MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS
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- Elvira Díaz García
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1 MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS 1 ESPECTROSCOPÍA Estudio de la interacción entre la materia y la radiación electromagnética con absorción o emisión de energía radiante. ESPECTROMETRÍA Utiliza las bases de la espectroscopía para el estudio cuali cuantitativo de una especie química Comprende una serie de métodos analíticos basados en las propiedades de la materia cuando ésta interacciona con distintos tipos de radiación electromagnética (distintas modalidades) Hace uso de espectrómetros o espectrofotómetros 2 1
2 ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO longitud de onda (λ) frecuencia/energía (, E) 3 RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA NATURALEZA DUAL ONDA PARTÍCULA 4 2
3 Naturaleza ondulatoria (Huygens, 1678 Maxwell, 1864: Teoría Electromagnética) Superposición de campos eléctrico y magnético en fase, con oscilaciones sinusoidales, perpendiculares entre sí y respecto a la dirección de propagación Representación de un haz de radiación polarizada E: campo eléctrico B: campo magnético 5 Parámetros ondulatorios Amplitud (A) Magnitud del vector eléctrico en el máximo de la onda Longitud de onda ( ) Distancia entre dos máximos o dos mínimos consecutivos (nm) Frecuencia ( ) Número de oscilaciones completas que se producen por segundo (s -1 o Hertz = Hz) y A 6 3
4 Velocidad de propagación (v) v = Número de onda Es la inversa de la longitud de onda (cm -1 ) = 1/ A mayor longitud de onda, menor frecuencia 7 INTERACCIONES MATERIA CON LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA luz incidente luz absorbida luz transmitida luz reflejada luz refractada luz dispersada y emitida La absorción, emisión y transmisión no se explican mediante la teoría ondulatoria 8 4
5 Fenómenos ondulatorios Reflexión Refracción Difracción Dispersión 9 Reflexión Desvío de la dirección de un haz de radiación cuando éste encuentra una superficie que separa dos medios con diferentes índices de refracción, de manera que éste regresa a su medio original A mayor diferencia de índice de refracción, mayor reflexión 10 5
6 Refracción Desvío en la dirección de un haz de radiación cuando éste incide en la interfase entre dos medios transparentes de densidades diferentes n 1 n 2 sen / sen = n 2 /n 1 (donde n es el índice de refracción de cada medio) 11 Difracción Curvamiento de un haz paralelo de radiación al encontrarse con un obstáculo o al pasar por una abertura de tamaños semejantes a la longitud de onda Patrón de difracción 12 6
7 Dispersión Fenómeno mediante el cual la radiación que incide sobre la materia es transmitida en todas direcciones (diferentes de la del haz incidente) A longitud de onda constante, mientras mayor tamaño de partícula, mayor dispersión A tamaño de partícula constante, mientras menor longitud de onda de la radiación, mayor dispersión 13 Dispersión de la luz blanca (policromática) n1 (v1) n2 (v2) A mayor menor dispersión 14 7
8 Naturaleza corpuscular (Newton, 1666 Einstein, 1905: Efecto fotoelétrico) Torrente de partículas sin carga ni masa, llamadas fotones, cuya energía define el tipo de radiación electromagnética Los fotones poseen cantidades discretas (múltiples de un valor mínimo) de energía (cuantos) E = h h: Constante de Planck = 6,63 x J.s : frecuencia asociada a la radiación electromagnética 15 Relaciones derivadas de ambas teorías v = E = h En el vacío: v = c = 3 x 10 8 m/s E = h c / o, ya que = 1/ E = h c 16 8
9 Mayor Frecuencia Mayor Energía 17 Fenómenos corcuspulares Efecto fotoelétrico Transmisión Absorción Emisión 18 9
10 Efecto fotoeléctrico Emisión de electrones por un material cuando éste se le ilumina con radiación electromagnética (luz visible o ultravioleta, en general) luz electrones 19 Transmisión Corresponde al fenómeno mediante el cual la luz atraviesa un cuerpo transparente o translúcido (no opaco) La velocidad de transmisión de la radiación electromagnética en el vacío es siempre mayor que en cualquier otro medio En el vacío: v = c = 2,998 x 10 8 m/s En otros medios: v = c / n (donde n es el índice de refracción del medio) Influyen tipos y concentraciones de átomos, iones o moléculas del medio (interacción radiación materia) No se verifica cambio en la frecuencia (no hay transferencia permanente de energía) 20 10
11 Absorción Eliminación selectiva de ciertas frecuencias de una radiación electromagnética cuando ésta atraviesa un medio material La energía de la radiación es transferida a las partículas del medio (átomos, iones, moléculas) Se produce una transición de un estado de energía fundamental o basal, de dichas partículas, a uno excitado de mayor energía Sólo se produce transición si la energía de los fotones de la radiación coincide exactamente con la diferencia de energías entre el estado fundamental y uno de los excitados Existe un número limitado de niveles de energía para una partícula (valores discretos de energía): estados cuantizados Diferencias de energía características para cada especie (utilidad analítica) 21 Proceso de excitación-relajación de partículas de materia expuestas a radiación electromagnética Proceso no radiativo (calor) Estados excitados Niveles energéticos cuantizados Radiación incidente de frecuencia Absorción Emisión E = h Estado fundamental o basal E N E R G Í A Proceso radiativo 22 11
12 Emisión Radiación electromagnética originada cuando partículas excitadas (átomos, iones o moléculas) se relajan a niveles de menor energía, cediendo su energía en forma de fotones (relajación radiativa) Se origina sólo luego de una absorción de energía de radiación electromagnética por parte de partículas del medio (átomos, iones, moléculas) Es consecuencia de un proceso de relajación (retorno de las partículas a niveles de energía menores), liberándose la energía en exceso Radiación emitida es características para cada especie y puede tener utilidad analítica 23 Métodos espectroscópicos asociados a las distintas regiones del espectro electromagnético Método espectroscópico Rango de de la radiación utilizada Tipo de transición de energía implicado Absorción, Emisión y Fluorescencia de rayos X 10pm-10nm Estados electrónicos (electrones internos) Absorción UV de vacío 10nm-180nm Estados electrónicos (electrones de enlace) Absorción, Emisión y Fluorescencia UV -V 180 nm-780 nm Estados electrónicos (electrones de enlace) Absorción y Dispersión IR 0,8 m-1mm Estados rotacionales y vibracionales de moléculas Absorción de microondas 0,7mm-4mm Estados rotaciones de moléculas Resonancia de spin electrónico (RSE) Resonancia magnética nuclear (RMN) 3 cm Estados de spin de electrones en un campo magnético 0,5-10 m Estados de spin de núcleos en un campo magnético 24 12
13 25 ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR 26 13
14 ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR Utiliza radiación electromagnética de la región UV y Visible Rango UV experimental: 180 < (nm)< 380 Rango Visible experimental: 380 < (nm) < 780 Están implicadas transiciones entre estados electrónicos de enlace (y no enlazantes) de moléculas orgánicas y de algunos iones inorgánicos Utilidad analítica para la identificación y cuantificación de especies químicas En el caso de moléculas las transiciones electrónicas se superponen con las vibracionales, y éstas a su vez con las rotacionales 27 ENERGÍA INTERNA DE UNA MOLÉCULA Einterna = E rot + E vib + E electrónica 28 14
15 Rotaciones moleculares Una molécula dada presenta distintos modos rotacionales con energías características 29 Vibraciones moleculares Una molécula dada presenta distintos modos vibracionales con energías características 30 15
16 Estados electrónicos moleculares Corresponden a configuraciones u arreglos electrónicos que una molécula puede adoptar bajo ciertas condiciones, cada uno de ellos tiene asociada una energía definida. 31 Electrónicas TRANSICIONES MOLECULARES Se requiere radiación de energía que consiga vencer fuerzas atractivas entre electrones y núcleo para cambiar la configuración electrónica de energía mínima o nivel fundamental, a una de mayor energía o nivel excitado (UV o V) Se solapan con rotacionales y vibracionales Vibracionales Niveles energéticos menos espaciados. Se requiere radiación de menor energía (IR) Se solapan con las rotacionales Rotacionales Niveles energéticos muy próximos. Se requiere radiación de poca energía (microondas) 32 16
17 Energía 03/05/2018 Estados de energía cuantizados de una molécula (E determinadas o permitidas) v3 v2 v1 Primer estado electrónico excitado v0 j4 j3 j2 j1 Transiciones Transiciones Transiciones Rotacionales vibracionales electrónicas v6 v5 v4 v3 v2 v1 v0 Estado electrónico fundamental 33 La molécula absorberá solamente aquellos fotones cuya energía sea igual a la diferencia de energía entre niveles energéticos permitidos de la misma. E = h E = h 34 17
18 ABSORCIÓN DE RADIACIÓN UV-V Procesos implicados 1) EXCITACIÓN ELECTRÓNICA M + h M* t ½ ~10-9 s 2) RELAJACIÓN: distintas posibilidades a) Colisiones con otras especies M* M + calor b) Descomposición (reacción fotoquímica) M* A + B c) Reemisión de luz Fluorescencia: M* M + h ( < ) Fosforescencia: Reemisión retrasada en el tiempo 35 ESTADOS ELECTRÓNICOS DE UNA MOLÉCULA ORBITALES MOLECULARES (OM) Resultan del solapamiento de orbitales atómicos (OA) La combinación de dos OA, generan dos OM: Enlazante de baja energía Antienlazante de alta energía Los electrones en una molécula en estado fundamental o basal ocupan OM enlazante Los electrones en una molécula en estado excitado ocupan OM antienlazantes 36 18
19 Energía 03/05/2018 Orbitales atómicos Orbitales moleculares H 1 s H2 Orbital antienlazante * H 1 s H2 Orbital enlazante Orbitales moleculares de una molécula diferentes energías s + s * p x + p x * p y + p y * 38 19
20 Orbitales σ enlazantes: Combinación de orbitales atómicos s y p (s-s, p-p, s-p, p-s) Enlaces simples con grado de deslocalización muy pequeño. Orbitales con geometría cilíndrica alrededor del eje de enlace Orbitales π enlazantes: Combinación de orbitales atómicos p perpendiculares al eje de enlace. Electrones fuertemente deslocalizados que interaccionan fácilmente con el entorno. Se distribuyen como nubes electrónicas por encima y debajo del plano de enlace Orbitales σ* antienlazantes: Versión excitada (de mayor energía) de los enlazantes Orbitales π* antienlazantes: Orbitales π de alta energía Orbitales n: Para moléculas con heteroátomos (N, O, etc). Los electrones desapareados no participan en el enlace y ocupan este orbital 39 Luz UV-V poseen (E) que se corresponden con la diferencia de E entre niveles electrónicos de átomos y moléculas. Tipos de transiciones electrónicas. Pueden intervenir: 1) Electrones, y n: moléculas/iones orgánicos. Algunos aniones inorgánicos 2) Electrones d y f: cationes metálicos de transición 3) Electrones de transferencia de carga Moléculas con presencia de grupos cromóforos (electrones de valencia con E excitación relativamente bajas) 40 20
21 * antienlazante * antienlazante n no enlazante enlazante enlazante Las transiciones entre estados electrónicos de electrones (enlaces simples) requieren radiación de < 185 nm (UV de vacío, absorción de componentes de la atmósfera, dificultades experimentales) Las transiciones entre estados electrónicos de electrones (enlaces dobles y triples) y n (electrones no enlazantes) requieren radiación de > 185 nm (UV-V) 41 Transiciones electrónicas involucrando orbitales moleculares n, y Transición Rango de Ejemplos 42 21
22 Transiciones posibles * E asociada Ejemplos Comentarios UV vacío ( < 185 nm) CH 4 C 2 H 6 máx=125 nm máx=135 nm No observables a UV normalmente accesible ( > 180nm) n * 150 < (nm)< 250 H 2 O máx=167 nm CH 3 Cl máx=173 nm CH 3 OH máx=184 nm CH 3 NH 2 máx=215 nm n * * 200 < (nm)< 700 Compuestos orgánicos con grupos funcionales no saturados E depende de tipo de enlace y en menor medida de estructura 100 < (M/s)< < (M/s)< < (M/s)< EFECTOS DEL SOLVENTE Para un analito dado, se observan desplazamientos de los máximos de absorción, de acuerdo a la naturaleza del solvente. A medida que aumenta la polaridad del solvente: 1) Las transiciones n * se desplazan hacia más cortas (de mayor E) DESPLAZAMIENTO HIPSOCRÓMICO (hacia el azul) El par de electrones n aumenta su grado de solvatación, disminuyendo su nivel de energía. Efecto marcado con solventes polares próticos (H 2 O, CH 3 OH) que pueden formar puentes de H. * n 44 22
23 2) Las transiciones * se desplazan hacia más largas (de menor E) DESPLAZAMIENTO BATORÓMICO (hacia el rojo) Fuerzas de polarización atractivas entre solvente y analito tienden a disminuir los niveles energéticos de ambos estados, siendo mayor el efecto sobre el estado excitado. * 45 Efecto de la conjugación de cromóforos Los electrones deslocalizados por conjugación de enlaces C = C, disminuyen la E del orbitral * Máximos de absorción * se desplazan a mayores (efecto batocrómico) Máximos de absorción 184 nm 217 nm 250 nm 46 23
24 Conjugación de enlaces C = C con C = O produce el mismo efecto en las transiciones n * y * (efecto batocrómico) C CH3 O Máximos de absorción n * * 282 nm en UV de vacío C CH3 O 324 nm 219 nm Sistemas altamente conjugados, absorben en la región visible (pigmentos)
25 Sistemas aromáticos Máximos de absorción * 184 nm intenso ( = 60000) 204 nm débil ( = 7900) 256 nm muy débil ( = 200) La sustitución en el anillo provoca corrrimientos de las posiciones de éstas bandas Aniones inorgánicos (NO 3-, CO 3 2- y NO 2- transiciones n * a 313, 219 y 360/280 nm, respectivamente) Iones de metales de transición absorben radiación UV en todos los estados de oxidación (influye entorno, o tipo de complejo que formen) Cu 2+ celeste en medio acuoso, azul en medio amonicacal Especies inorgánicas que forman complejos de transferencia de carga SCN - /Fe (III); o-fenantrolina/fe (II), CN - /Fe; Almidón/I 3 - > COLORANTES ARTIFICIALES DE USO ALIMENTARIO 50 25
26 ASPECTOS ANALÍTICOS DE LA ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN P 0 Muestra P Potencia radiante: Energía radiante por segundo por unidad de área P 0 : Potencia radiante incidente (monocromática, contiene sólo una ) P: Potencia radiante emergente P < P 0 (es igual si la muestra es totalmente transparente a la utilizada) Transmitancia, T: Fracción de la potencia radiante de luz incidente que pasa a través de la muestra: T = P / P 0 0 < T < 1 o T% = P / P 0 x < T < Absorbancia, A A = - log T = -log (P / P 0 ) = log (P 0 /P) Ley de Beer (Lambert) Relación empírica que relaciona la Absorbancia de una solución de un analito con su concentración y con el camino óptico del haz de luz (camino recorrido por el haz en la solución) Donde: A = log (P 0 /P) = b. c A: absorbancia de la solución : coeficiente de absortividad molar o extinción molar (M -1 cm -1 ) b: camino óptico (cm) c: concentración del analito (M) P 0 P 52 26
27 Para un analito dado, existe una relación lineal entre la A vs. concentración (trabajando a b constante) El sólo depende del analito y de la de la luz incidente indica la capacidad absorbente de radiación de una determinada que posee una especie química dada La linealidad se cumple en un rango limitado de concentraciones CURVAS DE CALIBRACIÓN Gráficos de A vs concentración de soluciones de concentración conocida (soluciones patrones o estándares) de la especie absorbente (estándar externo) A Pendiente =.b c (M) 53 Intrínsecas DESVIACIONES DE LA LEY DE BEER En general, se cumple en el rango de concentraciones de la especie absorbente < 0,01 M (mayores concentraciones implican distancias intermoleculares menores, por lo que una molécula altera la distribución de cargas de la adyacente, afectando su capacidad de absorción) depende del n del medio, el que cambia con la concentración de la especie absorbente Químicas Reacciones de la especie absorbente con el solvente, asociación, disociación Instrumentales Aplicable sólo para luz monocromática Presencia de radiación parásita (dispersión y reflexión en superficies internas del monocromador) Ruido 54 27
28 ESPECTRO DE ABSORCIÓN Representación gráfica de la Absorbancia en función de la longitud de onda de la luz incidente ( ) Característico de casa especie química (utilidad analítica) Permite conocer la máx, o sea, la longitud de onda a la que el analito exhibe máxima absorción La sensibilidad del método es mayor en la medida que es mayor, por lo que conviene utilizar máx del analito a la hora de realizar una curva de calibración 55 Espectro UV del benceno en estado de vapor Espectro UV del benceno en estado líquido (rotaciones y vibraciones restringidas) 56 28
29 ESPECTROS DE ABSORCIÓN DE PIGMENTOS VEGETALES 57 En la región visible, el color absorbido es el complementario del color de la muestra máx (nm) Color absorbido Color observado Violeta Verde amarillento Violeta azulado Amarillo Azul Naranja Verde Púrpura Azul verdoso Rojo Amarillo verdoso Violeta Amarillo Violeta azulado Naranja Azul Rojo Azul verdoso Púrpura Verde 58 29
30 INSTRUMENTACIÓN ESPECTROFOTOMETRÍA UV-V Diagrama de bloques de un espectrofotómetro Fuente de radiación Selector de M U E S T R A Detector Procesador de señal Registrador Espectro de absorción 59 FUENTES DE RADIACIÓN UV: Lámpara de deuterio / Lámpara de hidrógeno Rango de radiación útil: nm Mediante descarga eléctrica se excitan D 2 o H 2 a baja presión Generan espectro continuo en el rango UV Construídas con ventanas de cuarzo VISIBLE: Lámpara de filamento de tungsteno (wolframio) Rango de emisión: nm Rango de uso: nm Lámpara de tungsteno/halógeno Vapor de yodo Mayor vida útil Generan calor 60 30
31 SELECTORES DE Caracterizado por el ancho de banda (rango de que es capaz de seleccionar) Mayor eficiencia y selectividad a menor ancho de banda FILTROS No permiten barrer rangos de en forma continua De interferencia Anchos de banda > 1,5 nm De absorción Vidrios coloreados (región visible) Anchos de banda nm A menor ancho de banda menor transmitancia (menor potencia radiante) MONOCROMADORES Para variación continua de Útiles para UV, V e IR Alta pureza espectral (bajos anchos de banda) Distintos tipos: de Red (transmisión o reflexión), de prisma, etc. 61 RECIPIENTES PARA LAS MUESTRAS Cubetas o celdas deben ser de materiales transparentes a la radiación utilizada UV ( < 350 nm): cuarzo o sílice fundida Visible: vidrios de silicato, plásticos 62 31
32 DETECTORES o TRANSDUCTORES DE LA RADIACIÓN Detector ideal debe presentar: Amplio rango de Alta sensibilidad Elevada relación señal/ruido Respuesta constante Rápido tiempo de respuesta Señal eléctrica proporcional a potencia radiante 63 DETECTORES o TRANSDUCTORES DE LA RADIACIÓN DETECTORES DE FOTONES O FOTOELÉCTRICOS UV-V-IR cercano Células fotovoltaicas E radiante genera corriente en interfase semiconductor-metal Fototubos Radiación provoca emisión de electrones de superficie sólida fotosensible Tubos fotomultiplicadores Electrones procedentes de una superficie fotosensible, generan cascadas de electrones en una serie de otras superficies emisoras De Fotoconductividad Fotodiodos 64 32
33 TIPOS DE INSTRUMENTOS Colorímetro: Se mide la concentración de una solución problema, comparando su absorción de luz con la de una o varias soluciones estándares. El detector es el ojo. Fotómetro: Consta de fuente, filtro, detector fotoeléctrico, procesador de señal y sistema de lectura. No permiten obtener espectros por barrido continuo de. Espectrofotómetro: Utilizan monocromadores de rendija. Permiten obtener espectros de absorción por barrido continuo en un rango de. Espectrofotómetro con detector de arreglo de diodos: Permiten en una sola lectura obtener los valores de absorbancias a todas las dentro de un rango preestablecido. 65 ESPECTROFOTÓMETROS De simple haz De doble haz 66 33
34 67 34
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