Manual de Transferencia de Embriones en el Ganado B

Transcripción

1 Manual de Transferencia de Embriones en el Ganado B Octubre de 2006

2 Gobierno del Estado de Chiapas Lic. Pablo Salazar Mendiguchia Gobernador Constitucional del Estado Ing. Javier Antonio Ruiz Morales Secretario de Desarrollo Rural Dr. Fidelfo Rodriguez Fernandez Subsecretario de Ganaderia MVZ. Rafael Gonzalez Castellanos Director de Fomento Ganadero MVZ. Oscar Moguel Delarbre Jefe de Departamento de Vinculaci6n Ing. Napoleon Orantes Solorzano Coordinador General D.P.A.I. Secretaria de Agricultura, Ganaderia, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentacion MVZ. Jose Angel Del Valle Molina Delegado Estatal Ing. Israel de Jes6s G6mez Torres Subdelegado Agropecuario Ing. Carlos Antonio Toledo Culebro Jefe de Fomento Pecuario Fundacidn Produce Chiapas A.C. Sr. Hipolito Pedrero Alegria Presidente Ejecutivo Dr. Jorge Luis Zuarth Macias Secretario C.P. Araceli Ramirez Martinez Tesorera

3 Universidad Aut6noma de Chiapas MC. Jorge Ordofiez Ruiz Rector Dr. Hugo GuillCn Trujillo Secretario General Dr. Carlos Eugenio Ruiz Hernandez Secretario Academico Dr. Jos6 Alfredo Medina Melendez Director General de Extension MVZ. Adizain Alegria C6rdova Director de la FMVZ MVZ. Alfredo Castellanos Coutifio Secretario Acaddmico MC. Roberto R. Coutifio Ruiz Director de la Facultad de Ciencias Agron6micas Dr. Ramiro Ruiz Najera Secretario Academico MVZ. EPA Oscar Leon Velasco Coordinador General de Vinculacibn y Extensibn Universitaria Coordinadores y Responsables del Curso Cuerpo AcadCmico "BIOTECNOLOG~A Y MEJORAMIENTO GENETICO ANIMAL" Dr. Horacio Lebn Velasco MC. Horacio Ruiz Hernandez MVZ. Alfonso Ruiz Moreno MVZ. Alfonso Villalobos Enciso Colaboradores en la elaboraci6n del material didactic0 MVZ. Oscar Miguel Dominguez Galdimez Juan Luis Orantes Arrazate William Esponda Hernandez

4 I.. INTRODUCCION ANTECEDENTES DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES Fisiologia de la reproduccion Mecanismo de selection Agentes superovulatorios Metodos de sincronizacion de estros Tecnicas de Superovulacion Deteccion de Estro Insemination de las vacas donadoras y superovuladas Ill.. MEDIOS PARA LA COLECCION DE EMBRIONES Congelacion Molaridad Funcion de 10s crioprotectores Velocidad de enfriamiento Clasificacion de 10s crioprotectores Funcion del glicerol Funcion del etilenglicol Congelacion de embriones con glicerol Congelacion de embriones con etilenglicol Descongelacion de embriones con glicerol Descongelacion de embriones con etilenglicol Preparacion de medios IV.. COLECCION DE EMBRIONES Evaluacion Embrionaria Embriones transferibles Lavado de 10s embriones Transferencia de embriones Bipartition de embriones Micromanipulador Division artificial de 10s embriones Ventajas de la biparticion de embriones Mellizos Mecanismo de gemelacion Tasas de gemelacion en ganado lechero Freemartinismo V.. LITERATURA CITADA... 57

5 La reproduccion en 10s animales domesticos se ha incrementado su desarrollo gracias a la manipulacion de biotecnologias como la inseminacion artificial (IA) y la transferencia de embriones (TE). La eficiencia de estos procedimientos y de la posibilidad de mantener viables las celulas germinativas desde el momento de la coleccion hasta su aplicacion, desde el punto de vista cientifico cobra gran importancia. En este sentido, la congelacion de estas celulas ofrece una solucion practica para el almacenamiento prolongado de las mismas sin perder su viabilidad. La criobiologia tiene como objetivo el estudio de las causas de dafios celular durante la congelacion y descongelacion, asi como la implementacion de metodos disefiados para reducir o evitar ese dafio; de tal forma, que las celulas Sean capaces de continuar en forma normal su desarrollo completo despues de la descongelacion. La transferencia de embriones es una herramienta para el mejoramiento genetico del ganado y tiene como objetivo incrementar la tasa reproductiva de las hembras de alto valor genetico. La transferencia de embriones consiste en inducir un embrion en etapa de preimplantacion en el utero de la hembra denominada receptora, la cual se encargara de gestarlo y llevarlo al nacimiento. El embrion transferido puede ser fresco o congelado. Esta tecnica consiste en un tratamiento hormonal que se aplica a las hembras donadoras para inducir la maduracion y ovulation de un gran numero de ovulos (superovulacion). La congelacion de celulas embrionarias tiene por objeto interrumpir el metabolismo de forma reversible permitiendo de ese modo, su conservation durante un tiempo indefinido en estado solido, manteniendose la viabilidad del embrion despues de la descongelacion. La supervivencia depende esencialmente de las condiciones de cambio de fase del agua celular y de la eficacia de 10s crioprotectores. Con el uso de crioprotectores como el etilenglicol y el glicerol se podran definir nuevas estrategias, tanto en la congelacion de embriones como en el programa de transferencia de embriones en el ganado bovino.

6 OBJETIVOS. 1.- Actualizar y capacitar a 10s profesionales y estudiantes de la Medicina Veterinaria en Biotecnologia Reproductiva especificamente en transferencia de embriones en el ganado bovino como una herramienta para el mejoramiento genetic0 de la ganaderia. 2.-Promover la transferencia de tecnologia en materia de transferencia de embriones a 10s productores pecuarios y vincular la Universidad Autonoma de Chiapas con el subsector agropecuario del pais.

7 11.-ANTECEDENTES DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES La historia de la transferencia de embriones se remonta a 1890 cuando el ingles Walter Heape, realizo con exito la primera transferencia embrionaria en conejos. A partir de entonces se han informado transferencias embrionarias exitosas en todo tip0 de animales de granja. La comercializacion de tecnologia para la transferencia embrionaria comenzo en America del Norte. Una hembra (donadora) puede aumentar su numero de crias durante su vida al concebir de manera repetida y mediante la recuperacion de embriones al inicio de la gestacion y la transferencia de estos a 10s aparatos reproductores de otras hembras (receptoras) para completar la gestacion. Este procedimiento depende por completo de la disponibilidad de una fuente de embriones de calidad adecuada y el medio uterino propicio de la receptora al momento de la transferencia embrionaria (sincronia) (Hafez, 2000). El principal objetivo del transplante de embriones es incrementar la tasa reproductiva de una hembra de excelentes caracteristicas, fecundada con un tor0 de alta genetica (Aspron, 1992). La transferencia embrionaria se ha aplicado muy extensamente en la vaca; en consecuencia, la tecnologia ha avanzado con mas rapidez en esta especie. En 10s arios 60, la anestesia general y la laparotomia eran necesarias para la coleccion y transferencia de embriones bovinos, y en el Reino Unido y America del Norte esta tecnica se utilizo sobre todo para la rapida multiplication razas exoticas de carne importadas (Palomino eta/., 1998). La utilization de embriones junto a la inseminacion artificial en 10s programas de mejora genetica es una practica que ha venido difundiendose en forma creciente en 10s ultimos 20 aiios. Sin embargo, esta tecnologia que tiene un enorme potencial de mejora genetica, no ha tenido la difusion masiva que debiera en funcion de tal potencialidad. Las limitantes han sido tanto 10s altos costos de la misma, como la enorme variabilidad en la respuesta de 10s animales destinados a producir tales embriones. Lo anterior parece marcar limites economicos y biologicos en la tecnologia que no han podido ser superados en 10s ultimos 20 atios y que limitan su desarrollo.

8 La transferencia de embriones es una tecnica de rnanipulacion genetica y dentro del campo de la reproduccion tiene como proposito servir como herramienta en el mejoramiento genetic0 del ganado e incrementar el potencial reproductivo de hembras sobresalientes en lineas especificas de la reproduccion. Estro I 1 1 Transferencia ESQUEMA 1.- SELECCI~N DE DONADORAS Y RECEPTORAS PARA LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN EL GANADO BOVINO.

9 El utilizar embriones congelados permite aprovechar al maximo el potencial de una hembra; en virtud, que es posible congelar todos 10s embriones de excelente y buena calidad, ser transportados a cualquier pace del mundo en forma facil y economica. Por esto, la TE ha tenido un impact0 considerable sobre 10s programas de reproduccion en paises desarrollados desde 10s aaos 70's, esta influencia ha sido principalmente dentro del sector de razas puras con el objeto de aumentar el potencial reproductivo de hembras superiores y donde el alto valor comercial de sus crias ha justificado el gasto involucrado. Existen tres metodos de coleccion de embriones, dos quirurgicos y uno no quirurgico, el primer0 requiere de medicos, anestesistas y cirujanos, lo cual hace de esta tecnica algo impractico quedando en desuso. El segundo metodo consiste en una laparotomia por uno de 10s flancos usando anestesia regional y local. El tercer metodo es el no quirljrgico o transcervical, que actualmente es el mas usado. Con el desarrollo del metodo de coleccion de embriones no quirurgico, existe la posibilidad de la dispersion de esta tecnologia dentro de paises desarrollados. Una de las principales razones para el uso de la TE es el mejoramiento genetico y se puede superar algunas formas de infertilidad que puede surgir a consecuencia de fallas de fertilization debido a altas temperaturas. Este proceso puede ser usado para establecer bancos de embriones congelados y permitir la importancia de 10s mismos y por lo tanto la introduccion y transferencia del nuevo material genetico. LAVADO DE VACAS DONADORAS PARA LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES (METODO NO QUIRURGICO 0 TRANSCERVICAL).

10 Ciclo estral del ganado bovino. El ciclo estral es una serie de eventos hormonales que ocurren desde un period0 de estro hasta la manifestacion del siguiente. El estro es comunmente referido con el dia cero en el ciclo estral de la vaca, momento en el cual la vaca es sexualmente receptiva al toro. El ciclo estral en el ganado bovino tiene una duracion aproximada de 21 dias, con un interval0 de 17 a 24 dias para que sea considerado como normal. En el caso de las vaquillas el ciclo estral dura menos que en las vacas. El ciclo estral puede ser dividido en dos fases: la primera, llamada fase folicular que se caracteriza por que durante este tiempo ocurren las fases finales de desarrollo folicular. Esta fase es relativamente corta y dura aproximadamente de 4 a 5 dias, iniciandose con la regresion del cuerpo luteo (CL) y culminando con la ovulacion. La segunda o fase Iutea, es caracterizada por el desarrollo del CLy tiene una duracion de 16 a 17 dias. Los cambios anatomicos y fisiologicos que sufren 10s organos reproductivos durante estas fases son regulados por hormonas entre las que se encuentran. a) GnRH. Hormona liberadora de gonadotropinas que es producida a nivel hipotalamico. b) LH y FSH. Hormona luteinizante y foliculo estimulante respectivamente sintetizadas a nivel hipofisiario. c) Inhibina, estrogenos y progesterona que son producidos por el ovario. d) PGF,. Prostaglandina F, alfa-sintetizados en el endometrio. e) IGF-I. Factor de crecimiento parecido a la insulina numero 1 sintetizado en el higado. La duracion del estro en el ganado cebu es alrededor de 10 horas (h) per0 tiene un amplio rango de variacion que va de 2.2 a 18.4 h. Es conveniente mencionar que la duracion del ciclo estral puede verse alterada debido a ciertos factores como son; 10s cuerpos luteos de vida corta que son precedidos por foliculos deficientes en su desarrollo, asi como a las fallas que ocurren por muerte embrionaria temprana. Caracteristicas de la conducta estral Ademas de 10s tratamientos y tecnicas utilizados en la sincronizacion de estros, es importante considerar tambien que existen problemas para detectar con precision la

11 manifestacion de conducta estral, debido a la composicion, tamafio y orden social que se tenga en un grupo de hembras bovinas. Se ha observado que existe una relacion entre conducta estral y jerarquia en las hembras, cuando se encuentran en estro dentro de un grupo. Ademas del nljmero de estas que presentan estro al mismo tiempo. En efecto, una o varias hembras pueden presentar una conducta de dominancia sexual ante el grupo; es decir, presentar comportamiento activo, que consiste en conductas estrales hacia otras hembras. En un hato con vacas Indubrasil, se observo que el 60% de montas fueron realizadas por hembras que presentaban mayor jerarquia; sin embargo, aunque en menor proporcion, las hembras dominantes pueden ser montadas por hembras consideradas como inferiores dentro del orden social. De acuerdo a investigaciones realizadas, se ha observado que la vaca que monta, generalmente domina a la que es montada, encontrando que se pueden presentar 5.3 montas por una hora en vacas que se encuentran en pastoreo; en contraste, con 8.7 montas en promedio que presentaron hembras que se encontraban en condiciones de estabulacion. Esto puede ser un efecto de que al tener una alteracion de las condiciones ambientales en hembras que se encuentran en pastoreo, estas pueden suprimir la manifestacion de conducta estral. Asimismo, se ha observado que las hembras con una mayor dominancia dentro del grupo, inhiben el comportamiento sexual de sus compaaeras, dando como resultado que las primeras presenten mayor indice de comportamiento estral y social; ademas de interactuar con sus compafieras que son racialmente semejantes. Las variaciones que se pueden presentar en el comportamiento social y jerarquico, dependen de la hora en que se aplique el tratamiento para sincronizar, la hora en que se manifieste la mayor actividad sexual y de la observacion de estro. Ademas, existen efectos que controlan la forrnacion de grupos homosexuales, en donde una hembra podria dejarse montar por una de sus compafieras y no por la presencia de un macho. Otra variacion que se puede presentar en ganado Cebll cuando se encuentra en etapa estral, es un comportamiento de agresividad en algunas vacas, manifestando con topeteo, el cual puede ser de tipo no agresivo con la presentacion de caracteristicas como

12 bramido, lamer los genitales, roce corporal u oler otras regiones corporales de su compaaera que en ese momento tambien presenta estro. Ademas, las hembras tienden a presentar signos como inflamacion de vulva, hiperemia del vestibulo vaginal, eliminacion de moco filamentoso y arborizacion del moco cervical. Por otra parte, algunos investigadores tambien describen un efecto de bioestimulacion, dada por feromonas que se encuentran en el moco cervico-vaginal de las hembras que se encuentran en estro y que pueden estimular a otras hembras anestricas. Esto se corrobora con un posterior estudio realizado por Wright et a/. (1992) quienes demuestran que al manifestarse estro un grupo de hembras sincronizadas, estas pueden estimular la actividad ovarica de hembras no tratadas, acortando la duracion de anestro posparto. Efecto ambiental en la conducta de estro. Se ha observado que se presenta un alto indice de estros en hembras lndubrasil durante el transcurso de horas oscuridad, que en las primeras horas de luz. Sin embargo, la presencia de comportamiento estral en Bos taurus, es mas frecuente durante las horas de oscuridad y las primeras horas de luz, entre 1.30 y 7:00 horas. Por otra parte, las condiciones climatologicas elevadas al tropico, se pueden presentar en el ciclo estral con mayor regularidad en primavera que en otras estaciones del aao, observando que la determinacion de estros, solo puede presentarse alrededor del 30%. Esto se confirma con lo observado por Lozano et a/. (1 987) quienes indican un porcentaje similar en la deteccion de estros en 10s meses en que se incrementa el fotoperiodo. Particularmente en el ganado de tip0 Bos indicus y Bos taurus, se ha observado una actividad reproductiva continua durante todo el aao; aunque 10s cambios fisiologicos parecen alterarse, al efecto climatic0 de la estacion y fotoperiodo del aao. En cambio, Rice (1 988) menciona que vaquillas de la raza 60s indicus, son mas afectadas por el clima que el ganado de tip0 Bos taurus. Ciclos estrales cortos

13 Al reanudar la actividad ciclica despues del parto, 10s animales presentan uno o dos ciclos cortos, 10s cuales contribuyen a problemas de infertilidad durante 30 a 40 dias despues del parto. Cuando 10s ciclos estrales cortos ocurren, el cuerpo luteo regresa erroneamente antes de que se pueda enviar la seiial de que la gestacion ha comenzado. Esta regresion prematura del cuerpo luteo, aparentemente se debe a que durante este tiempo se presentan niveles altos de prostaglandinas F, alfa (PGF, ) producidos por el ljtero como parte de 10s mecanismos normales de la involuciisn uterina, por lo que la presencia de ciclos cortos y la involution uterina se encuentran intimamente ligados. Desarrollo folicular durante el ciclo estral. Dentro de un ovario, 10s foliculos se encuentran en diferentes estadios de desarrollo y han sido clasificados acorde al nllmero de capas de celulas que rodean al oocito, asi como por la presencia del antro. La clasificacion mas comljn divide a 10s foliculos en: a) Foliculo primordial. Estos foliculos se encuentran en gran numero en el ovario antes del nacimiento. En estos foliculos el oocito se encuentra rodeado por u n a capa de celulas foliculares aplanadas, llamadas tambien celulas de epitelio folicular escamoso. El diametro de 10s oocitos en la vaca varia entre 79 y 120 micrometros. b) Foliculo primario. El oocito se encuentra rodeado por una simple capa de celula cuboidales o poliedricas. Este foliculo, tiene un diametro aproximado de 150 micras. c) Foliculo secundario. El oocito esta rodeado por varias capas de celulas poliedricas o cuboidales, momento en el cual, las celulas de la granulosa desarrollan receptores para FSH y estrogenos. d) Foliculo terciario. El oocito esta rodeado por varias capas de celulas granulosas y el antro folicular esta formado. En vacas, la formacion antral inicia cuando el foliculo tiene un diametro aproximado de 0.5 mm. e) Foliculo de Graff. Este tip0 de foliculo se forma como resultado de la acumulacion de fluido folicular y hace que se extienda el antro, el oocito se ubica en la periferia del foliculo y se rodea por una acumulacion de celulas de la granulosa. El foliculo preovulatorio corresponde a esta clasificacion folicular. Debido a su talla, el foliculo grafiano maduro, emerge desde el ovario a la superficie en forma de ampula.

14 Etapas del ciclo estral Estro. En esta etapa la hembra acepta la monta del macho o de una compariera de hato. Esta conducta es determinada por un increment0 significativo de las concentraciones de estradiol, que es consecuencia del desarrollo de un foliculo y por la ausencia de un cuerpo Iuteo. En este momento las concentraciones de progesterona se encuentran en niveles basales ya que tuvo que haber ocurrido la regresion del cuerpo Iuteo. Durante el estro la hembra esta inquieta e interactua con sus comparieras (conducta homosexual). Por efecto de 10s estrogenos 10s genitales externos se edematizan y hay produccion de moco cervical. La duracion del estro es variable fluctuando de 8 a 18 h y es afectada por el tip0 de ganado y por las condiciones ambientales. El ganado tipo Bos taurus la conducta estral es muy repetible; sin embargo, factores ambientales tales como instalaciones con pisos de cement0 provocan que el estro se acorte y sea menos intenso. En contraste el piso de tierra permite una mayor actividad estral. En el ganado tip0 Bos indicus es mas variable la conducta y la duracion del estro. SIGNOS Y CONDUCTA ESTRAL EN EL GANADO BOVINO Metaestro Durante del metaestro ocurre la ovulation y se desarrolla el cuerpo luteo pasando por el estadio intermedio conocido como cuerpo hemorragico, el cual es un estado de transicion entre el foliculo recien ovulado y el cuerpo Iuteo. En esta etapa las concentraciones de progesterona comienzan a incrementarse hasta que alcanzan concentraciones mayores de 1 nglml, momento a partir del cual se considera que termina el metaestro y comienza el diestro. La duracion del metaestro es de 4-5 dias. Un evento hormonal que se destaca en este period0 consiste en la presentacion del segundo pic0 de secrecion de FSH que 101

15 mantiene una relacion directa con el inicio de la primera onda de desarrollo folicular Algunas vacas presentan un sangrado conocido como sangrado metaestral. Diestro PROCESO DE OVULACI~N (METAESTRO). El diestro es la etapa de mayor duracion del ciclo estral, en promedio de dias. Durante esta etapa el cuerpo lljteo mantiene su plena funcionalidad, 10s niveles de progesterona se mantienen arriba de 1 nglml. Concomitantemente a la funcion lljtea se observa una dinamica folicular intensa, ya que durante esta etapa se presentan ondas de desarrollo folicular con sus caracteristicas fases (reclutamiento, selection y dominancia); por este motivo durante el diestro se observan foliculos de diferente tamafio. Despues de dias de exposicion a progesterona el endometrio comienza a secretar PGF, alfa en un patrori luteolitico, el cual termina con la vida del cuerpo luteo y con la etapa de diestro. En terminos endocrinos cuando el cuerpo luteo pierde su funcionabilidad, es decir, cuando las concentraciones de progesterona disminuyen por debajo de 1 nglml termina el diestro y comienza el proestro. Cabe mencionar que durante esta etapa la LH se secreta con una frecuencia muy baja, y la FSH tiene incrementos que coinciden con el inicio de las ondas de desarrollo folicular. :.,;e"., - DIFERENTES ESTRUCTURAS OVARICAS (CUERPO HEMORRAGICO Y CUERPO LUTEO) El

16 Proestro: Etapa cuya duracion es de 3 a 4 dias, llamada tambien fase de crecimiento folicular, etapa en la que un nuevo foliculo empieza a madurar y con ello inicia el crecimiento de produccion de hormonas FSH y LH, que al actuar nuevamente a nivel del ovario ocasiona el desarrollo de un nuevo foliculo, este a su vez produce 10s estrogenos para desencadenar un nuevo estro. ESTRO METAESTRO DIESTRO PROESTRO ESTRO 0,6&Q Q Foliculo Foliculo ovulaclon Cuwpo Cuerpo luteo y foliculos Foliculo y cuerpo ovulatorio hernorragico luteo en DlAS DEL ClCLO Progcstcrona FSH - PCF2 alfa 0 Foliculos subordinadus Foliculos atr6sicos - - Estradiul 1.H - Olcada folicular a) Foliculo don~inante ESQUEMA 2.- CAMBlOS OVARICOS Y HORMONALES DURANTE EL ClCLO ESTRAL DE LA VACA

17 2.2.- SELECCION DONADORAS Es el principal paso a dar para el inicio del programa de transferencia de embriones y para esto se utilizan dos criterios intimamente ligados. El primero, el cual desea el productor es la eficiencia productiva del animal seglln su finalidad zootecnica y ligado a su capacidad genetica; per0 el mas importante es el criterio elegido por el tecnico el cual consiste en que el animal donante provenga de lineas fertiles, tenga un aparato reproductor y ciclo estral normal, sin antecedentes de partos distocicos y retenciones placentarias, no mas de dos servicios por concepcion y tener una edad de 3 a 10 atios (Elsden, 1980). En el aspect0 sanitario deberan de estar libres de enfermedades, especialmente aquellas que afectan la funcion reproductiva; segun la region deberan estar sometidas a un estricto programa de vacunacion y desparasitacion para garantizar un buen estado de salud. En el caso de las receptoras, practicamente seguimos 10s mismos puntos que en las donadoras, per0 se pueden emplear animales de cualquier raza o cruza (el cruzamiento aumenta la fertilidad), sin importar su procedencia, per0 teniendo en cuenta que se traten de animales jovenes, sanos con buen desarrollo corporal, especialmente la pelvis (ya que muchas veces tendran que parir becerros muy pesados), en perfecto estado nutricional, dociles y faciles de manejar y con una produccion de leche suficiente para criar hasta el destete su becerro (Aspron, 1992). La donadora puede ser una vaca o vaquilla, si se escoge una vaca esta debe de tener por lo menos 3 a 4 meses posparto. Si la futura donadora no se encuentra ciclando, se le puede inducir al estro con un implante de Norgestomet por 7-10 dias y aplicandole400 U.I. de gonadotropina serica de la yegua pretiada (ecg) al momento del retiro del implante. El primer ciclo de este tratamiento generalmente es de corta duracion, per0 el siguiente ciclo es de duracion normal. Una buena decision es que la vaca tenga por lo menos dos ciclos normales antes de comenzar el programa de superovulacion. En el caso de que se desee superovular una vaquilla, es necesario que esta tenga un peso vivo por lo menos de 350 kg, y que ya este ciclando normalmente. No es recomendable utilizar implantes de norgestomet en vaquillas de por lo menos de 350 kg. que aun no hayan empezado a ciclar, ya que cabe la posibilidad de que entre en anestro prolongado (Canseco, 1999).

18 C;, Seleccion y manejo de Receptoras SELECCI~N DE DONADORAS Las hembras receptoras deben de cumplir con determinadas caracteristicas sanitarias, nutricionales y reproductivas. Para la selection de esta se requiere de un balance entre las caracteristicas raciales y de factibilidad economica. La raza parece no tener una consideracibn significativa aunque 10s animales cruzados son mas fertiles (Elsden et a/., 1 986). La receptora debe ser una vaca con uno a tres partos o vaquillas bien desarrolladas de la raza y tip0 que se disponga, fertilidad probada capacidad materna, preferentemente de buena talla y con una historia de partos normales, de facil manejo, con condiciones de desarrollo corporal aceptables, deben de estar ciclando y por lo menos de 80 dias despues del parto (Reagan, 1993), control de sanidad y programas de concentraciones de receptoras de diversas explotaciones; es necesario establecer una cuarentena o en programas en particular en una explotacion es necesario examinar cada animal para algunas enfermedades como la Tuberculosis, Brucelosis, Anaplasmosis, Lengua Azul, y vacunar 10s animales nuevos contra Rinotraqueitis lnfecciosa Bovina, Diarrea Viral bovina, Leptospirosis y Clostridiasis. Ademas de controles de parasitos internos y externos (Elsden eta/., 1986).

19 En el aspect0 nutricional las receptoras deberan estar sometidas a un regimen alimenticio que permita el increment0 gradual de 500 a 900 g al dia y sales minerales a libre acceso ( Elsden eta/., 1986; Reagan, 1993). Las vacas receptoras preseleccionadas se determina su estado de salud y reproductiva, deben para lo cual es necesario una identificacion visible y permanente en el animal (arete, fierro marcador o tatuaje). Para posteriormente levantar controles por medio de tarjetas individuates de sus eventos reproductivos (Reagan, 1993). La palpacion rectal de las hembras se realiza para determinar su estado reproductivo, preferentemente anormalidades del cervix, cuernos uterinos, ovarios y diagnosticos de gestaciones tempranas y tomar decisiones del metodo para implementar el programa. En resumen Elsden y Seidel(1986), Reagan (1 993) citan que una receptora debe cumplir con 10s siguientes criterios. Buena condicion corporal. Vacas jovenes de 1 a 3 partos 6 vaquillas bien desarrolladas. Cruzas de Bos indicus y Bos taurus (FI), esta ultima de preferencia de razas lecheras. Fertilidad probada y el cervix debe ser pasable facilmente. Habilidad materna y que tengan un diagnostico previo de no preaez. Suficiente aporte de nutrientes, minerales y vitaminas liposolubles principalmente ADE. Deben ser identificadas con arete, fierro quemador o tatuaje. Programa de vacunacion y de desparasitacion con fundamento a 10s resultados del laboratorio de diagnostico. Libre de enfermedades infectocontagiosas Brucelosis, Tuberculosis, Leptospirosis, Tricomoniasis, Campilobacteriosis, Rinotraqueitis lnfecciosa Bovina (IBR) y DiarreaViral Bovina (DVB)..; 1 '"hr' 4% (c. I I i f A. - / SELECCI~N DE RECEPTORAS f \ :i k- E5

20 2.3.-Agentes superovulatorios La superovulacion es la induction de ovulaciones multiples mediante la disminucion de la atresia folicular con el uso de hormonas. Existen varios productos comerciales que se pueden usar en 10s programas de superovulacion, la mayoria estan basados en la de estimulacion folicular (Mombiela, 2000). En 10s bovinos la superovulacion puede ser provocada por diferentes preparados de actividad gonadotropica siendo 10s principales: la gonadotropina corionica equina (ecg) y la hormona foliculo estimulante de origen porcino (FSH-P) (Caral eta/., 1986). Segun Elsden (1980) el tratamiento mas utilizado en la actualidad es el de la aplicacion decreciente de FSH-P durante cuatro dias a una dosis de 280 mg. a 400 mg tomando como primer dia, el decimo a partir de la aparicion de estro y aplicando prostaglandinas sinteticas (PGF, alfa) el tercer dia de superovulacion (Cuadro 1). CUADRO 1.- SlSTEMA DE SUPEROVULACI~N CON FSH EN DOSlS DE CRECIENTE Dia Actividades am Pm 0 = ESTRO ESTRO FSH FSH FSH + PGF2x FSH ESTRO FSH FSH FSH + PGIS:! FSH ESTRO 14 I.A I.A La hormona FSH-P induce una respuesta superovulatoria mas uniforme y preferible que la lograda con la ecg(elsden, 1978).

21 2.4.- Metodos de sincronizacion de estros Como se menciono las inyecciones exogenas de FSH (ecg o FSH) tiene uso difundido en 10s programas de superovulacion multiple y transferencia embrionaria para incrementar la disponibilidad de embriones provenientes de animales de merito genetic0 superior. Las inyecciones subcutaneas o intramusculares de ecg o FSH por lo general estimula el crecimiento adicional de foliculos 10s cuales ovularan de manera espontanea sin necesidad de LH o hcg exogena en el ganado bovino. En virtud de que la FSH tiene una vida media mas corta (2 a 2.5 horas) que la ecg (24-72 horas). Por lo general es necesario dividir la dosis total, inyectar a intervalos de 12 horas durante tres a cuatro dias para estimular la misma cantidad de crecimiento folicular que resultaria de una sola inyeccion de ecg. Pese a la superioridad de la FSH, la ecg continlja utilizandose sola o combinada con antisueros, 10s cuales se unen y bloquean a cualquier exceso de ecg en la circulacion despues del inicio del estro. Sin embargo, el suero anti-ecg no tuvo ningun efecto importante en las cantidades de cuerpos luteos ode embriones (Hafez, 2000). Durante 10s ljltimos 10 aaos la Prostaglandina F, alfa y su analogo el Cloprostenol han contribuido de manera importante a la superovulacion, ya que la PGF, alfa no solo aumenta la flexibilidad para programar la superovulacion sino tambien representa un tratamiento excelente para la produccion de gran nljmero de embriones normales. El tratamiento superovulatorio puede iniciarse en cualquier momento entre el dia 6 del ciclo estral y la regresion natural del cuerpo lirteo; sin embargo, el mejor momento para el tratamiento en el ganado bovino es entre 10s dias 8 y 12 del ciclo estral (Hafez y Hafez, 2004). Prostaglandinas Las prostaglandinas derivan de 10s acidos grasos esenciales por oxidacion catalizada por enzimas, son agentes paracrinos de vida corta cuyas acciones estan mediadas por receptores especificos de la membrana plasmatica. Estas hormonas median la secrecion de GnRH, ovulacion, regresion del cuerpo Iuteo, maduracion del cuello uterino y el parto. Las prostaglandinas derivan del acido araquidonico, presentan 20 atomos de carbon0 y un anillo ciclopentano, las que se encuentran mas relacionadas con la reproduccion es la PGF2a y prostaglandina E,. Son transportadas en la sangre para actuar en un tejido blanco lejos del lugar de su produccion, ademas es el agente luteolitico natural que finaliza

22 la fase lutea del ciclo estral y permite el inicio de un nuevo ciclo estral en ausencia de fertilization. PROSTAGLANDINA NATURAL (DINOPROST TROMETAMINA) El proceso de luteolisis inicia con 10s estrogenos, estos preparan receptores para oxitocina en la mucosa del endometrio, evento que se da en la etapa del del diestro del ciclo, el cuerpo luteo (CL) en el dia 16 y 17 comienza a liberar oxitocina, esta se dirige a la membrana celular localiza su receptor y se lleva a cab0 el proceso de reacciones enzimaticas como la fosfolipasa A, para la sintesis de PGF,a e inician 10s pulsos que van de 6 a 8, 10s cuales llegan por via local o general y destruyen (lisis) al CL disminuyendo la concentracion de progesterona hasta hacerlo desaparecer. Existen prostaglandinas naturales y sintetica, las naturales son aquellas que tienen su estructura quimica y biologica parecidas a las que se producen en un ser vivo, ejemplo de esto se tiene (Lutalyse, Lab. Pfizer) las sinteticas su estructura quimica y biologica son modificadas a las que se produce en el organism0 animal Luprostiol (Prosolvin, Lab, Intervet). Esta hormona solo funciona cuando existe un cuerpo luteo funcional. Es importante realizar un diagnostic0 por palpacion o ultrasonografia para detectar la estructura y poder aplicar la PGF,a. LUPROSTIOL (ANALOGO SINTETlCO DE LA PROSTAGLANDINA F,ALFA)

23 Progesterona natural y progestagenos Ireland y Roche (1982), citado por Montiel (1996) indican que la progesterona y 10s progestagenos sinteticos suprimen el estro y la ovulacion, actuando a traves de un mecanismo de retroalimentacion negativa sobre la liberacion de la hormona luteinizante (LH), por lo mismo probablemente se reduce la frecuencia de 10s pulsos de esta hormona y se impide que algljn foliculo ovarico complete su desarrollo y ovule. Al retirar la hormona 10s foliculos de todas aquellas vacas tratadas completaran su desarrollo al mismo tiempo lo que provoca el estro sincronizado. lnicialmente la progesterona se aplicaba en inyecciones diarias haciendo poco practico el sistema. Mas tarde, Christian y Casida (1980) demostraron que las inyecciones de progesterona prolongaban la etapa del diestro por tanto tiempo como fueran aplicadas, al termino las hembras entraban en estro y ovulaban en forma sincronizada. Posteriormente se descubre 10s progestagenos via oral administrados en el alimento, el inconveniente es que no existe control precis0 del consumo de las dosis diaria para cada animal, lo que ocasiona respuestas variables en la sincronizacion. Aplicacion via oral El uso de progestagenos en el alimento como acetato de flurogestona (FGA): mg por dosis total, acetato de melengestrol (MGA): 11 a 60 mgldia, simplifica la administracion de la hormona, pudiendo controlar el final del tratamiento mediante el retiro del progestageno de la mezcla del alimento. La duracion puede ser de 7 a 14 dias de aplicacion. La desventaja seria que no todos 10s animales comen la misma cantidad de alimento y como consecuencia de la hormona. Dispositivos intravaginales En el mercado se encuentran dos productos: uno de ellos es el dispositivo en forma de espiral de acero inoxidable de liberacion controlada (PRID) con el 9% de progesterona del laboratorio Sanofi Animal Helt y el dispositivo liberador de droga interna (CIDR) con 1.9 g de progesterona del laboratorio Pfizer., ambos se aplican por periodos de 9 a 10 dias.

24 PROGESTERONA NATURAL - CIDR. LAB-PFIZER El porcentaje de vacas que entran en estro despues del tratamiento con el CIDR, depende de la etapa del ciclo estral en que se encuentre. Asi, el porcentaje que entra en estro es mayor si el animal se encuentra en el diestro tardio y mas bajo en el diestro temprano ya que en el retiro del CIDR algunas vacas todavia presentan un cuerpo lljteo funcional. lmplantes auriculares Se coloca debajo de la piel de la oreja, entre cartilago y piel en forma subcutanea durante 9 dias. El principio activo es el Norgestomet de 3 mg por dosis total, mas valerato de estradiol: 5 mg intramuscular (Crestar, Lab. Intervet), este llltimo se modifica, en algunos casos se aplica en otros no. El norgestomet ejerce un efecto sobre el aparato reproductivo y el hipotalamo, suprime la conducta estral y la ovulacion, Al retiro del implante se presenta la conducta estral y la ovulacion. Los animales presentan estro dentro de las 100 horas posteriores al retiro del implante. NORGESTOMET MAS VALERATO DE ESTRADIOL

25 El mecanismo de accion del progestageno junto con el estradiol es el de suprimir el estro por medio del implante de norgestomet y la inyeccion con valerato de estradiol. El valerato de estradiol causa atresia del foliculo antral, regresion del cuerpo lute0 y provoca el reclutamiento de un nuevo grupo de foliculos de 4-5 dias de la aplicacion del tratamiento, el norgestomet por si solo no afecta la forrnacion y funcion del cuerpo Iuteo natural ni la gestacion Tecnicas de Superovulacion La respuesta superovulatoria depende de muchos factores, como son: raza, condicion corporal, epoca del aao, produccion lactea, edad, numero de parto, hormona, dosis, regimen de colecta, dia del ciclo, superovulaciones previas y factor de individualidad del animal. Algunos factores pueden ser controlados, aunque parcialmente, en tanto otros no, lo que dificulta asignar una dosis adecuada a cada animal y predecir la respuesta. GANADO CON BUENA CONDIC16N CORPORAL PARA LA SUPEROVULACI~N. La superovulacion consiste en inducir el crecimiento extra de foliculos ovaricos mediante la aplicacion de gonadotropinas. La aplicacion de este tipo de hormonas permite rescatar de la atresia a un numero determinado de foliculos ovaricos de manera que estos puedan seguir su crecimiento y llegar a la ovulacion. Las gonadotropinas mas utilizadas son la hormona foliculo estimulante (FSH) y la gonadotropina corionica equina (ecg). Tambien se han utilizado en forma experimental extractos hipofisiarios de equino (HAP).

26 GONADOTROPINA CORldNlCA EQUINA (ecg) CON ACTIVIDAD DE LA HORMONA FOL~CULO ESTIMULANTE (FSH). La FSH esta compuesta por glucoproteinas, dos subunidades diferentes que contienen carbohidratos y que se hallan asociadas por uniones no covalentes, estas subunidades se denominan a y p, esta ultima le confiere la actividad biologica a esta hormona. La expresion de las gonadotropinas es modulada por factores hipotalamicos como la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH), por factores intrahipofisiarios.. _I. _ L - I.- <.-*!-I - _A!..!.-A.. I-I!-L-L! *---a: ---- I--::- 1-1 L--1- -Iprlnclpalrnenre 10s peprlaos acrlvlna y rollsrarlna y por rerroallrnenraclon gonaaal ranro ae hormonas esteroides como de peptidos. Los receptores de las gonadotropinas son mimmhrno An I- f-mil;- An rnrrnntnrne 3rrnnlnAne rrnn In nrntninn f2 I n hinein+neie A n I-e sudunlaaaes ae las gonaaorroplnas proceae ae la rraauccron ae las sudunlaaaes ae 10s RNArn, de modificaciones postraduccionales de las subunidades precursoras y del plegamiento y la combinacion de las subunidades, del empaquetamiento de la hormona madura y la secrecion de la hormona (Yen et a/., 2001). La hormona tiene un peso molecular de 33,000 daltons, actua en las celulas de la granulosa, celulas de Sertoli e hipotalamo, su funcion es el crecimiento folicular, mitosis de las celulas de la granulosa e interviene en la maduracion del foliculo y del ovocito. La FSH ha sido uno de las mas hormonas ensayadas para superovular y con las que se tienen mejores resultados. En general, se trata de extractos hipofisiarios proveniente de ovino y porcino parcialmente purificados, tiene una actividad biologica corta en el torrente circulatorio, no mayor de 3 horas, por lo que para que ejerza su efecto se tiene que aplicar cada 12 horas durante4 6 5 dias. El Folltropin-V (Lab. Vetrepharm-Canada) es un product0 comercial que tiene una purificacion en proporcion de LHlFSH de 1 :5, con dosis de 280 a 400 mg dependiendo la talla del animal ha demostrado proporcionar buenos resultados. La FSH producida por ingenieria genetica esta exenta de contaminacion con LH y no varia dependiendo del lote. La dosis total de FSH se divide en 8 fracciones en forma decreciente. 77

27 .- u-mr-r 'OLLTROP rr 4 PA.&. HORMONA FOLICULO ESTIMULANTE (FSH). NIH-FSH-PI I I I I I 1 I I I I nun plqmmpqq 00 A A A t 3 i I ii 1 ( i; I 1 ii l~~. F S 9 H' FSH FSH FsH i 53 11% ESTRO mq 30 mg, 20 ma PGFZs C 4-4 C SIWCRONILACION 1111 COLECCI~N SUPEROVU~~C~~N IA DE EMBRIONES - - UI yh. Prescntacion dcl astro 1 I Duracion dcl ostro m.-. 1 No do cuerpo~ lr~teos NO do embrlonos y ~vu~os I ' Ill!\L I c.1 ll 11\11 >\I) Ill I l'li/i*r - - ESQUEMA 3. DIAGRAMA DE LA SINCRONIZAC~~N, SUPEROVULACI~N Y COLECCldN DE EMBRIONES EN LAS VAQUILLAS DONADORAS. La ecg antes conocida como PMSG (Gonadotropina serica de la yegua preriada), tambien es una de las hormonas mas investigadas para superovular, esta hormona tiene una actividad biologica larga (48 a 72 horas), por su contenido de acido sialico es metabolizado lentamente y por lo mismo se aplica una sola vez. Su dosis varia de 1,500 a 3,000 U.I. y se aplica via intramuscular durante cualquiera de 10s dias del noveno y doceavo del ciclo estral. Esta hormona tiene la desventaja de que despues de haber causado la superovulacion sigue promoviendo el desarrollo de foliculos ovaricos, lo que causa una elevation exagerada de estrogenos que afecta la coleccion y calidad de 10s embriones.

28 2.6.- Deteccion de estro En un programa de transferencia de embriones, la deteccion de estros es uno de 10s aspectos mas importantes. Al empezar el programa podria ser suficiente observar calores de veces a1 dia; sin embargo, al finalizar la superovulacion se debe realizar las 24 horas del dia, tanto para inseminar a tiempo a las donadoras como para poder seleccionar las receptoras que entraron en estro en forma mas sincronizadas con las donadoras. MANIFESTACION DE ESTRO EN EL GANADO BOVINO Inserninacion de las vacas donadoras y superovuladas La recomendacion mas comun es inseminar las hembras donadoras 12 horas despues del inicio del estro y reinseminar 12 horas mas tarde. Esto se debe a que el animal superovulado las primeras ovulaciones ocurren mas temprano que en las hembras no superovuladas y se requieren de la presencia de semen viable durante el period0 en el que ovulan el resto de 10s foliculos ovaricos. El lapso entre la primera y la ljltima ovulation generalmente es de 12 horas. En algunos protocolos se han usado 2 dosis de semen, en la primera o segunda inseminacion artificial con el objeto de tratar de aumentar la fertilization de 10s ovocitos, aunque frecuentemente el precio de las dosis del semen es limitante. Rivera, (I 987) indica tres inseminaciones con dosis dobles a interval0 de 12 horas despues de iniciado el estro. Coelho y Acevedo, (1991) mencionan utilizar en vacas superovuladas dos inseminaciones 12 y 24 horas despues de iniciando el estro

29 INSEMINACI~N ARTIFICIAL EN EL GANADO BOVINO

30 Ill.- MEDlOS PARA LA COLECCION DE EMBRIONES La manipulacion de 10s embriones fuera del ambiente uterino significa un gran riesgo, para evitar esto, se busca eliminar 10s cambios bruscos en la constitucion de las sustancias que entran en contact0 con 10s embriones, pretendiendo igualar a las sustancias y secreciones existentes en el ambiente uterino. Las caracteristicas mas importantes en las soluciones utilizadas para este fin son: osmolaridad, ph, esterilidad y toxicidad. La osmolaridad es la medida de la concentracion total de sales y compuestos de peso molecular bajo en la solucion. Debe estar entre 270 a 310 miliosmoles por kilogramo, desviaciones a mayor o menor concentracion pueden causar dafios irreversibles al embrion. El ph debera mantenerse entre 7.2 y 7.6, aunque 10s embriones bovinos toleran desviaciones sustanciales del rango optimo durante cortos periodos de tiempo. La esterilidad de la solucion es muy importante, ya que la gestacion puede verse drasticamente disminuida dependiendo del tipo de microorganismos presentes. La toxicidad de algunos compuestos quimicos organicos o inorganicos puede dafiar y hasta destruir 10s embriones como la presencia de pequefias cantidades de ciertos metales, como plomo y mercurio. MEDlOS PARA LA COLECCI~N DE EMBRIONES El metabolismo de microorganismos contaminantes pueden alterar el medio y volverlo toxico para 10s embriones. La filtration de millipore ( micras), constituye el metodo idoneo para la esterilizacion de 10s medios, utilizando tecnicas y recipientes esteriles, ademas es importante la adicion de antibioticos y antimicoticos. Para lograr el ph fisiologico, algunos medios son amortiguados con carbonatos, es necesaria una atmosfera del5% de CO, para mantener la conservation de carbonatos y con ellos el ph. La solucion Hartmann modificada y solucion buferada fosfatada (PBS) Dulbecco, son las soluciones que constituyen 10s medios mas practicos para su uso en la transferencia de embriones en bovinos.

31 3.1.- Congelacion El agua es el constituyente principal de 10s fluidos biologicos, responsable del transporte interno de las sustancias quimicas esenciales. El agua pura se congela y forma cristales a O C, mientras que esta misma que contiene iones y otras sustancias en solucion lo hace a temperaturas mas bajas, dependiendo de la concentracion de tales sustancias. Conforme el agua de una solucion se congela, 10s cristales de agua pura que se forman van dejando mayores concentraciones liquidas de aquellas sustancias que estan en solucion. Este hecho aumenta la presion osmotica del resto del soluto, lo que puede determinar las lesiones de las celulas. Las principales consecuencias fisicas y quimicas de la congelacion son la separacion del agua pura de la solucion para formar hielo y la mayor concentracion de soluto resultante en el liquido residual. Estos hechos y sus efectos sobre las celulas se hallan influidos por el nivel y 10s tipos de agentes crioprotectores, por la osmolaridad y el ph del diluyente y por la rapidez de congelacion. Desde que Whittingham et a/. (1972) y Wilmut (1972) quienes usaron escalas de velocidad de enfriamiento lento (0, l-0.3 C/min) desde temperatura ambiente hasta -60 o - 80 C, se han hecho grandes modificaciones en las curvas de enfriamiento. En casi todos 10s trabajos publicados ultimamente se colocan 10s embriones directamente a -7"C, permanecen 10 minutos, se enfrian a "CImin hasta -35 C y se sumergen en nitrogen0 liquido. Este avance hoy dia es aplicado por todas las empresas e investigadores en el proceso de congelamiento de embriones el cual reduce el tiempo de congelacion a no mas de una hora. ESQUEMA DE LOS EVENTOS F~SICOS OCURRIDOS EN EL CONGELAMIENTO (HEXAGONOS REPRESENTAN CRISTALES DE HlELO DE DIFERENTE TAMAflO SEGUN LA VELOCIDAD DE ENFRIAMIENTO).

32 El mol, es la unidad de medida basica del sistema internacional de unidades, definida como la cantidad de una sustancia que contiene tantas entidades elementales (atomos, moleculas, iones, electrones u otras particulas) como atomos hay en'0.012 kg (12 g) de carbono 12. Esa cantidad de particulas es aproximadamente de X 1 o*~, el llamado nimero de Avogadro. Por lo tanto, un mol es la cantidad de cualquier sustancia cuya masa expresada en gramos es numericamente igual a la masa atornica de dicha sustancia. La molaridad se define como la cantidad de sustancia de soluto, expresada en moles, contenida en un cierto volumen de disolucion, expresado en litros, es decir: M = nlv. El nljmero de moles de soluto equivale a1 cociente entre la masa de soluto y la masa de un mol (masa molar) de soluto. Por ejemplo, para conocer la molaridad de una disolucion que se ha preparado disolviendo 70 g de cloruro de sodio (NaCI) hasta obtener 2 litros de disolucion, hay que calcular el nirmero de moles de NaCI; como la masa molar del cloruro de sodio es la suma de las masas atomicas de sus elementos, es decir, = 58.5 glmol, el nljmero de moles sera = 1.2 por tanto, M = 1.2/2= 0.6 M. La molaridad se define por la siguiente ecuacion: M = Molaridad = moles de soluto litros de disolucion Una disolucion 1.46 molar de glucosa, escrita como 1.46 M contiene I.46 moles de soluto de glucosa en un litro de la disolucion, una disolucion de 500 ml que contiene moles de glucosa tambien tiene una concentracion de 1.46 M. La unidad de molaridad es moles por litro, por lo que una disolucion de 500 ml que contiene moles de glucosa equivale a 1.46 molllo 1.46 M. La disoluciones son las mezclas homogeneas de dos o mas sustancias, la sustancia presente en mayor cantidad suele recibir el nombre de disolvente y a la de menor cantidad se le llama soluto y es la sustancia disuelta. El soluto puede ser un gas, un liquido o un solido y el disolvente puede ser tambien un gas, un liquido o un solido. El agua con gases un ejemplo de un gas (dioxido de carbono) disuelto en un liquido (agua). Existen distintas formas de expresar la concentracion de una disolucion, per0 las dos mas utilizadas son: gramos por litro (gll) y molaridad (M). Los gramos por litro indican la

33 masa de soluto expresada en gramos, contenida en un determinado volumen de disolucion, expresado en litros. Asi, una disolucion de cloruro de sodio con una concentracion de 40 g/l contiene 40 g de cloruro de sodio en un litro de disolucion Funcion de 10s crioprotectores Estos compuestos muy hidrofilos (en general polialcoholes) tienen la capacidad de penetrar facilmente en la celula por simple difusion (osmosis), sus moleculas retrasan la formacion de cristales de hielo por el descenso del punto de congelacion. Por otra parte, limitan 10s efectos de la solucion, eliminando una parte del agua intracelular por elevacion de la presion osmotica extracelular. En 1973 se dio a conocer la primera gestacion en bovinos producida con un embrion congelado/descongelado. Desde entonces se han publicado miles de articulos sobre experimentos que tratan diferentes aspectos de la criobiologia embrionaria, que han conducido, no solo a una mejora sustancial de 10s procedimientos para la congelacion embrionaria, sin0 aun mejor entendimiento de 10s fundamentos de la respuesta de 10s embriones a 10s procesos de congelacion y descongelacion de embriones. La criopreservacion y el almacenamiento de embriones a bajas temperaturas (nitrogen0 liquido) presentan numerosas ventajas, tanto desde el punto de vista biologico como desde el comercial. TERM0 DE NITR~GENO LIQUID0 PARA CONGELAMIENTO YALMACENAMIENTO DE EMBRIONES. Permite una reduccion de costos derivados de la aplicacion de las tecnologias reproductivas. Facilita una disociacion de todas estas tecnicas de la actividad reproductiva ciclica que presentan las especies mamiferas de interes, consiguiendose una