incognita, Fusarium oxysporum y Ralstonia solanacearum UTILIZANDO MARCADORES

Transcripción

1 EVALUACIÓN DE GENOTIPOS DE TOMATE POR SU RESISTENCIA A Meloidogyne incognita, Fusarium oxysporum y Ralstonia solanacearum UTILIZANDO MARCADORES MOLECULARES TIPO SCAR CON FINES DE MEJORAMIENTO Rafael Morales Astudillo Dr. de Estado Natalia Morales Palacio PhD Iris Pérez Almeida PhD Dascon Hurtado Fernanda Biol.

2 PLAN 1. Origen 2. Variabilidad 3. Las especies existentes en el Ecuador 4. Fusarium y Ralstonia 5. Materiales y Métodos 6. Resultados 7. Conclusiones

3 Origen del tomate

4

5

6 Análisis climático

7 Diferentes especies de tomates S. pìmpinellifolium S. peruvianum S. chmielewskii S. L var. cerasiforme S. lycopersicum S. chesmanii S.habrochaites S. chilense S. penellii

8 Especies existentes en el Ecuador S. chemaniae S. lycopersicum

9 Materiales 160 materiales incluyendo: Solanum lycopersicum, Solanum lycopersicum var cerasiforme, S. pimpinellifolium, S. neorickii, S. habrochaites S. Chesmaniae

10 Los marcadores Se ha desarrollado un marcador tipo SCAR (Secuencia amplificada de una región conocida) ligado a este gen denominado Mi- 23, el cual es codominante, y amplifica un fragmento de 450 pb correlacionado con los fenotipos susceptibles de líneas de S. lycopersicum (mi/mi),

11 otro marcador de 400 pb con los resistentes (Mi/Mi) y ambos fragmentos (Mi/mi) con los heterocigotas (Seah et al., 2007); Pérez- Almeida et al., 2015). El marcador Mi-23F/Mi- 23R tiene la ventaja de que no se necesita emplear enzimas de restricción, no se amplifican falsos positivos en líneas resistentes a begomovirus, introgresadas de S. habrochaites y S. chilense, y pueden utilizarlo mejoradores que hayan introgresado otras características de resistencia ubicadas en la región Mi (Seah et al., 2007b).

12 Mejora Genética CASTRACIÓN DE LAS PLANTAS DE TOMATE

13 Fusarium oxysporum fs lycopersici La marchitez del tomate es causada por Fusarium oxysporum f. sp lycopersici (Sacc.) Snyder & Hans. Tres razas o patovares (1, 2, y 3) se distinguen por su virulencia en cultivares diferenciales de tomate que poseen distintos genes dominantes de resistencia (Mes et al. 1999).

14 La estrategia de control de patógenos más duradera y amigable con el ambiente consiste en desarrollar cultivares mejorados resistentes a la marchitez

15 Los parientes silvestres del tomate cultivado constituyen un rico acervo de genes de resistencia a estreses bióticos y abióticos, así como de otras características importantes para el mejoramiento del cultivo

16 es fundamental disponer de un germoplasma caracterizado morfológica, molecular y agronómicamente. Para realizar tal caracterización se han desarrollado gran cantidad de marcadores moleculares en tomate

17 La resistencia a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 0 (ex raza 1) se introgresó de S. pimpinellifolium y fue mapeada en el brazo corto del cromosoma 11 (Scott et al., 2004). Arens et al (2010) desarrollaron un marcador SCAR dominante At2-F3/At2-R3 el cual amplifica un producto de 130 pb en los materiales resistentes, mientras que una deleción de 7 nucleótidos impide amplificar productos en los susceptibles.

18 El gen dominante I-2 de tomate confiere resistencia contra las razas 1 y 2 del patógeno. El gen fue introgresado del tomate silvestre S. pimpinellifolium (Stall y Walter, 1965) y mapeado al cromosoma 11 (Laterrot, 1976). El locus I-2 posee varios miembros (Ori et al. 1997). El marcador SCAR codominante I-2/5F e I-2/5R fue específicamente diseñado en la secuencia del gen I-2 (Yu y Zou, 2008), distingue genotipos resistentes I-2 / I-2, con un fragmento de 693 pb; susceptibles i-2/ i-2, con 633 pb; y ambas bandas en los heterocigotas I-2 / i -2.

19 La acumulación de varios genes de resistencia en el mismo genotipo es importante pues favorece la resistencia horizontal, más difícil de romper por el patógeno y por ende más duradera en el tiempo

20 Ralstonia solanacearum Es un patógeno del suelo de gran importancia en las zonas tropicales y subtropicales, causa la enfermedad conocida como marchitez bacteriana. Están involucrados dos genes de resistencia heterocigotos y con dominancia incompleta, los cuales tienen efecto complementario. Se han ubicado dos marcadores dominantes tipo SCAR TSCAR AAG/CAT y TSCAR AAT/CGA, a 4.6 y 8.4 cm del gen de resistencia TRSR-1, respectivamente (Miaoet al. 2009).

21 marcadores moleculares tipo SCAR: asociados a la resistencia a: Meloidogyne incognita: Mi-23F/Mi-23R; Fusarium oxysporum f.sp. Lycopersici: At2-F3/At2-R3; I-2/5F/I-2/5R; P7-43DF3/P7-43DR1; P7-43DF1/P7-43DR1; Ralstonia solanacearum TSCAR AAT/CGA F/ TSCAR AAT/CGA R y TSCAR AAG/CAT F/ TSCAR AAG/CAT R

22 El locus I-3 introgresado de S. pennellii confiere resistencia a la raza 1, 2 y 3, fue mapeado al cromosoma 7 (Bournival et al. 1989; 1990). Aunque I e I-2 se han utilizado más con fines de mejoramiento (Scott, 2008), actualmente I-3 se prefiere dado que la raza 3 se está haciendo más común y existen pocos cultivares disponibles con el gen de resistencia I-3 (Foolad y Panthee, 2012). Los marcadores SCAR P7-43DF1/R1 y P7-43DF3/R1 se encuentran estrechamente ligados al gen I-3 en tomate (Barillas et al., 2008). Un gen I-7 adicional se descubrió recientemente portando resistencia a la raza 3 de F. oxysporum fsp lycopersici (González et al., 2015).

23 Extracción de ADN. Se colectaron hojas jóvenes de los materiales seleccionados para el análisis molecular. Las hojas se maceraron con mortero y pestillo de porcelana con 1 ml del buffer de extracción (100 mm Tris HCl ph 8.0, 1,4 M NaCl, 20 mm EDTA, 2 % CTAB, 1 % polietilenglicol y 0,5 % de sulfito de sodio) precalentado a 75 C (Risterucci et al, 2000; Pérez-Almeida et al. 2011), se transfirió el macerado a microtubos de 1,5 ml, incubando a 65 C por 20 min, a 550 rpm. Luego se dejaron enfriar a temperatura ambiente y se agregó 1 ml de cloroformo: isoamilalcohol en proporción 24:1. Después de centrifugar por 15 min a 14 mil rpm se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo y se agregó 1 ml etanol absoluto y 50 ul de acetato de sodio 3M ph 5.2, invirtiendo suavemente hasta observar la formación del pelet de ADN. Los microtubos se colocaron a 20 C por 12 h para recuperar el máximo de ADN. Se realizó un lavado con etanol al 70% y se secó el exceso de etanol colocando los tubos en una centrífuga a 45 C por 30 min. El ADN fue resuspendido en 50 ul de bufer TE 1X (100 mm Tris-HCl, 10 mm EDTA 0.5 M ph

24 PCR marcadores SCAR Mi23F: 5 -TGGAAAAATGTTGAATTTCTTTTG-3, Mi23R: 5 -GCATACTATATGGCTTGTTTACCC-3 At2-F3 5 -CGAATCTGTATATTACATCCGTCGT-3 ; At2-R3 5 - GGTGAATACCGATCATAGTCGAG-3

25 I-2/5F 5 - CAAGGAACTGCGTCTGTCTG-3 ; I-2/5R 5 -ATGAGCAATTTGTGGCCAGT-3 P7-43DF1 5 -GGTAAAGAGATGCGATGATTATGTGGAG-3 ; P7-43DF3 5 -CACGGGATATGTTRTTGATAAGCATGT-3 ; P7-43DR1 5 - GTCTTTACCACAGGAACTTTATCACC-3

26 Resultados Utilizando el marcador SCAR At2-F3/At2-R3 se observó que la mayoría de las accesiones analizadas mostraron la banda asociada al gen de resistencia I-1 (Figura 2), el cual se conoce como ligado a la resistencia en I-1 Los cebadores SCAR At2-F3/At2-R3 fueron diseñados para amplificar sólo en variedades con resistencia a Fusarium oxysporum fsp. lycopersici

27 Figura 3. Amplificación observada después de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el marcador molecular SCAR I-2/5F// I-2/5R. Materiales: (no amplificó); banda asociada a la resistencia; SEN (Sena), FLO (Floradae), 135, , 135.9, 69.3, 69.4, y 141.5, muestran bandas asociadas a susceptibilidad heterocigota. MM = Marcador de peso molecular 100 pb Promega

28 Figura 4. Patrón de bandas observado en la PCR con la combinación de cebadores P7-43DF3// P7-43DR1 asociada a la resistencia a Fusarium oxysporum fsp. lycopersici. Se observa que los materiales 19 y 20 muestran la banda asociada con la resistencia, mientras que el 26.1, la de susceptibilidad. El resto de materiales muestran una banda asociada a la heterocigosis, o fallan en amplificar. MM = Escalera de ADN 1kb; M2 = Escalera de ADN 100 pb, de Promega.

29 Amplificación por PCR al utilizar los cebadores TSCAR AAT/CGA F// TSCAR AAT/CGA R asociados a la resistencia a Ralstonia solanacearum. Todos los materiales con excepción de muestran una banda de aproximadamente 220 pb. MM = escalera de ADN de 100 pb de Promega.

30 MATERIAL Caracteres agronómicos Cruzamiento (origen genético) Tamaño de fruto (cm) 1 Respuesta molecular a enfermedades según patrón de amplificación 3 Califica ción 2 Mi 23 I1 I2 I3 (F3/R 1) I3 (F1/ R1) RS 1 RS 2 14,1 SLc x SL 8 (3) AR S R S S HT R R 21,1 SLc x SL 6 (3) AR S R S S HT R R 129,4 SLc x SL 10 (4) AR S na na na na na na 129,2 SLc x SL 10 (4) BR S R S S HT R R 136,3 SP x SL 3 (2) AR S R HT HT HT R R 145,2 SP x SL 2.5 (2) AR S R HT HT HT R R 69,3 SLc x SL 10 (4) MR S R S S S R R 69,4 SLc x SL 10 (4) BR S R S S HT R R 141,5 SLc x SL 8 (3) MR S R S S S R R 150,2 SLc x SL 5 (3) BR S R S HT HT R R 178,2 SP x SL 3 (2) MR S R HT HT HT R R 130,6 SLc x SL 10 (4) BR S R S S HT R R 90,6 SLc x SL 3.5 (2) MR S R S HT HT R R 55,5 SLc x SL 8 (3) BR S R S HT HT R R 120,1 SLc x SL 10 (4) BR S R na na na na na 37,1 SLc x SL nd (3) BR S R S S HT R R 61,3 SN x SL 12 (5) BR S R S S HT R R

31 78,2 SLc x SL 10 (4) BR S R S S HT R R 26,1 SLc x SL nd (2) BR S R S S S R R 83,6 SLc x SL 10 (4) BR S R HT HT HT R R 88,5 SLc x SL 8 (3) BR S R HT S S R R 121,4 SLc x SL 10 (4) BR S R HT S S R R 129,1 SLc x SL 11 (5) BR S R na na na na na 102,1 SP x SL 3 (2) BR S R HT HT S R R 143,3 SLc x SL 5 (3) BR S R S HT HT R R 135 SL 10 (4) BR S R S S HT R R 135,15 SLc x SL 5 (3) BR S R S S S R R 135,9 SLc x SL 5 (3) BR S R S S HT R R 142,3 SH x SL 10 (4) BR S R S na na na na 131,1 SH x SL 10 (4) BR S R S HT HT R R 55,2 SH x SL 5 (3) BR S R S HT S R R 179,3 SH x SL 3 (2) AR S R R HT S R R Cera ISA SLc 2,5 (2) - S R S HT HT R R Pimpi PA SP 1 (1) - S R R HT S R R PS3 SLc 1,5 (2) - S R R S S R R PS16 SLc 1,5 (2) - S R R S HT R R 19 SN - - S R S S R R R 20 SN - - S R S S R R R SENA SL 10 (4) - R R S S S R R FLORA SL 10 (4) - S R S S S R R SH PTE HT RIO SH - - S R S R R R SN (14) SN - - S R na na na na na SH RIO 20 SH - - S R S HT HT R R SH JB SH - - S R S HT HT R R

32 Conclusiones 1. Utilizando el marcador asociado al gen de resistencia Mi-1.2, se determinó que los materiales resultaron susceptibles, excepto los testigos comerciales con la banda asociada al gen de resistencia a nematodos. La mayoría de las accesiones analizadas mostraron la banda asociada con el gen de resistencia I-1, y las de susceptibilidad, heterocigocidad o resistencia asociada a los genes I-2 e I-3.

33 3. Los materiales analizados revelaron bandas asociadas a los genes de resistencia a R solanacearum. A través del uso de estos marcadores moleculares permitió diferenciar genotipos resistentes, susceptibles y heterocigotos en esta población 4. herramienta de análisis sencilla, eficiente y confiable para estimar la presencia o no de genes de resistencia en distintas accesiones de tomate, de acuerdo al patrón de amplificación con el marcador, facilitando el trabajo del fitomejorador.

34 Variedades en proceso de patentado

35 Gracias