivos Celulares: Técnicas asépticas y preparación medios de cultivo Propósito: El propósito de esta experiencia de laboratorio es que el estudiante: 1. Se familiarice con las técnicas de cultivo de células eucarióticas 2. Conozca el manejo de animales de laboratorio en especial ratones 3. Conozca las principales técnicas asépticas 4. Prepare medios de cultivo suplementados con suero y antibióticos/antimicótico 5. Aprenda a lavar células por centrifugación 6. Conozca como contar células utilizando el hemocitómetro 7. Siembre e incube células eucarióticas 8. Conozca los equipos y cuidados de trabajar en un cuarto de cultivo 9. Se familiarize con equipo tales como: extractores laminales de cultivo ( laminal flood hood, incubadoras de CO2, centrífugas refrigeradas, baños para mantener temperatura constante, filtros para medios Nalgene, hemocitómetros, micropipetas, contadores de células, pipetiadores automáticos. Parte 1: Extracción de las células Materiales/Equipo Para grupos de 4 estudiantes Alcohol 70 % en botellas de lavado 1 botella/mesa Lancetas/gasas con alcohol 1/mesa Tubo de 15 ml estéril 1/mesa PBS 1X frío en hielo 200 ml Pipetas estériles de 10 ml 1paquete/salón Pipeteador automático instalado en hood 1 Hood de cultivo 1 14

15 Guantes *** Marcadores negros *** Caja para descartar lancetas usadas 1/salón *** Materiales traídos por los estudiantes Procedimiento 1. Prender el Hood. 2. Lavar el Hood con alcohol 70 %. Lavar todo lo que entra al Hood inclusive las manos. 3. Filtrar el PBS 1X utilizando un filtro Nalgene para esterilizar la solución. 4. Llenar con 10 ml de PBS 1X frío los tubos de 15 ml estériles. 5. Un estudiante voluntario por mesa se sacará sangre del dedo y la echará dentro del tubo de 10 ml de PBS. Deberá obtener aproximadamente 0.1cc de sangre/tubo (100 ul= 5-8 gotas Parte 2: Lavados de las células Materiales/Equipo Beakers de 400 ml Micropipetas de 1000 ml y 200 ml Puntas de micropipetas estériles (1000 y 200) Centrífuga refrigerada a 4 grados C, 1000 rpm (usaremos la del cuarto de cultivo) Para grupos de 4 estudiantes 1/mesa 1 de cada/mesa 1 caja de cada/salón 1/salón Procedimiento 1. Una vez obtenida la sangre y resuspendida en los 10 ml de PBS 1X estéril, se centrifugará a 100 rpm por 10 min. a 4 grados C de temperatura. 2. Se descartará el sobrenadante dentro del hood en los beakers de 400 ml provistos para esto. Tener cuidado de no perder el pellet. Lo mejor es remover el sobrenadante con una pipeta estéril. 3. Se resuspenderá el pellet en 10 ml de PBS estéril frío y se volverá a centrifugar como antes. 4. Al finalizar este lavado se resuspenderá la sangre en el medio de cultivo RPMI suplementado con penicilina y estreptomicina y antimicótico. 5. En lo que se centrifuga (10 min.)se hará el medio de cultivo uno por salón. 15

16 Parte 3: Preparación del medio de cultivo Materiales/Equipo Por salón RPMI medium 500 ml FBS (suero fetal bovino) 50 ml Penicilina/Streptomicina/antimicótico 10 ml Filtros de 0.2 um/ 500 ml 1 Baño a 37 grados C (preparado previamente) 1/salón Pipeta de 25 ml estéril 1 Procedimiento 1. Hacer 500 ml de RPMI al 10% de FBS y al 1% de pen/strep 2. Consulta tus cómputos con el profesor 3. Esterilizar el medio utilizando un filtro Nalgene 0.2 um de 500 ml Cálculos: Parte 4: Sembrar células Materiales/Equipo Por mesa Hemocitómetros 1/mesa Papel de lente 1 paquete/salón Kimwipes pequeños 1 caja/salón Microscopios Compuestos 8 Microtubos 2/mesa Calculadoras *** Tubos de 50 ml estériles 1 paquete/salón Placas estériles de 24 pozos 1/mesa *** Materiales traídos por los estudiantes 16

17 Procedimiento 1. Preparar una dilución de 1/10 de la sangre. Para esto toma 40 ul de la sangre y 360 ul de medio de cultivo RPMI y mézclalos dentro de un microtubo estéril. Puedes pipetear suavemente con la micropipeta de Prepara una dilución de 1/100 de tu sangre. Para esto haz una dilución de 1/10 de la dilución anterior. Es decir estas realizando diluciones en serie. 3. Consulta tu procedimiento con el profesor. 4. Prepara el hemocitómetro. Limpia con alcohol y móntale el cubreobjeto. OJO de no perder el mismo pues es muy delicado y caro. 5. Llena uno de los lados del hemocitómetro con la dilución de 1/100 que preparaste. 6. Cuenta en el hemocitómetro las células que están en los 4 cuadrantes. 7. Determinar el # de células por ml que tienes en el tubo original de sangre. #de células contadas/4 (10 dilución ) (10 4 ) = # células / ml Si la dilución es 1/100 el exponente será Sembrar 1.5 x 10 4 células por pozo. En cada pozo deberás colocar un volumen total de 1 ml. Sembrarás 10 pozos de la placa de 24 pozos totales. Determinar cuantas células totales necesitas para tu cultivo. #cel x # pozos= Cuanto volumen total necesitas para tu cultivo. # pozos x volumen en ml/ pozo= Determina cuanto del tubo original necesitas tomar donde tengas el # total de células para tu cultivo 17

18 La mezcla que necesitas hacer para tu cultivo será de: ml del tubo con sangre + ml de RPMI 9. Luego de hacer la mezcla deposita en cada pozo las células a sembrar. 10. Visita el cuarto de cultivo para que las coloques en la incubadora de CO2 a 36 grados. 11. Deberás apagar y recoger todo. Deberás lavar el HOOD con alcohol antes de irte. NOTAS al Técnico del Laboratorio: 1. Preparar con anticipación un baño a 37 grados C. La temperatura debe ser constante. 2. Prender el hood con 30 min. de anticipación. 3. Prender con anticipación ( 30 min.) la centrífuga refrigerada del cuarto de cultivo a 4 grados C. 4. Preparar una bomba de succión para poder realizar la filtración del medio de cultivo dentro del hood. 18

19 Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamón Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas Fraccionamiento Celular Introducción La fraccionación celular es utilizada por los biólogos celulares para investigar la bioquímica y fisiología de organelos celulares sin el complejo ambiente de una célula intacta. Esta metodología se desarrolló en el 1930 por Bensley y Hoerr cuando aislaron mitocondrias y por Granick al aislar cloroplastos. En general el método consiste en romper la membrana plasmática para liberar el contenido total de la célula seguido por centrifugaciones diferenciales para separar los diferentes organelos. La observación por el microscopio compuesto de la fracción se utiliza para confirmar su pureza. El propósito principal de este proyecto es el que los estudiantes aislen cloroplastos, núcleos y mitocóndrias de tejido vegetal utilizando el método de fraccionación celular. HOMOGENIZACIÓN Para preparar los tejidos para el fraccionamiento celular, primero se debe suspender en un medio apropiado(una solución amortiguadora, salina ó azúcar isotónica). Para mantener la integridad de los organelos y enzimas durante el procedimiento de la fraccionación, todas las soluciones y cristalería debe mantenerse frías. Después de rebanar las hojas, el tejido está preparado para la homogenización, procedimiento que rompe los enlaces celulares y libera el contenido celular, sin dañar el medio en suspensión. La suspensión de células constituyentes se llama homogenado. Para los tejidos de plantas, la homogenización se debe realizar con un mortero(fig.1), al cual se le añade arena como abrasivo. En este proyecto los cloroplastos se aislarán de la espinaca; núcleos y mitocondria se aislarán de la coliflor. CENTRIFUGACION Debido a las diferencias en tamaño y densidad, cada componente celular está sujeto a una fuerza centrífuga. La fuerza generada por la centrífuga se expresa como fuerza centrífuga relativa(rcf)en unidades de g. La RCF es una función de velocidad de centrifugación en revoluciones por minutos (rpm) y la distancia de partículas desde el eje de rotación. Conociendo esta distancia (x) y el (rpm), se puede determinar el RCF de la ecuación : RCF = 1.19 x 10-5 (rpm)2x, donde x se toma como la distancia (en cm) desde el eje de rotación hasta el margen de afuera del tubo de centrífuga. CENTRIFUGACION DIFERENCIAL En la centrifugación diferencial, el homogenado es centrifugado repetidas veces a altas velocidades,sedimentándolo progresivamente en pequeñas partículas. El método está ilustrado en la fig. 2. La primera centrifugación es a 600g por 10 minutos, el cual sedimenta la fracción nuclear. Este pellet contiene el núcleo, células intactas y tejido.. L próxima separación es el sobrenadante postnuclear ó partículas suspendidas en líquido sobre el pellet nuclear, el cual es tranferido a 19

20 otro tubo de centrífuga y se centrífuga a 10,000 g por 30 minutos en una centrífuga refrigerada. El material sedimentado se conoce como fracción mitocondrial ; éste contiene mitocondria y micro cuerpos. Los cloroplastos de las células de espinaca se aislarán utilizando el método modificado de F.R Whatley y D.I.Arnon (1962). La espinaca se homogeniza en un amortiguador de sal. Después que el tejido de la planta se macera en un mortero, el homogenado se filtra a través de una gaza para remover los pedazos grandes de tejidos. El filtrado es centrifugado a 200 g por 1 minuto. El sobrenadante se centrífuga a 1300 g por 5 minutos, sedimentando los clorosplastos. La fracción nuclear y mitocondrial de las células de las células de la coliflor se obtendrán utilizando una centrifugación diferencial escrita por W.D. Bonner (1967). El tejido se homogeniza en una solución amortiguadora de mannitol. Después se la filtración a través de una gaza, el homogenado es centrifugado como se ilustra en la fig. 2, paso 3. EXAMINACION MICROSCÓPICA Todas la s fracciones aisladas se examinarán microscópicamente para identificar los organelos presentes. Cloroplastos. Los cloroplastos son relativamente órganelos grandes, por lo tanto, se algunos detalles internos se observan con el microscopio de luz. Luego de examinar la morfología normal de los cloroplastos de la espinaca, se estudiarán los efectos de dos compuestos orgánicos. Los cloroplastos serán tratados con una solución saturada de urea y una solución acuosa de Triton X-100, el cual es un detergente fuerte. Urea es conocida para desnaturalizar proteínas, alguna de las cuales salen de la membrana de los cloroplastos. 20

21 Núcleo. Para la observación de los núcleos se debe realizar una tinción. El tinte a utilizar será lacto-aceto-orcein, el cual tiñe de rojo la cromatina. Cada nucleolo aparece como un área prominente, redonda y clara. Mitocondria. Las mitocondrias son teñidas con el tinte Janus green B. Después de la tinción, la mitocondria tiñe azul-verdosa, la cual es el color del tinte en su forma oxidada; en su forma reducida, el tinte es incoloro. El Janus green se mantiene en estado oxidado por el sistema de oxidasa citocromo de la mitocondria. Equipo y materiales: Cantidad Balanza 2 por salón Hojas de Espinacas frescas (no de lata) 1 paqte/grupo Navajas o bisturis 8 Amortiguador Tris-NaCl frío 300 ml Arena 100 g Morteros 8 Gasa para filtrar 30 Tubos de centrífuga de 15 ml 10 Tubos de centrífuga de 50 ml 20 Reglas milimetradas 8 Probetas de 10 ml 10 Pipetas de 10 ml/pipeteadores 10 Pipetas Pasteur 10 Parafina en pedazos 20 Bano con hielo 8 Microscopios compuestos con vernier par medir 8 Laminillas y cubreobjetos 1 caja Goteros 8 Aceite de inmersión 8 Papel de lente 1 Solución de Urea 10 ml Solución de Triton X-100 2% 10 ml Coliflor 1pqte Medio mannitol frio 500 ml espátulas 10 tubos de ensayo 10 tinte nuclear lacto-aceto-orcein papael secante Tinte verde Janus PROCEDIMIENTO: DETERMINACIÓN DE LAS VELOCIDADES DE CENTRIFUGACION REQUERIDAS PARA EL AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS 1. Mide el radio del rotor ( la distancia en centímetros desde el centro del rotor hasta el extremo inferior de un tubo de centrífuga colocado horizontalmente). Anote este dato en la tabla de la pág

22 1. Calcula las rpm requeridas para cada una de las centrifugaciones (200g y 1300g) para obtener una fracción conteniendo cloroplastos, usando la fórmula RCF= x 10-2 (rpm) 26 x. Anote los datos en la tabla de la página Usando los datos obtenidos en el paso anterior ajusta el tacómetro en la centrífuga con el propósito e obtener los rpm requeridos equivalentes a 200 g y a 1,300 g. II. AISLAMIENTO DE LA FRACCION DE CLOROPLASTOS Pese 4 g de hojas frescas de espinaca, a las cuales se les removieron las venacentrales. 1. Corte las hojas en pequeños pedazos y colóquelas en un mortero frío. 2. Añada 15 ml de la solución amortiguadora de Tris-NaCl fría y arena purificada. Macere el tejido por 2 minutos. 3. Filtre la suspensión a través de varias capas de gaza a un tubo de centrífuga de 15 ml frío. 4. Centrifuge el líquido filtrado a 200 g por 1 minuto. Verifique que los tubos de centrífuga estén balanceados. 5. Decante el sobre nadante a un tubo frío y centrifuge a 1300 g por 5 minutos. 6. Después de la centrifugación, mida las distancias A y B (Fig. 10.3). A es la distancia en centímetros desde el extremo inferior del tubo de centrífuga al tope del pellet. Anote los datos en la página 125; éstos se utilizarán para calcular el Coeficiente de Sedimentación. 7. Decante y descarte el sobre nadante y usando una probeta, añsda 10 ml de la solución amortiguadora fría de Tris-NaCl al pellet que quedó en el tubo de centrífuga. Resuspenda el pellet con una pipeta Pasteur. 8. Tape el tubo de centrífuga, e invierta el mismo para mezclar su contenido. Colocar en hielo. III. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LA FRACCION DE CLOROPLASTOS 1. Con una pipeta Pasteur remueva una gota de la suspensión de cloroplastos y lleve a cabo una preparación húmeda wet mount. Use una pequeña gota de modo que no tenga que ejercer presión sobre el cubreobjetos, dañando los cloroplastos. 2. Examine los cloroplastos bajo el objetivo de alta potencia y luego y luego bajo el objetivo de inmersión en aceite. 3. Mida el largo de y el ancho de 5 cloroplastos. Anote los datos en la página Observa la morfología de varios cloroplastos. Identifica los cloroplastos que tengan una morfología interna poco homogénea y contesta las preguntas de las página En el espacio provista en la página 1, represente con un diagrama los cloroplastos que muestren detalles internos e identifique sus estructuras. IV. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LOS CLOROPLASTOS TRATADOS CON UREA 22

23 1. Coloque una pequeña gota de la suspensión de cloroplastos en una laminilla limpia. Añada una gota de la solución de urea saturada y coloque un cubreobjetos. Cuidado de no presionar el cubreobjetos. 2. Examine los cloroplastos bajo el objetivo de alta potencia y el de inmersión de aceite por 5 minutos y conteste las preguntas de la página Dibuje los cloroplastos que presenten una morfología alterada. V. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LOS CLOROPLASTOS TRATADOS CON TRITON 1. Prepare un montaje húmedo usando una pequeña gota de la suspensión de cloroplastos y una gota de solución de Triton X-100 al 2%. 2. Examine la preparación bajo el objetivo de alta potencia y el de inmersión de aceite y conteste las preguntas de la página 12. VII. DETERMINACIÓN DEL COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN 1. Determine el coeficiente de sedimentación para los cloroplastos que inicialmente estaban en la parte superior de la suspensión y luego de la centrifugación se movieron al tope de l pellet. Para determinar S, calcule la distancias X1 y X2. Como de se demuestra en la fig. 10.3; X1= radio del rotor- A; y X2= radio del rotor-b. Anote los valores para X1 y X2 en la tabla de la pág Anote los valores para rpm y (t2-t1) (en segundos). Calcule S usando la ecuación : S= 210 log(x2/x1) (rpm)2 (t2-t1) VIII. AISLAMIENTO DE FRACCIONES CELULARES Y MITOCONDRIALES 2. Remueva 20 g de la parte externa del coliflor con un escalpelo. 3. Coloque el tejido en un mortero frío con 40 ml de medio de maceración de Mannitol (Mannitol grinding medium) y 5 g de arena purificada. Macérelos tejidos por 4 minutos. 4. Filtre la suspensión a través de 4 capas de gaza a un tubo de centrífuga. Deje reposar el tubo por 2 minutos. 5. Decante cuidadosamente el sobre nadante a un tubo y centrifuge a 600 g por 10 min. a 0-4 C. 6. Decante el sobre nadante post nuclear a un tubo de centrífuga y coloque el pellet nuclear en un baño de hielo. 7. Centrifuge el sobre nadante post nuclear a 10,000 g por 30 min a 0-4 C. Durante la centrifugación examine microscópicamente. 23

24 8. Decante y descarte el sobre nadante post mitocondrial y añada 5 ml del medio e mannitol frío al pellet mitocondrial. 9. Con una espátula remueva el pellet mitocondrial de las paredes del tubo de centrífuga y luego con una pipeta Pasteur, resuspéndalo en el medio de mannitol. 10. Transfiera la suspensión mitocondrial a un tubo de ensayo y colóquelo en un baño de hielo. IX. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LA FRACCION NUCLEAR 1. Con una espátula remueva una pequeña cantidad del pellet nuclear y aplíquelo en una laminilla. Añada varias gotas del tinte para núcleo lacto-aceto-orceina. Luego de 15 seg, añada un cubreobjetos y remueva usando un poco de presión el exceso de tinte con papel toalla. 2. Examine la preparación bajo el objetivo de alta potencia usando un filtro verde. Luego de identificar los núcleos, utilice el objetivo de inmersión en aceite. Mida sus diámetros y anótelos en el espacio provisto en la pág Represente con un diagrama los núcleos observados e identifique los nucleólos. X. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LA FRACCION MITOCONDRIAL 1. Coloque 5 gotas de la suspensión mitocondrial en un tubo pequeño. Añada 5 gotas del tinte verde Janus (Janus green stain), agite y espere 10 minutos. 2. Coloque una gota de la mezcla en una laminilla limpia y observe bajo el objetiva de alta potencia y el de inmersión en aceite del microscopio. Identifique las mitocondrias. 3. Mida el largo y ancho de 5 mitocondrias. Calcule la media de los valores. Anote los datos en la pág Observe la morfología de las mitocondrias y conteste las preguntas de la pág.13. Referencias: Bregman, Allyn. Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology. 3d Ed John Wiley & Sons, N.Y. 24

25 INCLUIR EN EL INFORME DE LABORATORIO Nombre Sección: Fecha: Ejercicios y Preguntas: DETERMINACIÓN DE VELOCIDADES DE CENTRIFUGACION REQUERIDA PARA AISLAR CLOROPLASTOS RCF Radio del Rotor(cm) rpm requerido 200 g 1300 g AISLAMIENTO DE LA FRACCION DE CLOROPLASTOS A= cm; B= cm DETERMINACIÓN DEL COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN x 1 x 2 rpm (t 2 - t 1 ) s S Compare el valor de S para el sedimento de cloroplastos en agua pura a 20 C, es el valor obtenidos de S en el amortiguador de Tris-NaCl un bajoestimado ó sobreesstimado? Explique 25

26 Nombre: Sección: Fecha: Observaciones y Preguntas: EXAMINACION MICROSCÓPICAS DE LA FRACCION DE CLOROPLASTOS Largo y ancho de los cloroplastos(µm) Cloroplasto Largo Ancho X= (µm) X= (µm) Cuál es la forma de un cloroplasto individual? Qué estructuras son visibles en los cloroplastos? EXAMINACION MICROSCÓPICAS DE LOS CLOROPLASTOS TRATADOS CON UREA Qué cambios morfológicos ocurren en los cloroplastos? En presencia de luz qué sabe usted de la acción de la urea, explique sus observaciones. EXAMINACION MICROSCÓPICAS DE LOS CLOROPLASTOS TRATADOS CON UREA Qué cambios morfológicos ocurren en los cloroplastos? 26

27 En presencia de luz qué sabe usted de la acción de Triton X-100, explique sus observaciones. EXAMINACION MICROSCÓPICAS DE LA FRACCION NUCLEAR Diámetro nuclear (µm) Ejercicios: Determinación de la velocidad centrifugada requerida para cloroplastos: RCF Rotor del radio en cm rpm requeridos 200 g 1300 g Isolación de los Cloroplastos: A = cm B = cm Observaciones y Preguntas: Examinació microscópica de la fraccionación de Cloroplastos: Cloroplastos Longitud Ancho X = um X = um Cómo es la forma de cada cloroplasto? Qué estructuras son visibles dentro de los cloroplastos? Microscopía de fracción nuclear: Diametros (um) 27

28 Nécleos Longitud Ancho X = um X = um Fracción Mitocondrial: Mitocondrias Longitud X = um Todas las mitocondrias tienen la misma forma? Describe su morfología. Preguntas: 1. Cuál alcohol daña membrana vegetal la remolacha a menor concentración? 2. Cuál de los 3 alcoholes afecta más la membrana? 3. Cuál es la relación entre el tamaño de la molécula de alcohol y el daño a la membrana? Realice una hipótesis al respecto. Referencias: 28

29 Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamón Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas TRANSFORMACIÓN BACTERIANA (Bacterial Transformation Kit- BIO-RAD) En este laboratorio se realizará una transformación genética. Un gen es un pedazo de DNA el cual provee las instrucciones para hacer (o codifica para) una proteína. Esta proteína le da a un organismo una característica particular. La transformación genética ocurre cuando una célula incorpora dentro de ella y expresa un nuevo pedazo de material genético ( DNA). Esta nueva información genética muchas veces provee al organismo de una nueva característica que se puede identificar luego de ocurrida la transformación Transformación genética literalmente significa cambio causado por genes e involucra la inserción de uno o más genes en el organismo en orden de cambiar las características del organismo. La transformación genética es utilizada en muchas áreas de la biotecnología. En la agricultura genes que codifican para características como la resistencia en contra de descomposición, congelación y alimañas pueden ser transformadas genéticamente en las plantas. En la biorremediación, bacterias pueden ser genéticamente transformadas con genes que le permiten digerir derrames de petróleo. En la medicina, enfermedades causadas por genes defectuosos se están empezando a tratar con terapia genética; en otras palabras se transforma genéticamente la célula de una persona enferma con copia sana del gene defectuoso que causa la enfermedad. Los genes pueden ser sacados del genoma humano, animal o vegetal y puestos dentro de una bacteria. Por ejemplo, la hormona insulina humana es producida ahora por bacterias, purificada y vendida en nuestras farmacias para el tratamiento de la diabetes ya que en los pacientes con esta enfermedad sus genes no funcionan normalmente. En este laboratorio se utilizará un procedimiento que transformará la bacteria E. coli con un gene que codifica para una proteína fluorescente de color verde (GFP). Este gene ha sido extraído de una medusa o agua viva que es fluorescente y bioluminiscente, su nombre: Aequorea victoria. La proteína fluorescente verdosa causa que la medusa florezca y brille en la oscuridad. Seguido del proceso de transformación, la bacteria expresa el gene de medusa adquirido y produce la proteína fluorescente, la cual causa que la colonia brille de un verde brillante bajo la luz ultravioleta. En esta actividad usted aprenderá el proceso de mover un gene de un organismo a otro con la ayuda de un plasmido. Las bacteria demás de poseer un cromosoma grande, comúnmente poseen pequeños pedazos circulares de DNA llamados plásmidos (uno o mas de estos). El ADN del plasmido usualmente contiene genes para una o mas características que pueden ser beneficiosa para la sobre vivencia de la bacteria. En la naturaleza las bacterias pueden transferir plasmidos entre ellas permitiendo así compartir genes beneficiosos. Este mecanismo en la naturaleza le permite a las bacterias adaptarse a nuevos ambientes. En este ejercicio usted utilizara el plasmidio pglo que contiene el gene para hacer la GFP. Usted introducirá el pglo a la bacteria E coli. Osea realizará una transformación bacterial. 29

30 Los plasmidos pglo únicos de Bio-Rad contienen además un gene de resistencia al antibiótico ampicilina (amp). El pglo también incorpora un sistema especial de regulación genética. Este sistema puede ser usado para el control de la expresión de la proteína fluorescente en células transformadas. El gene para GFP puede ser activado o prendido en células transformadas al añadir el azúcar arabinosa al medio de cultivo donde crecen las células. Luego de realizar la transformación se crecen las células en medio LB y en presencia de ampicilina. La ampicilina evita que bacterias no transformadas crezcan en el plato de cultivo. Las colonias de células transformadas aparecen de color blanco en los platos que contienen medio LB y ampicilina. Para inducir la expresión del gene de GFP tenemos que crecer las bacterias en presencia de arabinosa. Las bacterias crecidas en LB con arabinosa y con ampicilina se verán fluorescentes de color verde en lugar de blancas. Procedimiento: 1. Identifique un micro tubo con +DNA y otro con DNA. Anote sus iniciales. Coloque los micro tubos en el estante de foam. 2. Abra los tubos y utilizando una pipeta de transferencia estéril, añada 250 µl de la solución de transformación (CaCl2). 3. Coloque los tubos en hielo. 4. Con un loop estéril tome una colonia aislada del plato que contiene el cultivo bacteriano. Colóquelo en el micro tubo rotulado +DNA, verifique que la colonia se disperse en la solución de transformación. Coloque el tubo nuevamente en el hielo. Repita este procedimiento con el tubo rotulado DNA. 5. Observe la solución del DNA pglo bajo la luz ultravioleta. Anote sus observaciones. Sumerja un loop estéril en el tubo con el plasmido, observe que tenga solución y mezcle en el tubo rotulado +DNA. Cierre el tubo y coloque nuevamente en hielo. No añada el plasmido al tubo rotulado DNA. 6. Incube los tubos en hielo por 10 minutos 7. Mientras los tubos estan en el hielo; rotule los platos de agar en la parte inferior,no como se muestra en la figura. 8. Realice el choque de calor. Usando la gradilla de foam transfiera ambos tubos en el baño de agua ajustado a 42 C, por exactamente 50 segundos. Asegurése que todos los tubos estén sumergidos en el agua. Cuando pase el tiempo requerido, coloque los tubos en hielo. Para mejores resultados el cambio el cambio de hielo (0 C) a 42 C y luego colocarlo en hielo debe ser rápido. Incube los tubos en hielo por 2 minutos. 9. Remueva la gradilla que contiene los tubos del hielo. Usando una pipeta estéril, añada 250 µl del caldo LB en cada tubo y ciérrelo. Repita lo mismo con el otro tubo e incube ambos tubos por 10 minutos a temperatura ambiente. 30

31 10. Tape los tubos y mezcle. Usando una pipeta nueva, transfiera 100 µl de las suspensiones de transformación y el control. 11. Utilice una pipeta estéril para cada plato. Esparza cada superficie de los platos. 12. Invierta los platos y cúbralos con cinta adhesiva. Rotule con su nombre y coloque en la incubadora a 37 C hasta el próximo día. 13. Favor de limpiar las mesas con lisol y recoger todo material en el carrito de la técnica. 31

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33 Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamón Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas PURIFICACION DE LA PROTEINA GFP UTILIZANDO CROMATOGRAFIA DE COLUMNA (Green Fluorescent Purification Protein Kit-BIO-RAD) En este ejercicio de laboratorio los estudiantes utilizarán la bacteria transformada con el plasmido en el ejercicio anterior. La bacteria transformada, la cual produce una proteína verde flouescente, es purificada de contaminates bacterial utilizado una columna de cromatografía. La purificación de la proteína lleva varios pasos: Inoculación: Crecimiento de cultivo bacterial Fase 1 de Purificación: Concentración y Lísis bacterial Fase 2 de Purificación: Remoción del debris bacterial Fase 3 de Purificación: Cromatografía de Proteína Aislamiento de colonias puras: En esta actividad los estudiantes tomarán una colonia blanca del plato rotulado LB/amp y una colonia verde del plato LB/amp/ara para su aislamiento en medio de cultivo líquido. El gen de la proteína fluorescente requiere una temperatura de incubación de 32 C para mantener la fluorescencia. Concentración y lísis bacterial: La centrifugación es una técnica que se utiliza para separar moléculas en base a su tamaño con al alta velocidad. La lisozima se utilizará para degradar la célula de la pared bacterial. Cromatografía de Proteínas: La cromatografía es una técnica utilizada para separar proteínas en una mezcla compleja. Las bacterias contienen miles de proteínas de la cual la proteína GFP puede ser separada. 33

34 Parte 1: Crecimiento del cultivo bacterial 1. Remueve los platos de transformación del incubador y examínalas utilizando luz ultravioleta. Identique las colonias verdes en el plato LB/amp/ara. Identifica bastante colonias del plato LB/amp. 2. Prepare dos tubos de cultivo que contengan el medio cultivo LB/amp/ara. Rotule uno de los tubos como + y el otro -. Utilizando un asa estéril, levemente toca el asa para la colonia verde y sumérjalo en el tubo +. Usando una nueva asa estéril, repita lo mismo para la colonia blanca y sumérgelo en el tubo - (es importante que sólo selecciones una colonia). Dale vueltas al asa para dispersar la colonia completa. 3. Tape los tubos y póngalos en una incubadora de agitación o una plataforma de agitación y cultivarlos toda la noche a 32ºC o 2 días a temperatura ambiente. 4. Tape los tubos y agítalos vigorosamente con la mano. Colócalo en el incubador de forma horizontal a 32ºC por horas. Remueve y agite a mano periódicamente cuando sea posible. 34

35 Parte 2: Concentración bacterial 1. Identifique un microtubo como + con tu nombre y curso. Remueve el cultivo líquido del agitador y observe con luz UV. Note los cambios en color entre los dos cultivos. Usando una pipeta nueva, trasfiera 2 ml del cultivo líquido + dentro del microtubo +. Déle vueltas al microtubo por 5 minutos en la centrífuga a velocidad máxima. La pipeta usada en este paso se puede enjuagar varias veces en un beaker de agua y utilizado para los siguientes pasos de este periodo de laboratorio. 2. Vierta fuera del supernatante y observe el pelotilla (pellet) bajo luz UV. 3. Utilizando una pipeta, añada 250µl de la solución TE al tubo. Resuspenda la pelotilla del fondo pipeteando rápidamente para arriba y para abajo varias veces. 4. Usando una pipeta, añada 1 gota de lisosoma a la pelotilla bacterial resuspendida para iniciar digestión enzimático de la pared celular bacterial. Mezcle los contenidos agitando el tubo. Observe el tubo bajo luz UV. 5. Coloque el microtubo en el congelador hasta el próximo periodo de laboratorio. El congelamiento ocasiona la ruptura de la bacteria por completo. 35

36 PARTE III: Lísis Bacterial: 1. Remueva el microtubo del congelador y descongele usando el caliente de la mano. Coloque el tubo en la centrífuga y centrifuge por 10 minutos a velocidad máxima. 2. Mientras el tubo se mantiene girando, prepare la columna de cromatografía. Remueva la tapa y abra el broche de presión al fondo de la columna de HIC. Permita que todo el líquido drene por la columna ( 3-5 minutos). 3. Prepare la columna añadiendo 2 ml de Buffer Equilibration en la columna, añadiendo dos alícuotas de 1 ml con una pipeta. Drene el buffer hasta la marca de 1 ml de la columna. Tape arriba y abajo y almacene la columna a temperatura ambiente hasta el próximo período de laboratorio. 4. Centrifuge por 10 minutos. Examine el tubo con luz UV. Utilizando una pipeta transfiera 250 µl del supernatante + dentro de un microtubo nuevo nombrado Utilizando una pipeta nueva, transfiera 250 µl del buffer de almacenado intermediario obligatorio (binding buffer) al supernatante +. Coloca el tubo en el refrigerador hasta el próximo período de laboratorio. 36

37 PARTE IV Cromatografía: 1. Rotule 3 tubos (1-3) y colóquelos en una gradilla de foam. Remueva las tapas de arriba y debajo de la columna y ponga la columna en el tubo #1. Cuando lo último del buffer haya llegado a alcanzar la superficie del matriz HIC, proceda al próximo paso #2. 2. Utilizando una pipeta, cuidadosamente cargue 250 µl del supernatante + por la parte superior de la columna. Aguante la punta de la pipeta en una de las paredes de la columna, justo arriba de la superficie del matriz y permita que el supernatante baje por el lado de la pared de columna. Examine la columna usando la luz UV. Anote sus observaciones. Después que termine de drenar, transfiera la columna al tubo #2. 3. Utilizando una pipeta, añada 250 µl del buffer limpiador y permita que el volumen completo fluya por la columna. Examine la columna con luz UV. Anote sus observaciones. Después de que termine de drenar, transfiérelo al tubo #3. 4. Utilizando una pipeta, añada 750 µl del Buffer TE y permita que el volumen entero fluya por la columna. Examine la columna utilizando luz UV. Anote sus observaciones. 5. Examine los tres tubos y anote cualquier diferencia en color entre los tubos. 37

38 Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamón Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas Electroforesis de Proteínas (Protein Fingerprinting Kit-BIO-RAD) La biología molecular a descubierto secretos de nuevas enfermedades, dandonos las herramientas para la definición de la identidad biológica.proteomics es el estudio de las proteínas, particularmente su estructura y función.este término es analogo al genoma por lo que es mas complicado.el proteome difiere de célula e célula y esta cambiando constantemente a través de las interacciones bioquímicas con el genoma y el ambiente.en la evolución de este tema el descubrimiento de la estructura química del DNA nos ha dado el entendimiento de como el codigo de las bases nitrogenadas permite la síntesis de proteínas.el dogma central de la biología molecular ( DNA- RNA- Proteína) nos da la explicación de como la información codificada por nuestro DNA es traducida y utilizada para hacer un organismo. Proteomics fue inicialmente definido como el esfuerzo por catalogar todas las proteínas expresadas en todas las células en todas las etapas del desarrollo.esta definición ha sido expandida al incluir el estudio de las funciones de las proteínas, las interacciones entre las proteínas, la localización celular, los niveles de expresión y las modificaciones post transcripsionales estas incluyen editar el RNA, síntesis y degradación de mrna, degradación de proteínas, interacciones entre proteínas, glucosilación y fosforilación. En este ejercicio los estudiantes realizarán una de las técnicas utilizada en las investigaciones de biotecnología, la electroforesis de proteínas. Utilizando la electroforesis para examinar las proteínas de las especies de pescados, los estudiantes identificaran las diferencias y similitudes entre ellos. En términos de masa, el tejido muscular consiste principalmente de dos proteínas: actina y miosina. Mientras que la actinia y miosina son altamente a través de todas las especies animales, la examinación de proteínas de otros músculos revelan variaciones entre especies relacionadas muy cercanas. El propósito de este ejercicio es guiar a los estudiantes a través del proceso de investigación científica en el laboratorio. Los estudiantes se preguntarán: Puede la evidencia molecular ser utilizada para determinar diferencias y similitudes entre las especies? En su análisis, los estudiantes compararan similitudes y diferencias entre las proteínas de los peces y su árbol genealógico. Utilice la siguiente figura para escoger el tipo de pescado a analizar. Se recomienda seleccionar algunos que estén estrechamente relacionados, como el salmón y la trucha, como también los que están distantes como el tiburón y el atún. 38

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41 Procedimiento 1. Monte la cámara de electroforesis. 2. Rotule cada microtubo donde colocará las muestras de los pescados. 3. Añada 250µL del Laemmli sample buffer a cada microtubo. 4. Corte un pequeño pedazo del músculo del pescado, cerca de 0.25 x 0.25 cm 3 y transfiera cada pedazo en un microtubo y ciérrelo. 5. Golpee el microtubo 15 veces para agitar el tejido en el buffer. 6. Incube por 5 minutos a temperatura ambiente para extraer y solubilizar las proteínas. 7. Cuidadosamente transfiera el buffer en un microtubo con rosca. No transfiera el pedazo de pescado. 8. Obtenga los estándares pre-teñidos(ks) y la actina y miosina. 9. Caliente las muestras y los estándares de actina y miosina en tubos con rosca por 5 minutos a 95ºC. 41

42 Preparación de la GEL Running gel- la primera que se prepara Material Al 12 % Agua 2. 7 ml Resolving Buffer ml 30 % Poliacrilamida 3.2 ml 10% APS 80 µl TEMED 3 µl Stacking Gel capa de arriba Material Cantidad Agua 4. 6 ml 4 X stacking buffer ph ml 30 % acrilamida 1.3 ml 10 % APS fresco 68 µl TEMED 5 µl 10. Llene el tanque con el buffer de corrida. 11. Llene los carriles de la manera: Línea Volumen Muestra 1 & 2 vacío vacío 3 10 µl estándar (KS) 4 10 µl muestra µl muestra µl muestra µl muestra µl muestra µl estándar actina y miosina 10 vacío vacío 12. Prenda la cámara y deje correr por 30 minutos a 200V. 42

43 13. Luego de la corrida, saque la gel del tanque y transfiera a un envase que contenga 40 ml del tinte (Coomasie Blue) y tiña por 1 hora, con agitación para mejor resultado. 14. Descarte el tinte y destiña la gel con gran cantidad de agua por al menos 30 minutos. Las bandas se verán azules. 43

44 Extracción y electroforesis de DNA y PCR I. Parte teórica: Conocer la estructura del DNA, su replicación y función. Conocer las partes de un cromosoma. dominar los términos relacionados con el tema. Motivar e interesar a los estudiantes en el conocimiento de la genética haciéndola amena y menos abstracta. Visualizar la molécula de DNA. II. Parte práctica: Extracción de DNA en forma sencilla, usando cebollines, frutas, hígado detergentes, sal y alcohol. El objetivo: al finalizar esta actividad el estudian:te a. conoce la estructura y función de un cromosoma. b. entiende y conoce la estructura, replicación y función del DNA. c. domina y entiende el proceso de una de las técnicas mas sencillas de Extracción de DNA y de hacer visual la molécula. Entiende conoce el proceso que se lleva a cabo en el laboratorio. Materiales y Procedimientos. Materiales: - 2 beaker (vasos de precipitado) de 250ml - 2 bolsas ziplot - hielo - 1 tubo de ensayo - 1 embudo - gasa - agitador de cristal (opcional) - HCL 0.1molar (opcional) fresas (cualquier fruta madura y que sea fácil de triturar - hielo - alcohol al 95% - solución desestabilizadora de enzimas: 900 de H20 :100 detergente + 2 cucharaditas de sal sin yodo. -1 hígado de pollo - 1cucharada de arena - papaína - 1 mortero Procedimiento: Extracción de DNA de frutas - Triturar las fresas - a 2 mililitros del triturado añadir 5ml de solución 44

45 - mezclar por inversión - filtrar y luego añadir alcohol frío al 90% o 70% Sobre Hielo mezclar - observar el precipitado. Extracción de DNA de hígado - coloque en el mortero el hígado y una cucharada de arena y la papaína - tritúrelo bien - añada 5 mililitros de solución desestabilizadora - triture de nuevo hasta cuando observe que se ha formado una pasta suave - filtre por varias veces - añada el doble del volumen de alcohol frío al % - mezclar - observe el precipitado Nota: este mismo protocolo se puede hace con cualquier fruta y con cebolla. Preguntas Cuál es la función del detergente? Por qué desestabiliza la membrana? Qué es una solución quelante? Cuál es la función del alcohol? Por qué se precipita el DNA? Por que se usa para el laboratorio el hígado y las fresas, para la extracción de DNA? 45

46 Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamón Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas Extracción del DNA Genómico Objetivos: 1. Valorar el proceso de la extracción de ácidos nucleicos en el estudio de la genética molecular. 2. Enumerar las aplicaciones en los diversos campos de la investigación científica contemporánea. 3. Explicar los pasos básicos en la extracción de DNA 4. Distinguir los procesos de purificación de DNA para los distintos tipo de células. 5. Practicar las destrezas básicas de biología molecular para aislar DNA genómico de bacteria. Materiales y Equipo: Enterobacter aerogenes cepa ATCC o ( American Type Culture Collection ml de caldo nutriente o de tripticasa de soya estéril Incubadora a 37 º C Definfectante Mechero Pipetas serólogicas con capacidad para 2 o 5 ml Micropipetas de µl Microcentrifuga Microtubos estériles Bolsas pequeñas de desperdicios biológicos Guantes Hielo Etanol absoluto frío Etanol 70 % frío NaCl 5M ( 70 µl por preparación) 1x- Tris EDTA ( TE) Cloroformo Amortiguador de extracción ( edvotex # catalogo 627) Solución de cloro al 10 % Frascos de cristal o envases de precipitado pequeños kimwipes Papel toalla Rnasa ( opcional) 46

47 Procedimiento: 1. El día antes del ejercicio se inocula la bacteria en 40 ml de caldo nutriente o de tripticasa de soya (TSA).Incubar a 37 º C overnight ( el cultivo no debe ser muy viejo) 2. Desinfectar el área de trabajo.colocar papel impregnado en desinfectante en el área donde se va a trabajar con el cultivo de bacterias. 3. Encender el mechero.regular la llama para que no sea mayor de tres pulgadas y sea de color azul. 4. Utilizando una pipeta serólogica desechable esterilizada, añadir 1. 5 ml de cultivo de bacterias a un microtubo y una centrifuga a máxima velocidad por 5 minutos. 5. Descartar el sobrenadante en un frasco que contenga solución de cloro. Utilizando una micropipeta con capacidad máxima de 100 µl, terminar de remover el sobrenadante.( el precipitado es pequeño, de color cremoso y contiene las bacterias de donde se obtendrá el DNA.Si no se tiene cuidado puede perderse al succionar con la micropipeta.por eso se recomienda inclinar el tubo y aspirar el sobrenadante colocando la punta de la micropipeta del lado contrario donde se encuentra el precipitado) 6. Añadir 200 µl de amortiguador de extracción.este amortiguador contiene detergentes para lisar las células y agente quelante para evitar que las Dnasas degraden el DNA.Mezclar utilizando la micropipeta.( Se debe bajar el pistón de la micropipeta antes de introducir la punta en el líquido dentro del tubo. Así evitar introducir burbujas y contaminantes que puedan estar presentes en lel cilindro de la micropipeta.) 7. Añadir 66 µl de sal.mezclar utilizando una micropipeta de 100 µl.evite la introducción de burbujas al mezclar.( Si se ha mezclado correctamente se observa una solución turbia pero uniforme) 8. Centrifugar a la velocidad máxima por 10 min. Para separar el DNA del debris celular.(asegure que el volumen total sea igual en todos los tubos, y que los tubos estén bien equilibrados antes de encender la centrífuga). 9. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio utilizando una micropipeta de 100 µl.es importante calcular el volumen del sobrenadante obtenido. Descartar el tubo que contiene el precipitado en una bolsa de desperdicios biológicos.( El siguiente paso debe realizarse dentro del hood.antes de continuar el procedimiento, se debe repasar las reglas de seguridad relacionada con cloroformo.debe tener la vestimenta de seguridad completa, incluyendo guantes y gafas de seguridad). 10. Una vez determinado el volumen de sobrenadante obtenido de la centrifugación, se debe añadir un volumen igual de cloroformo. 11. Mezclar 10 veces gentilmente y por inversión( no utilizar vortex) 12. Centrifugar a una máxima velocidad ( Al terminar la centrifugación, se deberan observar tres fases, 1- fase acuosa superior que contiene el 47

48 DNA, 2- interfase centro de la solución que contiene proteínas desnaturalizadas, 3- fase orgánica contiene lípidos). 13. Transferir la fase acuosa superior a un tubo limpio.utilizar la micropipeta de 100µl y determinar el volumen del sobrenadante obtenido. Comenzar a extraer la parte acuosa siempre con la punta tocando la superficie de esta. 14. Una vez determinado el volumen del sobrenadante obtenido de la fase acuosa en el paso anterior, se debe multiplicar por dos para calcular el volumen de etanol frío al 95%.Incubar en hielo por 30 min. Al añadir el alcohol se debe poder observar el DNA si se coloca el tubo a la altura de la vista. 15. Centrifugar a máxima velocidad por 10 min..descartar el sobrenadante en un frasco.abrir el tubo y descartar el contenido en un envase de precipitado. 16. Añadir 1 ml del alcohol 70% frío por cinco minutos e incubar por cinco minutos en hielo.centrifugar a máxima velocidad por 5 minutos.remover tanto el sobrenadante como se pueda evitando tocar el precipitado. 17. Abrir el tubo y decantar el contenido en un envase de precipitado. 18. Utilizar una micropipeta de 100 µl para extraer el exceso de alcohol.deja que seque al aire por 5 o 10 minutos.se puede colocar el tubo invertido sobre papel servilleta. 19. Observar el precipitado. 20. Resuspender el precipitado en 50 µl de agua destilada, agua deionizada o de amortiguador TE estéril( 1X Tris EDTA) 21. Añadir RNAsa 5 µl e incubar en baño de agua a 37ºC por 30 min.este paso es opcional, si se lleva a cabo no se observaran bandas correspondientes a RNA en la electróforesis de DNA. 48

49 Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamón PCR Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas El PCR ( polymerase chain reaction) transformó la biología molecular en una herramienta multidisciplinaria de busqueda.algunas técnicas de la biología molecular usadas antes de del PCR requerian una labor intensa, requeria mucho tiempo y un alto nivel de experiencia en la técnicaademás de trabajar con pequeñas cantidades de DNA era dificil para los investigadores en distintos campos biológicos( patología, botanica,zoología y farmacia etc) para incorporar la biología molecular a sus esquemas de investigación. El PCR ha tenido un impacto en cuatro áreas principales de Biotecnología: mapa de genes, clonación, secuenciación de DNA y detección de genes.el PCR es usado en estos momentos para diagnosticos medicos, como herramientas para la detección de mutaciones específicas que pueden causar enfermedades genéticas.en investigaciones criminales para identificar sospechosos en un nivel molecular y en la secuenciación del genoma humano. Antes de PCR el uso de las técnicas de la biología molecular para los propósitos de diagnóstico terapéuticos, forenses, farmacéuticos, o médicos no era práctico o rentable.el desarrollo de la tecnología del PCR ha cambiado varios aspectos de la biología molecular desde lo dificil de la ciencia hasta una de las herramientas mas usadas en la genética y la investigación medica. La amplificación del PCR requiere la presencia de al menos una hebra template de DNA.En este kit el DNA genomico humano es aislado de sus propias células y debe ser una hebra template.una de las principales razones por las que el PCR es una herramienta tan poderosa es por ser específica y simple.todo lo que requiere son buffers de reacción economicos, cuatro subunidades de DNA ( deoxinucleotido, trifosfato de adenina, guanina, timina y citosina), una DNA polimerasa, dos primers de DNA,una cantidad de la hebra templada que uno quiere amplificar.la especificación sale de la habilidad para llegar al blanco target y amplificar un segmento específico del DNA. El PCR hace uso de dos procesos básicos en la genética molecular. 1- Hibridación complementaria de una hebra de DNA. 2- Síntesis de una hebra vía la DNA polimerasa En el caso de PCR, la hebra complementaria de hibridación toma lugar cuando dos diferentes primers de oligonucleotido se alinea con cada una de sus respectivas pares de base de la secuencia templada.los dos primers están designados y sintetizados en el laboratorio con una secuencia específica de nucleótidos se pueden pegar a los terminales opuestos y a las hebras opuestas del estiramiento de la doble hebra del DNA a ser amplificado. 49

50 Antes de la región a ser amplificada, uno debe identificar y determinar la secuencia de una pieza de DNA a favor y en contra de la región de interés. Estas áreas son luego usadas para determinar la secuencia de los primers de lo oligonucleotidos que van a ser sintetizados y usados como puntos de inicio para la replicación del DNA.Los primers son complementarios a las regiones a favor y en contra de la secuencia a ser amplificada asi que se pega a esas regiones.los primers son necesarios porque las DNA polimerasas solo puede unirse a los nucleotidos de la cadena pre-existente. La DNA polimerasa usada en el PCR debe ser termalmente estable porque los ciclos del PCR fluctua entre temperaturas de 60º C y 94 º C.La DNA polimerasa termoestable ( taq) usada en el PCR fue insulada de thermophilic bacterium, Thermus aquaticus, que vive en altas temperaturas como las encontradas en el Parque Nacional Yellowstone. Dos nuevas hebras son creadas de la doble hebra original, en la cual un ciclo completo de la síntesis de la hebra.esto causa crecimiento exponencial en el número de moléculas templadas, el número de hebras dobles de cada ciclo.de cualquier manera después de 30 ciclos puede que se obtenga sobre 1 billón de copias que al principio.una vez la hebra templada ha sido suficientemente amplificada, esta puede ser visualizada.esto permite a los investigadores determinar la presencia o ausencia del producto deseado y determinar las similitudes y diferencias entre el DNA de los individuos.dependiendo de la secuencia de DNA analizada, diferencias entre los individuos puede tan grande como cientos de bases de pares o tan pequeño como un par de base o un solo punto de mutación. Los genes y el DNA Se estima que los 23 pares de cromosomas (46 cromosomas en total) del genoma humano contiene alrededor de 30,000 50,000 genes. Cada gene tiene el codigo para una proteína particular.estos 30,000-50,000 genes compone aproximadamente 5% del DNA cromosomal.el 95% es DNA no codificado.este DNA se encuentra no solo entre sino en los genes convirtiendolo en segmentos.en eucariotas, estas secuencias dentro de los genes se conocen como intrones son transcritas en el RNA pero al final no hace un proteína.las secuencias que no codifican para proteínas se conocen como exones.ambos intrones y exones son inicialmente transcritos, luego los intrones son llevados fuera del RNA para crear el mrna. En eucariotas, DNA genomico se transcribe en moléculas de RNA que contienen ambos intrones y exones de un gen en particular.cuando el RNA se mantiene en el núcleo los intrones deben ser removidos del RNA con exones que son puestos juntos para formar el codigo completo se la secuencia de una proteína. Este proceso de llama RNA splicing. Algunos genes pueden contener algunos intrones otros pueden contener docenas. 50

51 Dibujo del RNA splicing, pcr, El PCR conlleva varios pasos: Parte 1: Preparación del DNA de la mejilla Parte 2: Amplificación PCR Parte 3: Electroforesis de las muestras en geles de agarosa Parte 4: Analisis e interpretación de resultados Procedimiento: Parte 1: Materiales: InstaGene matrix Micropipeta de 20 µl Tips de filtro ( 2 20 µl) Micropipeta ( µl) Tips de filtro ( µl) Volterex Microtubos de prueba Tazas Procedimiento: 1. Rotula un microtubo de 1.5 ml contus iniciales.rotula uno de los tubos que contienen 200 µl de InstaGene matrix con tus iniciales. 2. Obtenga una taza que contenga una solución salina de su Instructor.Pon la salina en tu boca y enjuaga vigorosamente por 30 segundos.escupa la solución salina de vuelta en la taza. 3. Transfiere 1 ml de tu solución salina a un microtubo con tus iniciales.si una micropipeta de 1000 no esta disponible, cuidadosamente transfiere 1 ml de tu enjuague a tu microtubo. 4. Gira tu tubo en una centrifuga balanceada a máxima velocidad por 2 minutos.cuando la centrifuga termine remueve el tubo.se supone que puedas observar pellet y las células al fondo del tubo.si no ves el pellet, decanta la salina, vuelve a hechar de tu salina en el tubo y centrifuga. 5. Después de tener el pellet, descarta la salina.ten cuidado de no perder el pellet, coloca el tubo brevemente en un papel toalla.esta bien para una pequeña cantidad de salina ( < 50 µl, del tamaño de tu pellet) para mantenerlo en el fondo del tubo. 6. Resuspende el pellet por medio de vortex para que el terron de las células se mantega. 7. Usando una micropipeta de 2-20 µl, transfiere 20 µl de tus células resuspendidas al tubo que contiene InstaGene. 51

52 8. Cierra cuidadosamente el tubo.agita o dale vortex al tubo para mezclar el contenido del tubo. 9. Cuando los miembros de tu equipo hayan colectado las muestras, coloca los tubos en el foam de los microtubos, e incuba a 56 ºC por 10 minutos en baño de maría.a los 5 minutos, agita o vortex los tubos delicadamente, luego ponlos de vuelta en el baño de maria a 56 º C por los otros 5 minutos.µ 10. Remueva los tubos, agitelos y ponlos en agua hirviendo.incubar a 100 ºC por 5 minutos. 11. Remueve los tubos del agua hirviendo y agita el contenido para resuspenderlo.gira a 6,000 x g por 5 minutos en una centrifuga. 12. Guarda el tubo en el refrigerador hasta el proximo laboratorio.( o procede al paso 2). Parte 2: Amplificación del PCR 1. Busca el tubo con tu DNA que estaba en la nevera.gira el tubo por dos minutos a 6,000 x g ( 5 min. A 2,000 xg). 2. Rotula el tubo de PCRy rotula el tubo con tus iniciales, coloca el tubo de PCR en otro tubo sin tapa como se muestra y coloca ambos en el tubo de los microtubos. 3. Transfiere 20 µl del DNA templado ( supernadante) del tubo con rosca al final del tubo de PCR.Ten cuidado de NO transferir cualquier porción de la matriz al tubo del PCR. 4. Localiza el tubo con la mezcla amarilla en el hielo y transfiere 20 µl de la mezcla maestra al tubo de PCR.Mezclalo pipetiando 2-3 veces, tapa el tubo del PCR ajustado.la mezcla debe verse amarilla. 5. Coloca el tubo del PCR en thermal cycler.las reacciones de control preparadas por el Instructor también deben ser colocadas en la maquina de PCR en este punto.las reacciones deben ser sometidas a 40 ciclos para la amplificación de PCR. Parte 3: Electroforesis de las muestras amplificadas en geles de Agarosa 1. Obtenga sus tubos de PCR del Thermal cycler y colocalo en un microtubo sin tapa, mueve el tubo por 3 segundos a 2,000 x g. 2. Añada 10 µl depv92 XC loading dye en el tubo de PCR y mezlalo suavemente. 3. Coloca la Gel de agarosa en el aparato de electroforesis.verifica que las paredes de las geles de agarosa esten cerca del electrodo negro (-) y la base de la gel este cerca al electrodo rojo( +). 4. Llena la camara de electroforesis y cubre la gel con 1x TAE buffer.esto requiere 275 ml del buffer 1x 5. Usando una punta limpia para cada muestra, llena las muestras en los 8 pozos de la gel en el siguiente orden: 52

53 Carril Muestra Volumen 1 MMR DNA standard 10 µl 2 Homocigoto( +/+) control 10 µl 3 Homocigoto (-/-) control 10 µl 4 Heterocigoto( +/-) control 10 µl 5 Estudiante 1 20 µl 6 Estudiante 2 20 µl 7 Estudiante 3 20 µl 8 Estudiante 4 20 µl 6. Asegura la tapa de la caja del gel.la caja debe estar unida a la base solo en una orientación.roja- roja y negra negra.conecta los cables a la bateria. 7. Enciende la bateria comienza la electroforesis de tus muestras a 100 V por 30 minutos. Tinción Overnight a) Añade 120 ml de 1x Fast Blast DNA stain a tus bandejas. b) Deja las geles con el tinte toda la noche, moverlo suavemente para mejores resultados. c) Al día siguiente, bota los desechos del tinte en una beaker de desechos. d) Coloca la gel en la luz y observa los resultados.con un marcador permanente traza los pozos y los patrones de las bandas en una hoja limpia de plastico o acetato. e) Con la ayuda de tu instructor,donde estan los homocigotos y los heterocigotos para la inserción Alu. f) Recorta cualquier línea vacia de la gel con un cuchillo o una navaja g) Para obtener un record permanente usa dry-air para la gel.coloca en una papel de la libreta de laboratorio la gel.evita la exposición de la gel teñida a la luz directa, esto podria causar que se afecten las bandas. 53

54 Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamón Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas EFECTO DEL ALCOHOL EN LAS MEMBRANAS BIOLÓGICAS El objetivo de este experimento es determinar el efecto de diversos alcoholes y detergentes en la membrana celular. En este experimento se estará obteniendo información de tres diferentes alcoholes (metanol, etanol y propanol ) en las membranas. Una razón del por qué los alcoholes son tan perjudiciales a los organismos vivientes podría estar relacionado con el daño celular. Para este experimento se estará utilizando la remolacha ya que su pigmento rojo puede salir al exterior celular si la membrana está afectada. La intensidad del color fuera de la célula será proporcional a la cantidad de daño celular en presencia de los alcoholes y detergentes. Para medir la intensidad de color se estará utilizando un espectrofotómetro. Las soluciones de alcoholes son claras, por lo tanto si el pigmento se libera, este teñirá el alcohol alrededor de la muestra de rojo. Una concentración alta de solución con color absorberá más luz que una solución de baja concentración. Los valores se podrán leer como absorbancia. La absorbancia es directamente proporcional a la cantidad de pigmento rojo en la solución. Se prepararán cinco soluciones de diferentes concentraciones de alcohol ( 0%,10%, 20%, 30% y 40%) para cada uno de los tres alcoholes. Un pedazo pequeño de remolacha se colocará en cada solución. Luego de 10 minutos, cada solución de alcohol es transferido a una cuveta para ser leída a través del espectrofotómetro. Se realizará una gráfica del % de alcohol versus la cantidad de pigmento (que es absorbancia). Materiales: Espectrofotómetro 1-Propanol Etanol Metanol Tubos de ensayo Matraz de 100 ml Remolacha Isópos Pinzas Bulbos Regla Agua destilada Reloj Palillos de dientes 54

55 Navajas Microplatos de 24 pozos Guantes Pipetas de 2 ml Procedimiento: 1. Coloque : 10 ml de metanol en un tubo de ensayo y rotule como M 10 ml de etanol en un tubo de ensayo y rotule como E 10 ml de 1-propanol en un tubo de ensayo y rotule P 2. Rotule los pozos del microplato con el nombre de cada % de alcohol. 3. Prepare cinco soluciones de metanol (10%, 20%, 30% y 40%). 4. Utilizando diferentes pipetas añada 3 ml de alcohol en cada uno de los pozos. 5. Realice el mismo procedimiento del paso 2 y 3 para las soluciones de etanol y propanol. 6. Corte 15 pedazos cuadrados con las siguientes dimensiones de tamaño: 0.5 cm X.05 cm X 0.5 cm. Coteje de que todos los pedazos sean del mismo tamaño y que no posean la cubierta externa de la remolacha. 7. Lave los pedazos de remolacha con agua varias veces y déjelos secar. Esto eliminará la presencia de pigmento liberado durante el proceso de corte. 8. Utilizando las pinzas coloque los pedazos de remolacha a cada uno de los 15 pozos que contienen las diferentes soluciones de alcoholes. Anote el tiempo de exposición. 9. Mueva los pedazos de remolacha con un palillo de diente. Tenga cuidado de no insertar el palillo en el pedazo de muestra y causar daño mecánico a la remolacha. Uso del espectrofotómetro: 10. Use el largo de onda de 470 nm. 11. Prepare un blanco, utilizando agua destilada colocada en una cuveta. 12. Calibre el espectrofotómetro utilizando 0% de absorbancia y 100% de transmitancia. 13. Luego de 10 minutos, remueva los pedazos de remolacha de los pozos. Remueva los mismos en el mismo orden que fueron colocados. Mantenga las soluciones con color y descarte los pedazos de remolacha. 14. Coloque el contenido del primer pozo en la cuveta utilizando una pipeta y lea la absorbancia. 15. Descarte el contenido de la cuveta. Séquela bien y llene la cuveta con la próxima solución. Anote la absorbancia. 16. Realice el mismo procedimiento de los pasos 13,14 y 15 con las próximas muestras. 55

56 17. Prepare una gráfica con su data. Coloque la concentración en el eje de X y la absorbancia en el eje de Y. Coloque la información del metanol y conecte sus resultados con una línea. Haga lo mismo con la información de etanol y propanol. Prueba Concentración (%) Preguntas: Absorbancia Metanol Absorbancia Etanol Absorbancia 1-Propanol 1. Cuál alcohol daña la remolacha a menor concentración? 2. Cuál de los tres alcoholes afecta más a la membrana? 3. Cuál es la relación entre el tamaño de la molécula de alcohol y el daño a la membrana? Realice una hipótesis al respecto. 56

57 Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamón Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas Electroforesis de DNA Aplicación en las ciencias forenses (DNA Electrophoresisi Kit -BIO-RAD) La electroforesis es utilizada rutinariamente para resolver crímenes. En años recientes, nuevas historias se han reportado con pequeñas cantidades de DNA y se han utilizado para identificar individuos envueltos en incidentes. La electroforesis de proteínas se utiliza para en procedimientos médicos y forenses. Este kit permite a los estudiantes jugar en un rol de científico forensico y hacer una identificación positiva. En esta actividad los estudiantes analizaran 6 diferentes muestras de plásmido de DNA. Una muestra se colecta de una escena del crimen hipotético y cinco muestras obtenidas de los sospechosos que son digeridas con dos enzimas de restricción. Los fragmentos de DNA son separados y visualizados en una gel de azarosa usando una solución de tinte. Basado en los patrones de los fragmentos de restricción, los estudiantes compararan la evidencia con las muestras de DNA de los sospechosos con la escena del crimen. 57