Ensayo de toxicidad aguda con el pez Xiphophorus montezumae

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1 Ensayos de toxicidad aguda con el pez Xiphophorus montezumae 127 Ensayo de toxicidad aguda con el pez Xiphophorus montezumae Amplia experiencia Guillermina Alcaraz Zubeldia, Maribel Badillo Alemán y Cecilia Vanegas Pérez Clasificación del ensayo: AE Principio de la prueba Los lineamientos que se presentan se centran en la evaluación de la toxicidad aguda de compuestos tóxicos en juveniles de peces poecílidos de Xiphophorus montezumae. La especie se propone como organismo de prueba para la evaluación del efecto tóxico agudo de contaminantes en cuerpos de agua dulceacuícolas. En los ensayos agudos, la respuesta final a evaluar es la mortalidad de los organismos, al cabo de un tiempo determinado de exposición a compuestos tóxicos. La sensibilidad de los organismos se determina a través de la estimación de la concentración letal media durante el tiempo (x) de la exposición (CL 50 -x h). El pez cola de espada de Moctezuma, X. montezumae, es una especie endémica de México que se distribuye en el noroeste de México en las cuencas del río Tamesí en Tamaulipas, al norte de Veracruz y en los afluentes del río 127

2 128 Ensayos para agua dulce Pánuco en San Luis Potosí. Sin embargo, su localidad tipo es en el manantial Capuchinas y Río Verde, cerca de Rascón en San Luis Potosí (Espinoza, 1993). X. montezumae es un organismo bentopelágico de agua dulce, con forma corporal alargada, comprimida y con un pedúnculo caudal muy ancho. Las hembras miden en promedio 6.5 cm de longitud y los machos 5 cm. Su coloración es amarilla en todo el cuerpo, con escamas marginadas en negro en la región dorsal. Son organismos con dimorfismo sexual externo; los machos presentan una elongación en la parte baja de la aleta caudal con forma de pincho o espada y su aleta anal se transforma en gonopodio al llegar a la madurez sexual (figura 9.1). El gonopodio empieza a distinguirse alrededor de los 4 meses de edad y se caracteriza por un ensanchamiento del tercer radio anal, con una segmentación más evidente. De tal manera, los machos juveniles no se distinguen de las hembras hasta que empiezan a desarrollar el gonopodio y la espada (Espinoza, 1993). Figura 9.1. Dimorfismo sexual en organismos adultos de Xiphophorus montezumae A) hembra y B) macho A B Material Acuarios de vidrio para el mantenimiento de los organismos de 40 L (26 x 30 x 50 cm) y 80 L (60 x 40 x 37 cm). Acuarios de vidrio de 20 L (41 x 26 x 20 cm) para los bioensayos. Cristalería: vasos de precipitados, matraces Erlen-

3 Ensayos de toxicidad aguda con el pez Xiphophorus montezumae 129 meyer, probetas, etc. Espátulas. Accesorios de acuario: mangueras, piedras de aireación, redes de mano, etc. Alimento en hojuelas (45% proteína); alimento vivo (Artemia sp.). Equipo Pipetas automáticas de diferentes volúmenes (5µL -50µL, 50µL-100µL, 100µL-1000µL), balanza analítica, oxímetro, potenciómetro, termómetro, salinómetro, sistema de filtración mecánica, uv y biológica, sistema de aireación continua, sistema para el control del fotoperíodo, equipo para la determinación de amonio total y nitrito (por ejemplo espectrofotómetro, electrodos, etc). Reactivos Sal de acuario, tiosulfato de sodio y reactivos para las técnicas de determinación de amonio total y nitrito (por ejemplo azul de indofenol y sulfanilamida). Organismos de prueba Origen de los organismos Los organismos juveniles de X. montenzumae que se utilicen en las pruebas de toxicidad deben ser capturados en alguna de las localidades tipo de San Luis Potosí (Manantial Capuchinas y Río Verde) o bien ser descendientes directos de organismos silvestres reproducidos y criados en el laboratorio o en algún acuario comercial. Se recomienda la reproducción de estos organismos en condiciones controladas debido a su fácil cultivo y al gran número de descendientes que se pueden obtener. Para garantizar la calidad de los reproductores se deben utilizar organismos adultos sanos. Durante su traslado al laboratorio, desde el sitio de captura en el medio natural o desde un ambiente de cultivo, los organismos deben ser manipulados lo menos posible para disminuir el estrés. Para la reproducción de X. montezumae se colocan parejas de un macho y una hembra en un acuario de 40 L de capacidad durante una semana, a una temperatura de 25 C. Posteriormente, se retira al macho dejando a la hembra sola hasta el parto. Una vez que hayan nacido las crías, éstas se transfieren a un acuario de crianza de 20 L de capacidad, no excediendo más de 30 crías

4 130 Ensayos para agua dulce por acuario. Al cabo de un mes de nacidas, las crías deben ser trasladadas a un acuario de 40 L hasta que alcancen la talla deseada. La aireación del acuario que contiene a las crías debe ser mínima para que toda la energía de los recién nacidos se traduzca en un excelente crecimiento. El acuario de cría debe carecer de grava en el fondo, ya que la grava provoca que las crías queden atrapadas en el fondo hasta que mueren. En condiciones controladas de laboratorio, las hembras de X. montezumae llegan a tener entre 30 y 100 crías por parto y hasta 3 partos con un solo apareamiento. El tiempo de gestación es de 30 días aproximadamente. Inmediatamente después del nacimiento las crías deben ser alimentadas. Éstas pueden alcanzar en un lapso de 2.5 a 3 meses la talla de 30 mm de longitud estándar, talla recomendada para realizar las pruebas de toxicidad. Para los ensayos de toxicidad se recomienda utilizar descendientes de diferentes padres, (siempre y cuando sean de la misma edad) para considerar la variabilidad biológica normal de la especie. De tal manera, las crías descendientes de diferentes padres pueden ser agrupadas para su mantenimiento. Aclimatación y mantenimiento de los organismos Las condiciones físicas y químicas del agua en que se mantienen los organismos en el laboratorio dependen del origen y del estadio de los mismos. Los reproductores capturados del medio natural o transferidos de un ambiente de cultivo se mantienen durante los primeros cinco días en las condiciones de captura o cultivo. Posteriormente, la temperatura se ajusta a una tasa de 1 C/día, hasta alcanzar las condiciones de evaluación requeridas (siempre dentro de los intervalos adecuados para la especie). Una vez alcanzadas las condiciones requeridas, los adultos de X. montezumae deben ser mantenidos en éstas al menos durante siete días antes de dar inicio a la etapa de reproducción. Durante el período de aclimatación y mantenimiento de los organismos los parámetros fisicoquímicos deben mantenerse en condiciones adecuadas para la especie y los diferentes estadios (reproductores, crías y juveniles) (tabla 9.1). El control de la concentración de amonio, nitrito y nitrato en el agua se mantiene a través de recambios parciales de agua. El volumen y frecuencia del recambio de agua debe permitir mantener bajos los niveles de los compuestos nitrogenados para evitar su acumulación y acción tóxica sobre los organismos (Lewis y Morris, 1986; Randall y Tsui, 2002). Durante la etapa de mantenimiento y aclimatación, el fotoperíodo se debe mantener 12 horas

5 Ensayos de toxicidad aguda con el pez Xiphophorus montezumae 131 Tabla 9.1. Parámetros fisicoquímicos para el mantenimiento adecuado de los diferentes estadios de Xiphophorus montezumae en condiciones controladas Temperatura 20 a 27 C Dureza mg/l CaCO 3 Amonio <1.0 ppm ph 7 a 8 Oxígeno Disuelto 6.0 mg/l Salinidad 0.1 luz :12 horas oscuridad (de 3000 a 4000 luxes de luz). Diariamente se deben registrar y controlar los parámetros fisicoquímicos del agua. El agua utilizada tanto para el mantenimiento de los organismos como para los bioensayos de toxicidad debe ser previamente filtrada con filtro mecánico, carbón activado y UV, garantizando así las condiciones de calidad de la misma. El agua no debe estar en contacto con bombas o tuberías metálicas y debe prepararse agregando 14.5 g de sal de acuario (comercial) y 3.5 g de tiosulfato de sodio por cada 20 L de agua, manteniéndola en oscuridad bajo aireación intensa, al menos 48 horas antes de su uso. Los peces se mantienen en tanques medianos o grandes (40 a 80 L de capacidad) equipados con sistemas de filtro biológico o filtros de cascada, considerando una densidad de 1 g de peso húmedo (PH) de organismo por cada 2 L de agua. Debe cuidarse que el sistema de filtración genere poca corriente. Para la alimentación de los reproductores y juveniles se recomienda una dieta combinada de alimento comercial en hojuelas y de tipo congelado o vivo (Artemia sp). Para las crías, se recomienda el suministro ad libitum de alimento vivo (nauplios de Artemia sp). El patrón de alimentación diario consiste en el suministro de alimento vivo o congelado por las mañanas y de hojuelas comerciales por las tardes (tabla 9.2); las hojuelas comerciales deben tener un mínimo de 45% de contenido proteico (tabla 9.3). Durante el período de aclimatación y mantenimiento, los organismos deben ser revisados constantemente. Si se presenta más del 10% de mortalidad en el grupo, se observan indicadores de enfermedad o se detecta algún tipo de condición funcional o conductual inadecuada, el lote debe ser descartado para experimentación.

6 132 Ensayos para agua dulce Tabla 9.2. Patrón de alimentación para el mantenimiento de diferentes estadios de Xiphophorus montezumae en condiciones de laboratorio Estadio Alimento comercial en hojuelas, Suministro Suministro de % proteína de alimento comercial alimento vivo (Artemia sp) Crías 45 No ad libitum Juveniles 45 Ad libitum 10 % PHc* Reproductores 45 10% PHc 10 % PHc* *PHc: Peso húmedo corporal Tabla 9.3. Valor nutricional de las hojuelas comerciales suministrados como alimento a los diferentes estadios de X. montezumae Composición Porcentaje % Proteína cruda 46 Grasa cruda 8.0 Fibra cruda 2.0 Humedad 6.0 Fósforo 1.3 Vitamina C 3 mg/kg Compuestos tóxicos de prueba Para evaluar la toxicidad aguda de compuestos aislados, éstos deben tener un elevado grado de pureza (grado reactivo). Si el compuesto tóxico de prueba (compuesto aislado; extracto) es soluble en agua, la solución madre debe ser preparada en agua deionizada. Si el compuesto tóxico de prueba es estable en solución, debe prepararse una solución madre única al inicio de las pruebas. Si el compuesto tóxico de prueba no es estable en solución (por ejemplo sujeto a oxidación u otras transformaciones químicas o biológicas) una nueva solución debe prepararse previo a su uso. Si el compuesto tóxico de prueba no es soluble en agua, una solución acuosa madre debe ser obtenida por la solución inicial del compuesto en un disolvente acarreador (por ejemplo acetona, etanol, propilenglicol, etc.). En este caso, en las pruebas experimentales se debe considerar

7 Ensayos de toxicidad aguda con el pez Xiphophorus montezumae 133 un grupo testigo del disolvente, evaluando el volumen máximo adicionado. Si se evalúan mezclas complejas (por ejemplo efluentes, lodos, etc.), la mezcla inicial será considera como la solución madre (100%) a partir de la cual se efectuarán las diluciones experimentales correspondientes. El volumen máximo de la solución madre que se adiciona a los acuarios experimentales debe ser el menor volumen posible que no modifique las características del medio experimental (por ejemplo volumen y ph), preferentemente no mayor del 0.5% respecto al volumen total. La concentración del compuesto problema debe ser determinada analíticamente en submuestras del medio al menos al inicio y al término de los bioensayos. Sin embargo, si se presumen transformaciones o cambios en las concentraciones de los compuestos tóxicos se deben evaluar las concentraciones reales durante el transcurso de las pruebas. Si se efectúan recambios del medio, se deben evaluar las concentraciones reales antes y después del recambio. Procedimiento de prueba Cámaras experimentales Los bioensayos deben ser de tipo estático o semi-estático. El agua que se utiliza en las pruebas debe ser previamente preparada como se señaló con anterioridad. Los acuarios experimentales deben ser de vidrio, preferentemente de 20 L de capacidad. Los acuarios deben ser lavados previamente con detergente libre de fosfatos y disolventes; posteriormente deben ser enjuagados con HCl al 10% y en seguida con agua corriente y destilada antes de su uso (UNEP/ FAO/IAEA, 1986). Para las pruebas, se recomienda, por cada gramo de tejido húmedo de animal (g PH), utilizar un mínimo de 1 L de agua (1 g PH/L), y de manera ideal una relación de 2 L/ g PH. Parámetros fisicoquímicos En el transcurso de las pruebas deben registrarse y mantenerse constantes el ph, la temperatura, la dureza y el oxígeno disuelto (la aireación debe ser de burbujeo fino y constante durante el tiempo de exposición). El fotoperíodo se mantiene en 12 horas luz: 12 horas oscuridad (entre 3,000 y 4,000 luxes de luz).

8 134 Ensayos para agua dulce Alimentación La alimentación de los animales se debe suspender 24 horas antes iniciar las pruebas y durante el desarrollo de las mismas (96 horas), con el fin de evitar interferencia por los procesos digestivos. Para períodos de exposición mayores, se recomienda alimentar a los organismos; el suministro del alimento debe ser de manera ideal una vez al día (sólo de hojuelas comerciales; 10% PHc) retirando el alimento remanente después del período de alimentación (2 horas) y posteriormente retirando las heces producidas. En este caso, el agua de los acuarios debe ser recambiada diariamente, preferentemente el 75% del volumen total, y las soluciones y concentración de los compuestos tóxicos deben ser ajustadas apropiadamente. En el caso del 100% de recambio se recomienda contar con series adicionales de acuarios, con las concentraciones respectivas de los compuestos problema para transferir cuidadosamente a los organismos. Organismos de prueba Los organismos experimentales expuestos a los diferentes niveles del(los) compuesto(s) tóxico(s) deben ser similares en talla (longitud estándar) y en peso. Para ello, una submuestra representativa de los organismos provenientes del mantenimiento (mínimo 30 organismos) debe ser pesada y medida para garantizar la evaluación de peces de pesos homogéneos. Se recomienda que los bioensayos se realicen con juveniles de X. montezumae de 0.8 a 1.1 g PH. Los organismos que mueran durante el transcurso de las pruebas o que sobrevivan a la misma deben ser pesados y medidos al final de la prueba. Durante el transcurso del procedimiento experimental, los organismos deben manipularse lo menos posible para evitar la posible influencia del estrés sobre la respuesta tóxica. Duración de las pruebas y recambio El período de exposición depende de los objetivos que se persigan. Las pruebas de toxicidad aguda deben realizarse por un período de 96 horas. En caso de que sea necesario prolongar las pruebas por períodos mayores a 96 horas, los organismos deberán ser alimentados durante este tiempo para evitar alteraciones nutricionales. Cuando se requiera alimentar a los animales, se deben realizar recambios de agua después del retiro de las heces.

9 Ensayos de toxicidad aguda con el pez Xiphophorus montezumae 135 Las soluciones del compuesto problema deben ser renovadas al menos una vez cada 24 horas. En todos los casos en que se realicen recambios se deben tomar muestras de las soluciones de exposición antes y después de los recambios para determinar analíticamente las concentraciones del compuesto tóxico problema. Pruebas de intervalo de toxicidad Para estimar la toxicidad de un compuesto se deben efectuar pruebas del intervalo de toxicidad. Cuando se carece de información relativa a la toxicidad de la muestra problema se deben utilizar progresiones de las concentraciones en escala logarítmica; cuando existe información disponible, por ejemplo en otras especies de Xiphophorus, se pueden utilizar progresiones de las concentraciones en escala aritmética. En el caso de mezclas complejas (por ejemplo, efluentes, lodos, etc.) se efectúan las diluciones correspondientes (por ejemplo, 10, 20, 40, 60 y 80%) a partir de la mezcla original (100%). Se considera un mínimo de seis concentraciones experimentales y un grupo testigo sin adición del compuesto problema; en el caso de que el compuesto problema se haya disuelto en algún disolvente, se debe considerar un testigo del disolvente utilizado. Por cada concentración se considera al menos una réplica. En cada cámara experimental y para cada concentración se exponen un mínimo de 10 organismos. Los peces se eligen de los sistemas de mantenimiento y se colocan al azar en los acuarios experimentales de exposición. Previo a la adición de los compuestos en estudio, los organismos se mantienen un mínimo de 24 horas en aclimatación en los acuarios de exposición, sin proporcionar alimento. La adición de la solución de prueba debe efectuarse de manera muy lenta, con una agitación suave para evitar una posible exposición de los organismos a la elevada concentración de la solución madre, garantizando la completa mezcla del compuesto tóxico en el medio y cuidando de no estresar a los organismos expuestos. La mortalidad se registra a lo largo del tiempo de exposición, con observaciones a las 0, 2, 4, 8, 12 y cada 12 horas posteriores hasta el término del ensayo. Los organismos muertos durante el período de exposición deben ser removidos lo antes posible para evitar el deterioro de la calidad del agua. Además de la mortalidad, se registran cambios en el comportamiento de los peces (por ejemplo alteraciones del equilibrio, nado errático, cambios en la actividad locomotora y en la conducta alimentaria, etc.). La falta de respuesta de los organismos cuando sean tocados suavemente con una varilla

10 136 Ensayos para agua dulce de vidrio se considera como criterio de mortalidad. Si en el transcurso de las pruebas, la mortalidad de los grupos testigo excede el 10%, la prueba se invalida; el uso de factores de corrección por la mortalidad de los testigos no es válido. Prueba definitiva A partir de los resultados de la prueba de intervalo de toxicidad, se establecen las concentraciones adecuadas para evaluar la toxicidad aguda del compuesto tóxico. Se sigue el mismo procedimiento señalado previamente, si bien se recomienda en este caso evaluar un mínimo de dos réplicas por concentración experimental. Al igual que en la prueba de intervalo de toxicidad, la mortalidad se registra a lo largo del tiempo de exposición, con observaciones a las 0, 2, 4, 8, 12 y cada 12 horas posteriores hasta el término del ensayo. En la tabla 9.4 se integran las condiciones de prueba recomendadas para los ensayos de toxicidad con juveniles de X. montezumae. Tabla 9.4. Condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad aguda con juveniles de Xiphophorus montezumae Tipo de ensayo Estático o semi-estático Temperatura 25 ± 1 C Calidad de luz Blanca-fría Fotoperíodo 12 horas luz :12 horas oscuridad Volumen del acuario 20 L Volumen de la solución de prueba 18 L Agua de dilución Filtrada, reposada y fuertemente aireada Edad de los organismos Juveniles de 0.1 a 1.1 g PH Número de peces por réplica 10 Número de réplicas 2 Duración de la prueba 96 horas Efectos medidos Respuesta final: mortalidad Respuestas adicionales: alteración en la actividad y la conducta alimentaria. Resultado final CL 50 y TL 50 Aceptabilidad de los resultados Sobrevivencia en el grupo testigo 90%

11 Ensayos de toxicidad aguda con el pez Xiphophorus montezumae 137 Expresión de resultados A partir de los resultados de mortalidad obtenidos de las pruebas de toxicidad aguda se determina la concentración letal media (CL 50 ) o el tiempo medio de muerte (TL 50 ). Para el análisis no se consideran los datos de los grupos testigos, las concentraciones o tiempos en que la sobrevivencia sea 100% o bien las concentraciones con 100% de mortalidad. Para la determinación de la CL 50 o TL 50, se utilizan los programas específicos de cómputo diseñados para este fin. Preferentemente se utilizan modelos tipo Probit : X, Probit : log X o arcoseno: X, seleccionando el modelo de mejor ajuste. La validez de los modelos se determina a través de la prueba de X 2. En cada caso se obtienen los valores de CL 50 -t ± I.C. y TL 50 -x ± I.C. (I.C. = intervalo de confianza; α = 0.05). Validación de las pruebas definitivas Los bioensayos se consideran válidos siempre y cuando cumplan con las siguientes especificaciones: a) La mortalidad del grupo testigo no sea mayor del 10%. b) La concentración real de los compuestos no exceda el 20% de la concentración nominal de los mismos. c) La variabilidad entre las réplicas no exceda el 20%. d) Los cálculos (CL 50 -t ± I.C. y TL 50 -x ± I.C.) se deben realizar con las concentraciones del compuesto tóxico determinadas analíticamente. e) El valor calculado de la CL 50 debe estar incluido dentro del intervalo de concentraciones experimentales y el modelo Probit debe ser significativo para asegurar la confiabilidad de los resultados. Bibliografía Alcaraz G., X. Chiapa, V. Espinosa y C. Vanegas. 1999a. Acute toxicity of ammonia and nitrite to white shrimp Penaeus setiferus postlarvae. Journal of the World Aquaculture Society 30 (1): Alcaraz G., V. Espinosa y C. Vanegas. 1999b. Acute effect of ammonia and nitrite on respiration of Penaeus setiferus postlarvae under different oxygen levels. Journal of the World Aquaculture Society 30 (1): Espinoza, H. P Listados faunísticos de México III. Los peces dulceacuícolas

12 138 Ensayos para agua dulce mexicanos. Departamento de Zoología, Instituto de Biología. Universidad Nacional Autónoma de México, México. Kruesi, C. K Desempeño de nado en machos de Xiphophorus montezumae: El costo de un ornamento. Tesis Licenciatura. Facultad de Ciencias, UNAM. 45 pp. Lewis Jr., W. M. y D. P. Morris Toxicity of nitrite to fish: a review. Transactions of American Fish Society 115: Randall, D. J. y K. T. N. Tsui Ammonia toxicity in fish. Marine Pollution Bulletin 45: United Nations Environment Program, Food & Agriculture Organization, International Atomic Energey Agency (UNEP/FAO/IAEA) Test of the acute lethal toxicity of pollutants to marine fish and invertebrates. Reference Methods for Marine Pollution Series. No. 43. UNEP. Vanegas C Efectos subletales del cadmio y del zinc en el camarón blanco Penaeus setiferus. Tesis de doctorado en Ciencias. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional Autónoma de México, México.