CONTROL DE INSECTOS-PLAGA EN LA AGRICULTURA UTILIZANDO HONGOS ENTOMOPATOGENOS: RETOS Y PERSPECTIVAS

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1 CONTROL DE INSECTOS-PLAGA EN LA AGRICULTURA UTILIZANDO HONGOS ENTOMOPATOGENOS: RETOS Y PERSPECTIVAS Marily González-Castillo, Cristóbal Noé Aguilar y Raúl Rodríguez-Herrera* 1 Departamento de Investigación en Alimentos. Universidad Autónoma de Coahuila. Blvd. V. Carranza esquina Ing. José Cárdenas V. s/n. Col. República Ote. Saltillo 25280, Coahuila* rrh961@hotmail.com 42 RESUMEN El manejo de insectos plaga generalmente se ha realizado por medio de agentes pesticidas que entre otras cosas son tóxicos y contaminan el ambiente. Por este motivo en el presente documento se aborda la importancia de implementar nuevas estrategias de control de plagas a través del uso de microorganismos entomopatógenos, resaltando el empleo de hongos como grupo mayoritario y más comúnmente empleado para este fin. Introducción En la actualidad la producción de alimentos enfrenta el reto de mantener un alto nivel de calidad, considerando aspectos de inocuidad alimentaria y sistemas de producción con retribución más justa para los productores (García y González, 2010). En México son frecuentes e importantes los daños que causan plagas tan conocidas como el gusano cogollero del maíz, la mosca de la fruta, el picudo del algodonero y del manzano, las arañas rojas, las mosquitas blancas, las chicharritas o los pulgones que atacan a las plantas cultivadas (Alatorre y col., 2000). Para controlar este tipo de insectos se ha tenido que recurrir al uso de plaguicidas químicos sintéticos tales como los clorados, organofosforados y piretroides, los cuales fueron exitosos en el control de plagas en sus inicios, minimizando las pérdidas de las cosechas. Sin embargo, como consecuencia de su uso inadecuado e indiscriminado, pronto aparecieron problemas de resistencia de los insectos hacia estos productos, así como un rápido crecimiento de las poblaciones de plagas secundarias y alteraciones ecológicas, causando efectos indeseables en el medio ambiente y en la salud del ser humano. Esto ha ocasionado la prohibición o restricción de muchos insecticidas como el dieldrín, mirex, BHC, paratión etílico, toxafeno y DDT (Morales y col., 2009). Con el fin de minimizar estas consecuencias desfavorables, se ha propuesto disminuir el uso de los plaguicidas convencionales y desarrollar nuevas estrategias para un Manejo Integrado de Plagas (MIP), principalmente por medio del control biológico siendo este un método de control de plagas más racional y respetuoso con el medio ambiente y acordes con la filosofía de desarrollo sustentable (Badii y col, 2006). El MIP es una alternativa para disminuir la dependencia en el uso de insecticidas químicos sintéticos. Se basa en las prácticas culturales con orientación al control de plagas, la capacidad que tienen las plantas para tolerar o resistir sus daños y la acción de los factores naturales de mortalidad de las mismas, como lo son los parasitoides, depredadores y patógenos de insectos-plagas. Estas tres últimas son la alternativa de control más usada para sustituir el uso inadecuado de los insecticidas (Alatorre y col., 2000).

2 INSECTOS PLAGA QUE ATACAN LOS CULTIVOS EN MÉXICO Existen más de 100 especies de insectos atacando los cultivos en México, a continuación se describirán solo tres de los más importantes. El gusano cogollero del maíz, Spodoptera frugiperda (Lepidóptera: Noctuidae), es una de las principales plagas que atacan a los cultivos del maíz, puede ocasionar una reducción en la producción que va desde un 20 % hasta la pérdida total del cultivo desde las primeras etapas de desarrollo de la planta e incluso cuanto éste se encuentra en épocas de floración (Del Rincón y col., 2006). Este insecto hace raspaduras sobre las partes tiernas de las hojas, que posteriormente aparecen como pequeñas áreas traslúcidas; una vez que la larva alcanza cierto desarrollo, empieza a comer follaje preferentemente en el cogollo y al desplegarse, las hojas muestran una hilera regular de perforaciones a través de la lámina o bien áreas alargadas comidas (figura 1) (Soto, 2008). 43 Figura 1.- Daño causado por Sodoptera frugiperda en cultivos de maíz (Soto, 2008). La mosca blanca, Bemisia tabaci o Trialeurodes vaporariorum es un insecto plaga, perteneciente al orden Homoptera. Los cultivos que se ven más afectados por este insecto son: las plantas del tomate, chile, pepino, frijol y tabaco. Los daños que ocasionan comienzan cuando la mosca se instala en el envés de la hoja hospedante y tanto en estado adulto como larvario, comienzan a nutrirse de ella y deterioran el crecimiento de la misma. Debido a su facilidad para desplazarse de una planta a otra, e introducir su aparato bucal, llega a transmitir enfermedades vírales e incluso por su excremento, que forma una lámina pegajosa y produce el desarrollo de hongos (Alas Marroquín, 2000; González, 2009). El picudo del manzano, Amphidees latifrons, es un escarabajo de hábitos nocturnos, altamente destructivo. Las hembras ovipositan los huevecillos dentro de las yemas de los árboles, al eclosionar emergen larvas muy voraces que consumen todo el tejido celular, posteriormente hacen un agujero y caen al suelo enterrándose y comiendo raíces del mismo árbol hasta completar todo su ciclo larvario. Después el insecto pasa al estado pupal, naciendo los adultos en la primavera, los cuales suben de regreso al árbol para comer las hojas haciendo mordeduras en forma de U hasta el otoño, en los meses de noviembre a febrero en la ausencia de hojas, atacan las yemas vegetativas y florales causando anillamientos y la muerte de la rama del árbol (Dávila, 2007).

3 CONTROL BIOLÓGICO El estudio y aplicación del control biológico en México tiene una larga historia. Diferentes autores han tratado de documentar en diversas épocas el desarrollo de las actividades del control biológico como disciplina científica y estrategia fundamental en el manejo integrado de plagas (Rodríguez y Arredondo, 2007). Los insecticidas biológicos se usan en México desde hace 56 años, pero su aplicación se incremento significativamente desde 1990 (Morales y col., 2009). El Control Biológico es parte muy importante del MIP, ya que además de cuidar y reforzar la acción de los agentes que normalmente están presentes en el ecosistema (Alatorre y col., 2000) se desarrolla la manipulación deliberada de parasitoides, depredadores y patógenos de las especies plaga dentro del agrosistema, diseñada o proyectada para reducir la población plaga a un nivel que no produzca daños económicamente importantes (Badii y col, 2006). A partir del uso de insectos entomófagos para el control de insectos plaga, el control biológico se ha extendido al uso de una amplia gama de organismos para el control de insectos. Entre los organismos más utilizados como agentes de control se incluyen virus, bacterias y sus toxinas, hongos y otros microorganismos patógenos. Estos organismos generalmente tienen como efecto la muerte directa de la especie de insecto que atacan o actúan como antagonistas inhibiendo el desarrollo de otros microorganismos mediante sustancias que excretan (Rodríguez y Arredondo, 2007). 44 MICROORGANISMOS UTILIZADOS EN EL CONTROL BIOLÓGICO DE INSECTOS PLAGA Hasta el momento solo se conocen 3 especies de bacterias con posibilidad de ejercer control sobre insectos: Bacillus thuringiensis, Bacillus sphericus, y Bacillus popilliae. Sin embargo, estas especies presentan algunas subespecies y muchas razas que durante su proceso de esporulación producen cristales proteícos con efecto insecticida y/o algunas toxinas con el mismo efecto. Estas bacterias han sido encontradas colonizando insectos de los órdenes Díptera, Ortóptera, Hymenóptera y Coleóptera. Destaca el empleo de Bacillus thuringiensis para el control de larvas de lepidópteros que atacan a plantas agrícolas y forestales. Las familias de virus más comunes en el control de plagas son: Baculoviridae, virus de la poliedrosis nuclear que ataca Lepidópteros e himenópteros; Reoviridae, virus de la poliedrosis citoplasmática que ataca Lepidópteros y Dípteros; y Poxviridae virus entomopox que ataca Lepidópteros y Coleópteros. De los virus entomopatógenos, los baculovirus son los más utilizados con fines de control biológico, debido a que tienen un rango de hospedantes limitado a algunas especies de Lepidópteros, Hymenópteros, Dípteros, Coleópteros y Tricópteros. Se han encontrado hasta 450 especies de virus patógenos de insectos y ácaros (Badii y col, 2006). Particularmente, los hongos han sido una de las mejores alternativas para el control de plagas en los últimos años. Más de 750 especies de hongos se han documentado infectando insectos (National Academy of Sciences 1979). Entre los hongos más utilizados como insecticidas biológicos se incluye a Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin y Metarhizium anisopliae (Metchnikoff) Sorokin (Monzón, 2001; Rodríguez y Arredondo, 2007). Aproximadamente el 80% de las enfermedades que se producen en los insectos tienen como agente causal un hongo (Badii y col, 2006).

4 Los hongos entomopatógenos poseen características muy especiales que les permiten sobrevivir en forma parasítica sobre los insectos y en forma saprofita sobre material vegetal en descomposición. El crecimiento saprofito puede dar como resultado la producción de conidióforos, conidias y desarrollo miceliar, lo cual permite que el hongo pueda ser cultivado en el laboratorio utilizando técnicas de producción en masa de bajo costo (Alean Carreño, 2003). Prácticamente, todos los insectos son susceptibles a algunas de las enfermedades causadas por estos hongos (Cuadro 1). Se conocen aproximadamente 100 géneros y 700 especies de hongos entomopatógenos. Entre los géneros más importantes se encuentran: Metarhizium, Beauveria, Aschersonia, Entomophthora, Zoophthora, Erynia, Eryniopsis, Akanthomyces, Fusarium, Hirsutella, Hymenostilbe, Paecelomyces y Verticillium (Monzón, 2001). 45 Cuadro 1. Plagas de importancia económica controladas mediante hongos entomopatógenos (Monzón, 2001). Cultivo Plaga Hongo entomopatógeno Café Broca B. bassiana Minador M. anisopliae Repollo Plutella B. bassiana Plátano, algodón Picudos B. bassiana Arroz Chinches B. bassiana Ajonjolí M. anisopliae Caña de azúcar, pastos Salivazo M. anisopliae Papa Granos básicos Gallina ciega M. anisopliae B. bassiana HONGOS ENTOMOPATÓGENOS MÁS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE INSECTOS-PLAGA Beauveria bassiana. Este hongo ataca a más de 200 especies de insectos de diferentes órdenes, incluyendo plagas de gran importancia agrícola, entre las que están la broca del café, la palomilla del repollo y el picudo del plátano (Monzón, 2001). El género Beauveria está compuesto por varias especies: B. bassiana, B. brongniartii ó B. tenella, B. amorpha y B. velata, sin embargo las más frecuentemente estudiadas son B. bassiana y B. brongniartii (Alean Carreño, 2003). La colonia de Beauveria en PDA a los 14 días es algodonosa a polvorienta, blanca y a medida que va pasando el tiempo se vuelve amarillenta y cremosa. El revés es de color rojizo al centro y amarillento alrededor (figura 2). Se caracteriza por presentar conidióforos sencillos, aproximadamente de 1-2 µ de diámetro (Cañedo y Ames, 2004),

5 están irregularmente agrupados o en grupos verticilados, en algunas especies hinchados en la base y adelgazándose hacia la porción que sostiene la conidia, la cual se presenta en forma de zig-zag, después de que varias conidias se producen; las conidias son hialinas, redondeadas a ovoides y unicelulares (Alean Carreño, 2003), midiendo aproximadamente de 2 a 3 X 2 a 2.5 µ (Cañedo y Ames, 2004). 46 Figura 2.- Morfología macroscópica (A: Echeverría, 2006) y microscópica (B: Luque, 2011.) de Beauveria bassiana. Metarhizium anisopliae Este hongo entomopatógeno ataca naturalmente más de 300 especies de insectos de diversos órdenes. Algunas plagas que son afectadas por este hongo son la salivita de la caña de azúcar (Aeneolamia varia), y chinches plagas de diversos cultivos. Los insectos muertos por este hongo son cubiertos completamente por micelio, el cual inicialmente es de color blanco pero se torna verde cuando el hongo esporula (Monzón, 2001). Presenta una colonia pegada al medio, completamente redonda, de colores oliváceo, amarillento, verdoso, marrón oscuro, dependiendo del aislamiento, con un revés incoloro a marrón, a veces verdoso citrino (figura 3). Los conidióforos nacen del micelio y son irregularmente ramificados con dos a tres ramas en cada septo, miden de 4 a 14µ de longitud x 1.5 a 2.5 de diámetro. Las fiálides son cilíndricas en forma de clava, adelgazados en el ápice, miden de 6 a 13µ de longitud y de 2 a 4µ de diámetro. Las conidias son unicelulares, cilíndricas y truncadas, formadas en cadenas muy largas, hialinas a verde oliváceo, miden de 3.5 a 9µ de longitud x 1.5 a 3.5µ de diámetro (Cañedo y Ames, 2004). Figura 3.- Morfología macroscópica y microscópica de Metarhizium anisopliae (Pik-Kheng y col., 2009).

6 Nomuraea rileyi Este hongo ataca más de 32 especies de insectos de los órdenes Coleoptera, Lepidoptera y Orthoptera. Con mayor frecuencia se encuentra atacando lepidopteros, por ejemplo Spodoptera en maíz. El cuerpo de los insectos muertos por este hongo presentan un micelio blanco, que puede tornarse verde con la esporulación (Monzón, 2001).Posee conidióforos muy complejos que se ramifican a intervalos regulares que se levantan erectos y muy densamente agrupados para dar lugar a conidios verdes muy pálido que con el tiempo cambian a tonalidades hasta verde malaquita (figura 4). Las hifas son lisas y hialinas. Los conidióforos son cortos y anchos, las fiálides son redondas, cilíndricas a globosas con una base muy ancha (Elósegui, 2006). 47 Figura 4.- Morfología macroscópica (A: Aguirre N. 2006) y microscópica (B: Edelstein y Trumper, 2005) de Nomuraea rileyi. Paecilomyces fumosoroseus Se han reportado como mínimo cinco especies de Paecilomyces infectando ocho insectos diferentes. Las infecciones causadas por P. fumosoroseus se reconocen por el color rosado pálido mientras que en P. lilacinus son de color violeta claro. La especie más importante del género es Paecilomyces fumosoroseus (Alean Carreño, 2003). Sus colonias son inicialmente de color blanco en medio PDA, luego adquieren el tinte rosado característico. El revés de la colonia es al comienzo ligeramente amarillento, pero a medida que pasa el tiempo se vuelve de color anaranjado intenso (Cañedo y Ames, 2004). Paecilomyces fumosoroseus (figura 5) presenta hifas hialinas a amarillosas, septadas, de paredes delgadas. La mayoría presenta ramificaciones verticiladas o irregularmente ramificadas, llevan en su parte terminal en cada rama grupos de fiálides, las cuales pueden ser también solitarias, éstas constan de una porción basal cilíndrica o hinchada, adelgazándose abruptamente a menudo para formar un cuello muy notorio, miden de 5 a 7µ de largo x 2.5 a 3µ de diámetro, que se reduce a 0.5µ en el extremo superior. Los conidióforos alcanzan hasta 100µ de largo x

7 1.5 a 3µ de diámetro. Las conidias son hialinas, unicelulares y de forma ovoide, miden de 3 a 5 x 1 a 2µ y se observan agrupadas en cadenas largas (Carreño, 2003; Cañedo y Ames, 2004). 48 Figura 5.-Morfología macroscópica (A) y microscópica (B) de Paecilomyces fumosoroseus (Carreño, 2003). Verticillium lecanii. Este hongo se encuentra frecuentemente atacando áfidos y escamas en zonas tropicales y subtropicales. Además ha sido encontrado sobre insectos del orden Coleoptera, Diptera, Hymenoptera y sobre ácaros. Los insectos infectados por este hongo tienen una apariencia blanquecina (Monzón, 2001). El hongo en medio PDA presenta un color blanco amarillento compacto y revés amarillo intenso (figura 6). Los conidióforos de las especies de Verticillium son poco diferenciados de las hifas vegetativas, las células conidiógenas (fiálides) están en forma de verticilios de dos a seis, en parejas o solitarias sobre hifas o apicalmente sobre cortas ramificaciones, miden de 11 a 30µ de largo x l.5 a 2µ de diámetro, son ligeramente anchos en la base y van adelgazando hacia la punta. Las conidias de Verticillium lecanii son pequeñas, hialinas cilíndricas o elipsoidales y redondeadas en sus extremos midiendo de 2 a 4 x 1 a 1.5µ. Son uniformes en cuanto a forma y tamaño dependiendo del aislamiento. Estas conidias nacen en forma de gotas filamentosas o en cadenas (Carreño, 2003; Cañedo y Ames, 2004). Figura 6.- Morfología macroscópica (A) y microscópica (B) de Verticillium lecanii (Carreño, 2003).

8 MECANISMO DE INFECCIÓN DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS En forma general los hongos presentan las siguientes fases de desarrollo sobre los hospederos: germinación, formación de apresorios y estructuras de penetración, colonización y reproducción del patógeno. El inoculo o unidad infectiva está constituida por las estructuras de reproducción sexual y asexual, es decir las esporas y conidias (Monzón, 2001). El inicio de la infección se realiza por germinación de las esporas del hongo sobre el tegumento del insecto plaga. La dispersión de las esporas se realiza por contaminación ambiental a través del viento, suelo, la lluvia e incluso insectos enfermos al entrar en contacto con otros sanos (Giraldo, 2009). 49 Las características físicas y químicas de las superficies de la cutícula del insecto y la espora son las responsables de esta unión, algunas glicoproteínas pueden servir como un receptor específico para las esporas (Tanada y Kaya 1993). Luego se produce un tubo germinativo y un apresorio, con éste se fija en la cutícula y con el tubo germinativo o haustorio (hifa) se da la penetración al cuerpo del insecto (figura 7). Aquí participa un mecanismo físico y uno químico, el primero consiste en la presión ejercida por la estructura de penetración, la cual rompe las áreas esclerosadas y membranosas de la cutícula. El mecanismo químico consiste en la acción enzimática, principalmente por proteasas, lipasas y quitinasas, las cuales causan descomposición del tejido en la zona de penetración, lo que facilita el proceso (Monzón, 2001). Después de ésta fase se inicia el proceso de colonización, en el cual la hifa sufre un engrosamiento y se ramifica en la cavidad general del cuerpo. A partir de ese momento se forman pequeñas colonias del hongo y otros cuerpos hifales (blastosporas), sin embargo no ocurre gran crecimiento hifal antes de la muerte del insecto (Giraldo, 2009). Figura 7.-Estructura y composición de la cutícula de insectos y forma de penetración de hongos entomopatógenos (Montesinos, 2008).

9 Otra forma mediante la cual el hongo puede causar la muerte del insecto, es mediante la producción de toxinas. Los hongos entomopatógenos tienen la capacidad de sintetizar toxinas que son utilizadas en el ciclo de la relación patógeno- hospedante. Entre estas toxinas destacan las dextruxinas (demetildextruxina y protodextruxina) ya que su modo de acción también inhibe la síntesis de ADN, ARN y proteínas en las células de los insectos (Pucheta y col., 2006); además son sustancias de baja toxicidad, pero de mucha actividad tóxica sobre insectos, ácaros y nematodos (Monzón, 2001; Giraldo, 2009). 50 La muerte del insecto se produce con mayor rapidez cuando es afectado por un hongo que produce cantidades considerables de toxinas, ya que se adiciona la toxemia a la destrucción de los tejidos y a las deficiencias nutricionales. Los individuos enfermos no se alimentan, presentan debilidad, desorientación y cambian de color, presentando manchas oscuras sobre el tegumento, que corresponden con las esporas germinadas del hongo (Alean Carreño, 2003; Cañedo y Ames, 2004; Giraldo J. 2009). Con la muerte del insecto termina el desarrollo parasítico del hongo y empieza la fase saprofítica: el hongo crece en el hemocele formando masas miceliares que salen al exterior fundamentalmente por las regiones intersegmentales, esporulando sobre el cadáver y produciendo inóculo para infectar a otros insectos y por las aberturas naturales: espiráculos, boca y ano (Cañedo y Ames, 2004). Normalmente, los hongos entomopatógenos son de acción lenta. Pero estos productos dependen generalmente de las condiciones ambientales de temperatura y de elevada humedad relativa para que su desarrollo y acción patógena sea la adecuada. Generalmente tardan una semana como mínimo en eliminar a la víctima o al menos en que esta deje de alimentarse. Son adecuados para su aplicación por introducción, manipulación ambiental o aumento inoculativo (Giraldo, 2009). RETOS DEL USO DE MICROORGANISMOS PARA EL CONTROL BIOLÓGICO El desarrollo de productos basados en microorganismos para su uso como bioinsecticidas implica numerosas pruebas de laboratorio y de campo, para confirmar su presencia natural del microorganismos en el medio ambiente, su virulencia, factores medioambientales y su correcta identificación (Arredondo, 2007). Dentro de los agentes entomopatógenos se incluyen principalmente hongos, bacterias y virus, por su disponibilidad en el mercado, además de nematodos y protozoos en menor proporción (Dufour, 2001). Estos microorganismos por lo general, se caracterizan por su escasa toxicidad sobre otros organismos del ambiente, su aptitud para ser tratados de forma industrial, es decir, que se cultivan, formulan, empaquetan, almacenan y se comercializan como un insecticida convencional. Estos insecticidas biológicos penetran en el insecto plaga por ingestión y por contacto en el caso de los hongos (Badii y col, 2006; Giraldo, 2009). Los hongos entomopatógenos tienen un gran potencial para ser empleados como biocontroladores (Cañedo y Ames, 2004). Por ejemplo, los géneros Beauveria sp, Metarhizium sp y Paecilomyces sp tienen un amplio uso y aceptación por su especificidad y efectividad como insecticidas biológicos (Cañedo y Ames, 2004; Morales y col., 2009; García y González, 2010). Se suelen comercializar en preparados a base de esporas (Giraldo, 2009).

10 Los hongos entomopatógenos presentan grados variables de especificidad, pueden ser específicos a nivel de familia o especies muy relacionadas. En el caso de las cepas, pueden ser específicas a nivel de especie, sin afectar a los enemigos naturales (Alean Carreño, 2003; Cañedo y Ames, 2004). Si el entomopatógeno encuentra las condiciones adecuadas para introducirse y colonizar un ecosistema, se reproduce y renueva en forma continua, es decir, se vuelve persistente, haciendo innecesarias nuevas aplicaciones. Se pueden aplicar mezclas de hongos entomopatógenos con dosis subletales de insecticidas para lograr efectos sinérgicos superiores a los logrados con aplicaciones de cada producto por separado. Cuando el hongo no llega a causar la muerte directamente, se presentan efectos secundarios que alteran el desarrollo normal del ciclo de vida del insecto plaga (Cañedo y Ames, 2004). 51 PERSPECTIVAS DEL USO DE HONGOS ENTOMOPATOGENOS PARA EL CONTROL DE INSECTOS-PLAGA El aislamiento consiste en la obtención del hongo a partir de la fuente de inoculo, la cual puede ser insectos, plantas, suelos o medios artificiales como PDA o de preservación en seco como la sílica gel. A partir del aislamiento del hongo se procede a la inoculación de un medio de cultivo, para la obtención de un cultivo puro. Por tal razón se debe tener la seguridad de que el hongo aislado corresponde al de interés, además éste debe estar libre de contaminantes. El aislamiento de hongos entomopatógenos puede hacerse de dos maneras: por dilución seriada y de forma directa. El aislamiento por dilución seriada consiste en colocar un insecto infectado por hongos y esporulado en un recipiente que contiene 10 ml de agua destilada estéril con 0,1% de Tween 80. Como resultado se obtiene una suspensión concentrada del inoculo. A partir de esta solución, se preparan diluciones en serie (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 ). Para realizar la siembra y obtener los cultivos del hongo se deben usar las últimas diluciones (10-4, 10-5, 10-6 ). El aislamiento directo consiste en la obtención del hongo a partir del cuerpo del insecto, pasándolo luego a un medio nutritivo. Debido a que las muestras que se toman del insecto pueden estar sucias y contaminar el aislamiento se recomienda hacer una desinfección externa del insecto con hipoclorito de sodio (3-5 %), enjuagándose con agua destilada estéril. Este tipo de aislamiento puede ser de dos formas: raspando partículas del hongo en un insecto desinfectado, utilizando un asa bacteriológica y pasándola en un medio nutritivo o bien con una pinza seca y estéril se toma el insecto esporulado desinfectado y se agita con movimiento verticales y horizontales, sobre la superficie del medio de cultivo (Monzón, 2001). El aislamiento de hongos de suelos cultivados generalmente se realiza haciendo un muestreo del área de cultivo seleccionada, se toma alrededor de 0,5 Kg de suelo de los primeros cm de profundidad y con una distancia de 5 m entre cada una de ellas. Las submuestras se mezclan y se toma una muestra final de 0.5 Kg. El suelo se debe colocar en bolsas de plástico, manteniéndose a la sombra durante el traslado al laboratorio. En las muestras de suelo se colocan insectos trampa preferentemente aquellos que son altamente susceptibles a especies de hongos y nematodos entomopatógenos. Las larvas del insecto trampa se recuperan del suelo y se desinfectan superficialmente en hipoclorito de sodio al 1 %, se enjuagan en agua destilada estéril; se remueve el exceso de y se colocan en cajas de Petri con una capa doble de papel filtro, con el fin de producir una humedad relativa elevada y

11 para favorecer el desarrollo de los hongos y se incuban. Los hongos que se desarrollan sobre la superficie de las larvas se aíslan y se procede a su identificación (Gaitán, 2003; Quesada y col., 2007). Tradicionalmente, la identificación de hongos se basa en métodos fenotípicos como son: la morfología de las esporas (conidios) e hifas, o bioquímicos, como el perfil de proteínas extracelulares, los cuales son influenciados grandemente por la interpretación y dependen de un alto grado de especialización del analista y del ambiente. Las características morfológicas que se utilizan para la identificación de hongos son el tipo de crecimiento, forma y tamaño de la espora y tipo de estructuras reproductivas, lo cual muchas de las veces resulta insuficiente para la identificación certera a nivel de especie (Carrillo, 2003). La caracterización molecular, consiste específicamente en diferenciar individuos de interés según sus variaciones o polimorfismos en el ADN. Estos polimorfismos pueden darse debido a dos tipos de cambios principalmente: cambios en las bases nitrogenadas por adición, transición, traslocación o deleción, y reorganizaciones en la secuencia del ADN (Luna y col., 2001). Con el desarrollo de técnicas más específicas basadas en las diferencias en la información o configuración genética, ha sido posible aminorar estos errores, y brindar información más exacta y reproducible (Echeverría, 2006). El principal argumento a favor del uso de caracteres moleculares es que son universales. Existen genes presentes en todos los genomas celulares como los ribosomales, que pueden proveer de información para reconstrucciones filogenéticas, donde los caracteres morfológicos son inaplicables (Ochoa, 2008). 52 Las regiones que codifican para el RNA ribosómico (rdna) (Iturralde, 2005) se pueden encontrar en mitocondrias, cloroplasto y núcleo, y contiene la información para el RNA que conforma los ribosomas, por lo que es información que se transcribe pero no se traduce (Rentaría 2007). La principal razón para el estudio de rdna es que es un gen multicopia que contiene regiones que no codifican para proteínas, y que estas copias están repetidas en tándem, facilitando así su amplificación (Calle, 2005). En el DNA ribosómico existen fragmentos con distinto grado de conservación de una longitud cercana a 6Kb, lo que permite realizar estudios evolutivos a nivel de géneros y familias y suelen usarse para el diseño de iniciadores universales. La región del rdna en eucariotes incluye el gen 18S (también denominado small sub unit, SSU), el espaciador intergénico ITS1, el gen 5.8S, el espaciador ITS2 y el gen 28S (también denominado large sub unit, LSU). Las regiones 18S, 5.8S, 28S están relativamente conservadas entre los hongos, facilitando una base molecular para buscar relaciones filogenéticas a diferentes niveles. El tamaño pequeño del gen 5.8S limita su utilidad en comparaciones filogenéticas (Ochoa, 2008). La amplificación por PCR y la posterior secuenciación del gen 18S rdna para la caracterización de hongos presenta una serie de ventajas como son: está presente en todos los organismos y tiene la misma función en todos ellos; debido a restricciones estructurales, diferentes regiones de la molécula presentan distinto grado de variabilidad en secuencia, lo que permite realizar comparaciones con diferente nivel de resolución; su transmisión es principalmente vertical ya que se considera que no está sujeto a transferencia génica horizontal entre microorganismos; la longitud de su secuencia tiene un tamaño adecuado como para proporcionar suficiente información, con un coste asumible, y el análisis de la secuencia permite realizar reconstrucciones filogenéticas de los microorganismos (Nogales, 2005).

12 Por otra parte, los hongos presentan sensibilidad a la variación de las condiciones climáticas como temperaturas extremas, desecación y luz ultravioleta (Alean Carreño, 2003; Cañedo y Ames, 2004). Estas limitantes pueden ser contrarrestadas mediante el uso de aditivos (protectores solares, aceites y anti-desecantes). Por lo tanto, requieren de condiciones de almacenamiento más exigentes que las moléculas inorgánicas, para evitar que pierdan su patogenicidad. En general, los insecticidas biológicos no matan instantáneamente pero alcanzan buenos niveles de control entre una y tres semanas después de la aplicación, dependiendo de la plaga y del ambiente. Aunado a esto, el insecto deja de ser plaga al ser parasitado por el hongo, ya que deja de alimentarse mucho antes de morir, disminuyendo el daño al cultivo (Cañedo y Ames, 2004). 53 Referencias 1. Aguirre N Determinación del efecto de algunas Fuentes de carbón y nitrógeno, del ph y de la actividad de agua sobre el desarrollo de Nomuraea rileyi. Tesis de Licenciatura en Microbiología Industrial. Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias. Bogotá, D.C. pp Alas Marroquín G Evaluación de la efectividad de cuatro insecticidas biológicos para el control de ninfas de mosca blanca Bemisia tabaci, en el cultivo de melón Cucumis melo; finca Los Yajes, del municipio de Estanzuela, Departamento de Zacapa. Universidad de San Carlos de Guatemala. Centro Universitario de Agronomía Oriente. pp. 60: Alatorre R., Bravo H., Leyva J., Huerta A Manejo Integrado de Plagas. Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA), Subsecretaría de Desarrollo Rural, Dirección General de Apoyos para el Desarrollo Rural. pp Alean Carreño I Evaluación de la patogenicidad de diferentes hongos entomopatógenos para el control de la mosca blanca de la yuca Aleurotrachelus Socialis Bondar (Homoptera: Aleyrodidae) bajo condiciones de invernadero. Tesis de Licenciatura en Microbiología Agrícola y Veterinaria. Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias Básicas. Microbiología Agrícola y Veterinaria. Bogotá, D. C. Colombia. pp Badii, M. H., Abreu. J. L Biological control a sustainable way of pest control. International Journal of Good Conscience. 1(1): Calle J Caracterización morfológica y molecular de hongos fitopatógenos de suelo e identificación de bacterias foliares en el cultivo de cebolla. Tesis de Maestría en Agronomía. Recinto Universitario de Mayagüez. Universidad de Puerto Rico. pp Cañedo V., Ames T Manual de Laboratorio para el Manejo de Hongos Entomopatógenos. Centro Internacional de la Papa (CIP), Lima, Perú. pp Carrillo L Libro de Microbiología Agrícola. Capítulo 1. pp 20. Disponible en: 9. Quesada E., Navas J.A., Maranhao E.A., Ortiz A., Santiago C Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research.

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