Programa de Especialidad en Hematopatología. Biología de las células mesenquimatosas TESINA. Que para obtener el diploma de

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1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN Programa de Especialidad en Hematopatología Biología de las células mesenquimatosas TESINA Que para obtener el diploma de Especialidad en Hematopatología Presenta: CÉSAR ERNESTO CÓRDOVA OBREGÓN Director: Dr. Jorge Vela Ojeda México, D. F., 2010

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4 El trabajo se desarrollo en el laboratorio de Investigación en Hematopatología del departamento de Morfología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. El sustentante utilizó durante su entrenamiento de especialidad el equipo donado por la Fundación Gonzalo Río Arronte a quien se hace patente su enorme agradecimiento.

5 Contenido Abreviaturas ii Índice de figuras y cuadros iii Resumen iv Objetivo 1 Justificación 1 Introducción 1 Célula madre embrionaria 1 Célula madre somática o adulta 3 Potencialidad celular 4 Células madre adultas presentes en la médula ósea 6 Células mesenquimales 7 Aplicaciones en enfermedad cardiovascular 11 Bases conceptuales de la terapia celular 15 Cardiomioplastía 17 Aplicaciones en daño neurológico 22 Conclusiones 25 Bibliografía 26 Glosario de términos 27 i

6 ABREVIATURAS Abreviatura Significado CD CSM CMM EA IAM MAPC MO SCU USSC Proteína de diferenciación Célula madre mesenquimatosa Célula madre mesenquimatosa Encefalomielitis autoinmune Infarto agudo del miocardio Célula progenitora adulta multipotente Medula ósea Sangre de cordón umbilical Células madre pluripotenciales sin restricción somática ii

7 Índice de figuras y cuadro Figura 1. Imagen de cultivo de células tallo mesenquimales 4 Figura 2. Imagen del cultivo e identificación de las células madre 8 mesenquimatosas (CSM) Figura 3. Imagen de una célula tallo adulta 9 Figura 4. Aislamiento de células tallo mesenquimales de sangre de 10 cordón umbilical de equino Figura 5. Imagen de la aplicación peri-infarto con células madre. 14 Figura 6. Imagen de la administración de células madre y precursores 19 endoteliales en infarto al miocardio. Figura 7. Cultivo de células mesenquimales. 23 Cuadro 1 Glosario de términos 25 iii

8 RESUMEN CARACTERIZACIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE MESENQUIMATOSAS Y SU APLICACIÓN EN LA MEDICINA Desde el punto de vista de su capacidad reproductiva y funcional, las células madre se han definido como aquellas que pueden dividirse simultáneamente para mantener por un lado su auto-renovación, con producción de células madre semejantes a ella y por otro, generar células hijas comprometidas con diferentes linajes que se diferencian en diversos tipos de células especializadas, no sólo morfológicamente, sino también funcionalmente. Además se le han añadido 2 propiedades funcionales: las capacidades de implantación persistente tanto en tejidos dañados como en sanos, se ha señalado la existencia de células madre adultas en varios sitios del organismo que incluyen médula ósea, sangre periférica, sangre del cordón umbilical, cerebro, médula espinal, tejido adiposo, pulpa dentaria, vasos sanguíneos, músculo esquelético, piel, tejido conjuntivo, córnea, retina, hígado, conductos pancreáticos, folículo piloso, tejido gastrointestinal y pulmón, las células madre mesenquimatosas fueron las primeras células madre no hematopoyéticas que se aislaron de la médula ósea. Entre sus características destacan su adherencia al plástico, el aspecto de fibroblastos fusiformes en cultivos no estimulados, expresión de marcadores específicos como SH2, SH3 y SH4 con ausencia de marcadores hematopoyéticos como CD45, CD34, CD11 y CD14. La facultad de las CMM para modular la respuesta inmunitaria, su capacidad para diferenciarse en neuronas, tejido cardiaco, óseo y otros han propiciado su investigación con buenos resultados en terapias para enfermedades cardiaca isquémica y neurológica. iv

9 Objetivo: Describir las características generales de las células madre mesenquimatosas, su papel en la terapéutica y su uso en algunas patologías cardíacas y nerviosas. Justificación Numerosas investigaciones se realizan sobre las células madre mesenquimatosas para el tratamiento de muchas enfermedades, con la esperanza de encontrar la cura para patologías incurables, por lo que la actualización constante es de suma importancia para el clínico y el investigador.

10 INTRODUCCIÓN Desde el punto de vista de su capacidad reproductiva y funcional, las células madre se han definido como aquellas que pueden dividirse simultáneamente para mantener por un lado su auto-renovación, con producción de células semejantes a ella, y por otro, generar células hijas comprometidas con diferentes linajes celulares que se diferencian en diversos tipos de células especializadas, no sólo morfológicamente, sino también funcionalmente. Además, se le han añadido 2 propiedades funcionales: la de implantación persistente tanto en tejidos dañados como en sanos, [Rice KN, Jamieson CH, 2010]. De acuerdo con su estado evolutivo, las células madre se clasifican en embrionarias y somáticas o adultas. Célula madre embrionaria Deriva del embrión de los mamíferos en su etapa de blastocisto y posee la capacidad de generar cualquier célula diferenciada en el organismo. Después de la penetración del espermatozoide, el óvulo fecundado adquiere la condición de cigoto, en el que durante su recorrido por la trompa de Falopio, se van produciendo sucesivamente distintos periodos de división celular que aumentan rápidamente el número de sus células, las cuales reciben el nombre de blastómeros. Aproximadamente a los tres días, el embrión tiene el aspecto de una esfera compacta que se denomina mórula y que contiene de 12 a 16 blastómeros. Alrededor de los 4 días llega a la cavidad uterina, y sobre los 5 días, comienza a introducirse líquido en su interior para formar una cavidad: el blastocele. En esta etapa, el cigoto se llama blastocisto y posee en uno de sus polos, una agrupación celular que recibe el nombre de masa celular interna o embrioblasto, que forma una prominencia dentro del blastocele. Las células que la integran dan origen a todos los tipos celulares, sistemas, tejidos y órganos del individuo en formación. Además, tiene una capa

11 celular aplanada que recubre la cavidad del blastocisto y la parte exógena del embrioblasto, la cual se denomina masa celular externa o trofoblasto, de donde deriva la placenta. [Rice KN, Jamieson CH, 2010] Hacia el final de la primera semana del desarrollo, el blastocisto humano ha comenzado su nidación en la mucosa uterina mediante la implantación en ésta de las células trofoblásticas que recubren el polo del embrioblasto. [Rice KN, Jamieson CH, 2010]. Un aspecto que debe quedar bien esclarecido es que las células de la masa interna no mantienen indefinidamente su capacidad de generación de cualquier tipo celular, pues éstas se van diferenciando progresivamente en los diversos tipos celulares durante la fase intrauterina del desarrollo. Sin embargo, cuando se extraen de su ambiente embrionario natural y se cultivan in vitro, sí son capaces de proliferar ilimitadamente y a su vez de mantener su potencial para generar células capaces de diferenciarse en cualquiera de los tejidos del organismo. En este estado es que se califican como células madre embrionarias.[rice KN, Jamieson CH, 2010]. Las células germinales no inician la diferenciación sexual hasta la mitad de la gestación; se conoce que hasta ese momento mantienen capacidad de diferenciación hacia diferentes líneas celulares. Las células madre germinales se ha aislado a partir de esas células germinales primordiales embrionarias y fetales, y tal como ocurre con las células madre embrionarias, éstas poseen una gran capacidad proliferativa que se hace evidente cuando se somete a cultivo. [Rice KN, Jamieson CH, 2010]. Célula madre somática o adulta Clásicamente se ha definido como una célula especializada dentro de la organización de las células de un tejido específico en un organismo ya formado, está restringida en su capacidad de diferenciación y es capaz de generar células del tejido que representa, a las que debe recambiar de forma natural. Se ha señalado que el

12 organismo sitúa a las células madre somáticas como parte de los mecanismos que emplea para su renovación en condiciones fisiológicas o ante un daño hístico. Sin embargo, en los últimos años, se han realizado varios estudios que han aportado resultados sorprendentes, pues sugieren que la potencialidad de algunos tipos de células madre adultas es mayor de lo esperado, ya que han mostrado en determinadas condiciones, capacidad para diferenciarse en células de diferentes linajes. Diversas informaciones han señalado la existencia de células madre adultas en varios sitios del organismo que incluyen médula ósea, sangre periférica, sangre del cordón umbilical, cerebro, médula espinal, tejido adiposo, pulpa dentaria, vasos sanguíneos, músculo esquelético, piel, tejido conjuntivo, córnea, retina, hígado, conductos pancreáticos, folículo piloso, tejido gastrointestinal y pulmón.[rice KN, Jamieson CH, 2010]. Figura 1. Imagen de cultivo de células tallo mesenquimales. Potencialidad celular La potencialidad representa la capacidad y posibilidades de diferenciación de células, y se manifiesta en el ámbito natural de acuerdo con el orden jerárquico de su

13 desarrollo. De acuerdo con su potencial de diferenciación, las células madre se han clasificado en: totipotentes, pluripotentes y multipotentes. [Rebelatto et al, 2009]. Las células madre totipotentes son aquellas que en condiciones apropiadas son capaces de formar un individuo completo, pues pueden producir tejido embrionario y extraembrionario. Así en el ciclo evolutivo posfecundación, el cigoto u óvulo fertilizado se considera una célula totipotente, capaz de dar origen a todo el organismo. Igual sucede con la etapa siguiente de mórula, en que todas las células son totipotentes. [Rebelatto et al, 2009]. Las células madre pluripotentes son las que tienen la habilidad de diferenciarse a tejidos procedentes de cualquiera de las 3 capas embrionarias. Aunque estas células por sí solas no pueden producir un individuo, ya que necesitan el trofoblasto, sí originan todos los tipos de células y tejidos del organismo. En esta categoría estarían las células provenientes de la masa celular interna del blastocisto. [Rice KN, Jamieson CH, 2010] En la categoría siguiente estarían las células madre multipotentes, que pueden diferenciarse en distintos tipos celulares procedentes de la misma capa embrionaria, lo que las capacitaría para la formación de tipos celulares diferentes, pero no de todos. Tradicionalmente, las células madre adultas se habían ubicado en esta etapa de la evolución celular. Sin embargo, en los últimos años, se ha hecho evidente que la potencialidad de algunos tipos de células madre adultas es mayor que la que habitualmente se le confería, pues se evidenció que podían diferenciarse en tejidos derivados de cualquiera de las capas embrionarias. Este fenómeno ha sido calificado como versatilidad de las células madre adultas, tomando en cuenta la flexibilidad que tienen algunas de ellas para formar células especializadas de otros linajes. Para esto se ha planteado que cuando su entorno natural es sustituido por otro, cambian su programa de diferenciación de acuerdo con la nuevas señales que reciben, por lo que se les ha asignado capacidad pluripotencial, y en este sentido, se asemejarían a las células madre embrionarias. Estos hechos contradicen el dogma clásico de la biología

14 celular respecto a la capacidad diferenciativa limitada de las células madre adultas. El cambio de programa de diferenciación podría estar relacionado con variaciones en las señales internas y externas que producirían las células al interactuar con todos los elementos constitutivos del nuevo microambiente, hábitat o nicho en que se situarían en el organismo. Entre esos elementos podrían considerarse, entre otros factores: proteínas promotoras e inhibidoras del ciclo celular, factores secretados por las células vecinas, interacciones intercelulares y con la matriz extracelular del tejido mediante proteínas de membrana. Recientemente se ha propuesto una explicación interesante para estos cambios, basada en las modificaciones que podrían suceder en diferentes fases del ciclo celular, en la modulación de la cromatina y en la variación de los receptores de membrana celular. [Rice KN, Jamieson CH, 2010]. En el orden jerárquico inferior se situarían las células unipotentes, que son aquellas que sólo se pueden diferenciar en un tipo celular, y que han sido calificadas en algunos trabajos como células de tránsito, células progenitoras comprometidas, o células precursoras. Finalmente, se encuentran las células diferenciadas, que son las que han alcanzado su plena maduración y una actividad funcional específica. Células madre adultas presentes en la médula ósea Durante varios años se consideró la célula madre hematopoyética como la única célula en la médula ósea con capacidad generativa y se pensaba que sólo era multipotencial. Sin embargo, estudios recientes han mostrado que la composición de la médula ósea es más compleja, pues en ella se han identificado un grupo heterogéneo de células madre adultas, entre las que se encuentran los tipos siguientes: Hematopoyéticas Mesenquimatosas (estromales)

15 Población lateral Células progenitoras adultas multipotentes (MAPC) Células mesenquimales En 1976, se informó que de la médula ósea se podían obtener células estromales con capacidad clonogénica. Con posterioridad, se describió en la médula ósea una población de células que presentaba una gran capacidad proliferativa y de diferenciación a varios linajes celulares. Estas células se denominaron células madre mesenquimales, las cuales se identifican habitualmente por las siglas MSC, del inglés mesenchymal stem cell. También se han llamado mesenquimatosas o mesenquimáticas. Por su procedencia del estroma de la médula ósea, otros las han llamado células madre estromales. Éstas fueron las primeras células madre no hematopoyéticas que se aislaron de la médula ósea. Entre sus características de destacan su adherencia al plástico, el aspecto de fibroblastos fusiformes en cultivos no estimulados, expresión de marcadores específicos como SH2, SH3 y SH4 con ausencia de marcadores hematopoyéticos como CD45, CD34, CD11 y CD14. Más recientemente se han añadido otros antígenos de superficie útiles para la identificación de las MSC, como son CD29, CD44, CD71, CD90 y CD106. [De la Garza Correa et al, 2007]. Las células mesenquimatosas o embrionarias pueden tener forma irregular, estrellada o fusiforme. Son células de citoplasma claro, basófilo, que se encuentran suspendidas en una matriz gelatinosa y que poseen prolongaciones citoplasmáticas que se unen entre sí. Las células mesenquimatosas (totipotenciales o pluripotenciales) dan origen a las células del tejido conectivo fibroso, células musculares lisas, células adiposas y células sanguíneas. En la vida posnatal, algunas de estas células conservan suficiente potencialidad mesenquimatosa como para poder convertirse, diferenciarse y restituir el tejido conectivo y los vasos sanguíneos dañados toda vez que sea

16 necesario; entonces reciben el nombre de pericitos, células adventicias, células mesenquimatosas indiferenciadas o células perivasculares. Figura 2. Imagen del cultivo e identificación de las células madre mesenquimatosas (CSM). Cultivo de células tallo mesenquimatosas a partir de la mucosa del útero por selección de células. Gargett y cols, 2007) El conocimiento de la dinámica celular asociada a la estría primitiva facilita la comprensión de la morfología detallada de las células mesenquimatosas. A medida que las células del epiblasto alcanzan la estría primitiva, cambian de forma y pasan a través de ella en su trayecto hacia la formación de nuevas capas de células por debajo del epiblasto. El desplazamiento de células por la estría primitiva tiene como resultado la formación de un surco (el surco primario o primitivo) a lo largo de la línea media de ésta. En el extremo de la estría primitiva se encuentra un pequeño, pero bien definido, cúmulo de células llamado nódulo primitivo o nódulo de Hensen. Esta estructura reviste enorme importancia en el desarrollo porque es el área a través de la cual las células epiblástcas en migración, se dirigen para formar una estructura redondeada y cordonal de células mesenquimatosas denominada notocorda. El movimiento de las células para pasar a través de la estría primitiva se acompaña de cambios profundos en su estructura y organización. Mientras están en el epiblasto, las

17 células tienen las propiedades de las células epiteliales típicas, con superficies apicales y basales bien definidas y se asocian como la lámina basal que subyace al epiblasto. Conforme entran en la estría primitiva, estas células se alargan, pierden su lámina basal y adoptan una morfología característica que ha conducido a que se las llame células en botella. Cuando se liberan de la capa epiblástica del surco primitivo, las células en botella adoptan la morfología y las características de las células mesenquimatosas, que pueden migrar como células individuales si se les suministra un sustrato extracelular apropiado. En esta transformación está incluida la pérdida de moléculas de adhesión celular específicas, a medida que las células pasan de tener una configuración epitelial a una mesenquimatosa. Figura 3. Imagen de una célula tallo adulta. Desde el comienzo mismo de la gastrulación, las células del epiblasto producen ácido hialurónico, que entra en el espacio entre el epiblasto y el hipoblasto. El ácido hialurónico, un polímero que consta de subunidades repetidas de ácido D- glucuorónico y N-acetilglucosamina, suelen asociarse con la migración celular en los sistemas en desarrollo. La molécula tiene una enorme capacidad de fijar agua (hasta mil veces su propio volumen), y su función es evitar que las células del mesénquima se agreguen y adhieran durante las migraciones celulares. Aunque después de que dejan la estría primitiva las células mesenquimatosas del mesodermo embrionario se

18 encuentran en un sustrato rico en ácido hialurónico, el ácido por sí solo no basta para mantener su migración desde la estría primitiva. Conforme pasan por la estría primitiva, las futuras células mesodérmicas del epiblasto cambian de morfología: dejan de ser células epiteliales del epiblasto para convertirse en células en botella y después en células mesenquimatosas. Las células del mesodermo extraembrionario forman el tallo corporal. La migración de las células mesenquimatosas durante la gastrulación se ve facilitada por las moléculas de la matriz extracelular como el ácido hialurónico y la fibronectina. Figura 4. Aislamiento de células tallo mesenquimales de sangre de cordón umbilical de equino. (a) Monocapa de células adherentes de forma fibroblastoides rápidamente expandidas compatibles con células tallo mesenquimales indiferenciadas ( 100). (b) Imagen de contraste tridimensional de un grupo de células adherentes rápidamente expandidas de forma espiculada y fibroblastoide compatible con la morfología de células tallo mesenquimales ( 100). Por muchos años se ha investigado el beneficio de las células madre (CMM) para reparar tejidos lesionados, con la esperanza de encontrar el tratamiento para patologías incurables.

19 Se han utilizado células madre in vitro para reparar el daño de tejidos neurológicos, cardiovasculares y hepáticos, se ha identificado una población novedosa de células mesenquimatosas llamada células madre pluripotenciales sin restricción somática (USSC), las cuales se diferencian in vitro en: osteoblastos, condroblastos, adipocitos y neuronas. En sangre de cordón se han encontrado células madre mesenquimatosas capaces de originar osteoblastos, condrocitos, miocitos, adipocitos, neuronas y células B, luego de que estuvieron cultivadas libres de suero y en medio suplementado con factor de crecimiento, además son células restringidas para la diferenciación y función dentro de las líneas celulares, lo que conlleva a grandes implicaciones terapéuticas. Los estudios han demostrado que estas células son capaces no sólo de diferenciarse en todas las células derivadas del proceso hematopoyético, sino de construir segmentos de corazón, nervios, huesos, tejido hepático. La sangre de cordón umbilical (SCU) posee mayor cantidad de células madre que la médula ósea y sangre periférica, las cuales proliferan y se diferencian más rápidamente. En SCU se encuentran células madre embrionarias, hematopoyéticas, endoteliales, mesenquimatosas (CMM), células madre pluripotenciales sin restricción somática. Las células embrionarias al ser trasplantadas a modelos murinos fueron capaces de formar un sistema inmune humano completo, dando origen células dendríticas, linfocitos T y B, órganos linfoides primarios y secundarios, así como producir respuesta con funciones inmunes humanas. [De la Garza Correa et al, 2007]. Aplicaciones en Enfermedad Cardiovascular El papel de las células madre en la regeneración miocárdica Durante el siglo XIX, Virchow y Schwann describieron que los tejidos de los mamíferos se encontraban compuestos por células, y por primera vez se afirmó que

20 las células se originan exclusivamente de otras células («omnis cellula a cellula»). En los comienzos del siglo XX, el concepto de célula madre tisular como base para la regeneración de tejidos fue introducido, analizando la filogénesis de la hematopoyesis en la médula ósea y basándose únicamente en observaciones morfológicas. Esta aseveración fue corroborada por diversos grupos en la década de los 50, que afirmaron la existencia de una célula madre hematopoyética en la médula ósea (MO), hecho que se confirmó con la recuperación de la hematopoyesis en la médula ósea trasplantada en pacientes con daño medular por radiación. Debido a que desde los años 60 se utiliza el trasplante de médula ósea, la célula madre (stem) hematopoyética ha sido la más estudiada. En 1976, Friedenstein y cols., reportaron que en los aspirados de médula ósea crecían en bajas diluciones, formando colonias de fibroblastos, y que éstos podían diferenciarse en hueso y cartílago. A pesar de que las células madre embrionarias de ratón se estudiaron desde el inicio de la década de los 80. Un año más tarde se obtuvieron las primeras células madre embrionarias de procedencia humana; este hecho marcó la pauta para las investigaciones relacionadas con la biología y diferenciación celular. Estos estudios han continuado hasta la presente década y el concepto de regeneración tisular proveniente de una pequeña población de células madre tisulares fue aceptado, y aplicado a tejidos no hematopoyéticos, como por ejemplo: médula ósea (MO) a músculo esquelético, MO a endotelio, células tallo neuronales a sangre, músculo esquelético a sangre, MO a pulmón, MO a cerebro, MO a hígado y MO a corazón. En el año 2001, Menasché y cols., reportaron el primer trasplante de mioblastos esqueléticos autólogos en humanos. En este mismo año, Orlic y asociados trataron experimentalmente la posible conversión de células madre a células miocárdicas. A lo largo de la vida de un individuo, de manera natural o por enfermedad, las células que forman sus tejidos sufren desgaste y/o degeneración que pueden comprometer a corto plazo, la vida del paciente o llevarlo hacia condiciones de incapacidad grave. Debido a esto, uno de los mayores desafíos para la investigación biomédica del siglo XXI, radica en desarrollar estrategias terapéuticas tendientes a reemplazar o reparar estas células y tejidos dañados. El incremento en la demanda de estas estrategias de

21 regeneración ha propiciado la formación de una nueva disciplina denominada medicina regenerativa o ingeniería en tejido, la cual tiene como objetivo el cultivo de tejidos humanos para sustituir a los dañados o perdidos, basándose en la autogeneración celular, combinando el uso de factores de crecimiento específico para cada linaje celular, esto es, disponer de células adultas con cierta indiferenciación, capaces de generar células más diferenciadas (transdiferenciación) que pueden reproducirse in vitro e in vivo, y que pueden ser autólogas o alogénicas.[rebelatto et al, 2009]. El miocardio contiene aproximadamente 20 billones de cardiomiocitos por gramo de tejido. El peso promedio del ventrículo izquierdo es de 200 g y contiene cuatro billones de cardiomiocitos. Las células progenitoras pueden tener origen en el embrión o en estructuras adultas, como las células satélites o mioblastos esqueléticos y células madre mesenquimatosas aisladas de la médula ósea. [Rebelatto et al, 2009]. El infarto agudo del miocardio (IAM) es por naturaleza una lesión irreversible, la cual comienza entre 15 a 20 minutos después de ocurrida la oclusión de la arteria coronaria. El miocardio subendocárdico es el más vulnerable a la isquemia debido a que posee una alta necesidad metabólica. La extensión del infarto depende de la duración y severidad del defecto perfusorio. Una vez que ocurre la agresión (oclusión de un vaso coronario), se produce un proceso de cicatrización con formación de una escara y remodelación que lleva a dilatación ventricular, con reducción de la función sistólica semanas o meses después del evento inicial, con el consecuente desarrollo de un síndrome de falla cardiaca debido a disfunción ventricular. Para causar insuficiencia cardiaca, un infarto necesita matar aproximadamente 25% del ventrículo, lo que equivale a un déficit aproximado de un billón de cardiomiocitos. [Goswami et al, 2010].

22 Figura 5. Imagen de la aplicación peri-infarto con células madre. Esta técnica posee la ventaja que asegura la llegada de CM a una zona clave como es el límite entre el miocardio isquémico y el viable. En el IAM, existen además alteraciones simultáneas de la matriz extracelular, la cual está constituida en un 80% por colágeno tipo I (responsable de la geometría del esqueleto ventricular y de la alineación de los cardiomiocitos) y en 10% por colágeno tipo III (responsable de la interconexión entre las células y del acortamiento sistólico). Después de un IAM, el colágeno tipo I se reduce a 40% y el colágeno tipo II aumenta a 35%, creando una fibrosis patológica. En modelos caninos, se ha estudiado la fisiopatología del IAM, así como la remodelación del ventrículo izquierdo. El proceso inicia con expansión temprana del infarto (cuatro días), seguida por resorción del mismo con formación de escara, y adelgazamiento de la pared (seis semanas). Miocitos necróticos, edema intersticial, hemorragia y células inflamatorias que son reabsorbidas y reemplazadas por escaras de tejido colagenoso, también existe repoblación en los bordes de las zonas del área infartada por células madre circulantes [Rebelatto et al, 2009]. La restauración temprana del flujo sanguíneo coronario epicárdico reduce el tamaño del infarto, proporcionando un efecto benéfico en el miocardio postinfartado y en la remodelación del ventrículo izquierdo. Sin embargo, la reperfusión temprana también ocasiona disfunción endotelial y extravasación de fluidos hacia el intersticio. Entender el curso natural del IAM y los efectos de la reperfusión temprana sobre el miocardio

23 lesionado, ha contribuido al desarrollo de nuevas terapias para la enfermedad cardiaca isquémica [Nahrendorf M et al, 2010]. Muchas de las terapias disponibles hoy en día pueden proveer al clínico de un pronóstico del evento. Aunque la angioplastia y los agentes trombolíticos pueden relevar la causa del infarto, el tiempo que va desde el momento en que ocurrió la oclusión hasta la reperfusión, determina el grado de irreversibilidad de la lesión miocárdica. Clínicamente, no existe medicación o procedimiento utilizado en el reemplazo de la cicatriz miocárdica con tejido contráctil funcional, por lo tanto, se necesita de nuevas terapéuticas de regeneración de cardiomiocitos normales (cardiomioplastia) [Nahrendorf M et al, 2010]. Bases conceptuales de la terapia celular Anversa y cols., reportaron la existencia de células madre cardiacas (CD117+) residentes en el corazón adulto, tanto normal como patológico, las cuales tienen capacidad de diferenciarse hacia células endoteliales, musculares lisas y cardiomiocitos funcionales; por lo tanto, son capaces de producir regeneración miocárdica después de un IAM. En pacientes que han sufrido IAM se ha encontrado aumento en el número de células CD34+ circulantes con un pico máximo a los siete días, lo que se cree representa una activación del mecanismo de regeneración ante una lesión del miocardio; sin embargo, como se ha mencionado anteriormente, el miocardio adulto por sí mismo es incapaz de reparar en forma efectiva su lesión después de un infarto, debido a la escasez de células progenitoras. Por esta razón, se han diseñado estrategias de trasplante celular para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca de etiología isquémica y no isquémica, con el fin de reemplazar las células destruidas por otras células que puedan realizar el trabajo cardiaco. Por otra parte, después del trasplante de médula ósea, las células madre hematopoyéticas han sido aisladas en diversos tejidos no hematopoyéticos, como músculo cardiaco, conductos biliares hepáticos y endotelio vascular. Variables como la edad, antecedentes de

24 enfermedad coronaria y/o de angioplastia precoz e infecciones, parecen influir en el número de las células que pueden movilizarse hacia la sangre periférica. Estudios experimentales y clínicos han demostrado que las células progenitoras derivadas de la médula ósea como las CMM, pueden utilizarse no sólo para regenerar cardiomiocitos, sino para producir angiogénesis debido a su plasticidad a través de mecanismos como transdiferenciación y fusión, que les permite desarrollar patrones, características estructurales y expresión de proteínas específicas, por ejemplo troponina y actina. Esto puede brindar la posibilidad de utilizar a las células madre para impedir el deterioro progresivo en el caso de la falla cardiaca, o para restaurar la función en pacientes con daño miocárdico agudo o crónico [Rebelatto et al, 2009]. Las células madre presentan dos características definidas: 1) capacidad de diferenciarse en un amplio espectro de diferentes tipos celulares y 2) capacidad de renovarse constantemente. [De la Garza Correa et al, 2007]. El principio biológico para entender la terapia celular es la diferenciación tisular dirigida; por ejemplo, células madre adultas aisladas de tejido hepático y reinjertadas en el hígado, se convierten en hepatocitos; sin embargo, las mismas células injertadas en el miocardio se convierten en miocitos. Este tipo de terapia ha sido utilizado en un espectro amplio de tejidos, incluyendo regeneraciones óseas y de tejido neuronal, distrofia de músculo esquelético y lesiones de músculo esquelético. No se encuentra bien definido como ocurre la migración de las células madre hacia el sitio de la lesión; sin embargo, se cree que ocurre mediante un complejo proceso multipaso. El primer paso del proceso es la movilización de las células madre (CMM). El estímulo puede ser debido a un factor de las células madre y/o factor estimulante de colonias de granulocitos y otras citocinas. Proteínas de matriz extracelular y enzimas proteolíticas que facilite esta movilización celular. Posteriormente, las células entran a la circulación sanguínea, existe expresión de moléculas de adhesión en el sitio de la lesión mediante ataque a la célula endotelial. La migración transendotelial es manejada entonces en parte por citocinas. Finalmente la diferenciación a tejido dentro

25 del órgano lesionado está probablemente influenciado tanto por el contacto célula a célula, como por factores de crecimiento [Zhang A et al, 2010]. Cardiomioplastia A pesar de que la revascularización quirúrgica o intervencionista del miocardio isquémico puede tratar los estados de angina, reduciendo el riesgo de IAM y mejorando la función del miocardio preexistente, la viabilidad del miocardio necrótico no puede ser restaurada. El término cardiomioplastia fue descrito por Chiu y cols, y tiene como objetivos: Reemplazar los miocitos necróticos dañados e hipofuncionales por miocitos funcionantes (miogénesis). Mejorar la angiogénesis y la vasculogénesis del corazón dañado. Limitar la expansión de la escara y de la dilatación ventricular, lo que potencialmente incrementa la contractilidad regional y mejora la función ventricular. Mejorar la función contráctil del corazón. El primer paso de la cardiomioplastia es realizar la elección apropiada de la estirpe celular que será utilizada para la regeneración miocárdica. Las células implantadas actúan produciendo miogénesis y/o angiogénesis. Los tipos de células utilizadas de manera experimental se han clasificado de acuerdo con su mecanismo de acción predominante [Rebelatto et al, 2009]: A) Inducción de miogénesis y/o cardiomiogénesis: Células musculares esqueléticas (mioblastos). Células mesenquimales de la médula ósea (CMM). Células embrionarias. Células musculares lisas. Cardiomiocitos fetales y neonatales. Cardiomiocitos atriales como marcapasos biológicos cardiacos.

26 Cardiomiocitos ventriculares adultos. B) Inducción de angiogénesis y arteriogénesis: Células mononucleares seleccionadas de médula ósea. Células mononucleares aisladas de sangre periférica. Células sanguíneas y/o medulares progenitoras endoteliales (CD34+ y CD133+). Células progenitoras del cordón umbilical. Células endoteliales vasculares (aisladas a partir de la íntima de arterias y venas). Células mesoteliales extraídas del epiplón. Células progenitoras extraídas del tejido adiposo. El reemplazo del miocardio infartado comienza con la inyección directa de mioblastos fetales y esqueléticos, con el fin de inducir el crecimiento de nuevas fibras musculares (repoblación celular) y el desarrollo de angiogénesis en el miocardio lesionado, restaurando la contractibilidad y, con esto, mejorando tanto la función ventricular sistólica como diastólica, previniendo la formación de una escara fibrótica, y con ello, el deletéreo patológico presente después de la remodelación del miocardio infartado. Este procedimiento puede aplicarse en pacientes que presentan insuficiencia ventricular postisquémica y en cardiopatías no isquémicas (incluyendo la chagásica). Estudios en modelos animales han demostrado que los cardiomiocitos, los mioblastos esqueléticos y las células de músculo liso pueden sobrevivir y proveer contractibilidad al miocardio necrótico una vez realizado el procedimiento [De la Garza Correa et al, 2007]. El tipo de célula más lógico para la terapia celular debe ser el cardiomiocito normal; sin embargo, se ha demostrado que el trasplante de cardiomiocitos adultos y fetales da lugar a injertos muy pequeños y, usualmente mueren después de ser implantados debido a su baja capacidad de división. Se ha reportado que las células madre (CMM) pueden transformarse en cardiomiocitos in vivo, basándose en el desarrollo de patrones, características estructurales, y la expresión de proteínas cardiacas específicas como son actina y troponina. [Rebelatto, 2009].

27 Figura 6. Imagen de la administración de células madre y precursores endoteliales vía cateterismo en infarto al miocardio. En la regeneración miocárdica pueden utilizarse diferentes tipos de células: mioblastos autólogos (células madre extraídas de músculo estriado), células madre derivadas de la médula ósea, células circulantes en sangre y células madre pluripotenciales; estas últimas tienen potencial para multiplicarse y diferenciarse en el tejido isquémico, tanto en células contráctiles como en células formadoras de vasos sanguíneos. Actualmente también se considera a las células mesenquimatosas de la médula ósea y células progenitoras circulantes en sangre [Hovatta O et al, 2008]. Entre la multitud de subtipos de células progenitoras, las CD133+ circulantes tienen un alto potencial para integrarse a tejidos isquémicos, contribuyendo a la curación por promoción de la angiogénesis local. Diversas investigaciones cardiovasculares han utilizado células madre adultas derivadas de la médula ósea, así por ejemplo, Fuchs y cols (2007) encontraron que la inyección intramiocárdica de médula ósea autóloga promueve la circulación colateral en miocardio porcino isquémico. El procedimiento incluye tres etapas: aspiración de la médula ósea del paciente, aislamiento y enriquecimiento de las células progenitoras mononucleares autólogas, y/o inyección intracoronaria (bajo anestesia local durante el cateterismo cardiaco) o intracardiaca (durante la cirugía de bypass de la arteria coronaria) de estas células. En la práctica clínica, las células de la médula ósea son fácilmente obtenidas mediante aspirado a través de la piel, la cual contiene células progenitoras multipotenciales que pueden

28 diferenciarse en varios tipos de células, incluyendo células miogénicas. Dentro de la médula ósea, una distinción simplificada es entre células madre hematopoyéticas (CD34+) que son precursoras de células sanguíneas y endoteliales, y células madre mesenquimatosas (CD34-), las cuales son precursoras de células de estroma, incluyendo fibroblastos y osteocitos. Las células CD34- se han clasificado como células madre multipotentes con base en su capacidad de diferenciación hacia ambos linajes. El conteo de células mononucleares circulantes CD34+ y los niveles plasmáticos del factor de crecimiento endotelial están significativamente incrementadas en pacientes con IAM, con picos después del día siete de presentado el evento [Kraus P, 2007]. Existen estudios que han demostrado que las células alogénicas trasplantadas sobreviven en el miocardio infartado después de seis meses. Para entender el destino de las células madre in vivo, las técnicas de imagen han sido propuestas y evaluadas en un limitado número de modelos celulares. Una técnica es el marcaje celular con el radionúclido F-18 fluorodeoxiglucosa, la cual tiene como limitante para ser utilizada en las primeras horas del trasplante, su vida media corta (alrededor de 110 minutos). Otra técnica utilizada es la resonancia magnética de las células madre marcadas con partículas de óxido de hierro o con agentes perfluoropolieteres, los cuales tienen como desventaja proporcionar una localización anatómica detallada incapaz de cuantificar la actividad de señal celular, debido a efectos de dilución durante la división celular. Además, estas técnicas no permiten distinguir entre células viables y no viables. Una tercera modalidad es el reporte de la imagen genética mediante tomografía de emisión de positrones [Kraus P, 2007]. La cardiomioplastía celular es una terapia innovadora cuyo objetivo es inducir la angiogénesis y el crecimiento de las fibras musculares para la remodelación post isquémica. Las CMM en las miofibrillas participan en la regeneración del músculo esquelético al ser activadas cuando se ha presentado daño tisular, pero ésta población decrece al aumentar la edad. [Hovatta O et al, 2008].

29 En modelos animales se ha demostrado la migración selectiva de CM de SCU a tejido dañado, aumento de la densidad de los capilares en el sitio de la lesión, aumento de la miogénesis, reducción del tamaño y fibrosis de las cicatrices, mejoramiento del grosor de la pared del ventrículo, recuperación de la elasticidad regional y por ende, la recuperación de la viabilidad del miocardio. La movilización de CMM en el tejido cardiaco lesionado y la diferenciación a nuevos cardiomiocitos, son los procesos que conllevan a la regeneración cardiaca. Sin embargo, la proliferación de mioblastos es controlada por las células laterales al secretar la proteína morfogénica de hueso [Rebelatto et al, 2010]. Métodos por los cuales se puede administrar las CM * Infusión Intravenosa de CM: contraindicada en pacientes que presentan isquemia crónica. * Infusión de células por el seno coronario. * Infusión intracoronaria. * Administración transepicárdica: 1*10 6 por Kg de peso de SC. Método más utilizado actualmente. * Inyección transendocárdica: por canulación de arteria femoral e introducción de catéter a ventrículo izquierdo, se recomienda el uso de CM de médula ósea para disminuir el riesgo de presentar arritmias ventriculares y muerte súbita. Las células madre mesenquimatosas de médula ósea evitan el remodelado cardiaco promoviendo factores que disminuyen la extensión del infarto o mejoran la angiogénesis en las zonas isquémicas crónicas. Se demostró que las CMM de SCU fueron inducidas para la diferenciación en células endoteliales y que una población de células pluripotenciales contenidas en esta sangre son capaces de activar a las células como CD34+, CD133+ y CD45- para inducir la reparación cardiaca post infarto, además, la liberación de factores de crecimiento tales como VEGF, EGF y angiopoyetina-1,2 fueron inducidas por hipoxia [Rebelatto, 2010].

30 Aplicaciones en daño neurológico Las células madre son poblaciones celulares heterogéneas, eso significa que poseen propiedades diversas y dispares. A menudo se les considera erróneamente, como capaces de reparar casi todos los tejidos gracias a su capacidad para diferenciarse en células de todos los tejidos corporales. Ante estas expectativas, las células madre se han propuesto como una fuente de células para la reparación de tejidos en distintos campos de la medicina regenerativa, incluida la neurología [Herranz et al, 2010]. Los linfocitos T y B forman parte del sistema inmunitario del organismo. Ambos tipos de células desempeñan una función ante las agresiones que sufre el cuerpo: los linfocitos B producen anticuerpos y los linfocitos T movilizan otras células como parte de la respuesta inmunitaria. En la enfermedad de la mielina el organismo desencadena una respuesta inmunitaria anómala en la que los linfocitos T y B autoreactivos localizados en el SNC, reconocen los propios antígenos de la mielina como cuerpos extraños y atacan y destruyen a las células que producen esta sustancia, la destrucción de la mielina genera una alteración de la conducción nerviosa y, a largo plazo lesiones neuronales que constituyen la base biológica de una incapacidad irreversible. El tratamiento ideal de la enfermedad de la mielina debería tener como diana los linfocitos autoreactivos, proteger el tejido agredido en el SNC y promover su reparación [Park DH et al, 2007]. Estudios recientes efectuados en el marco de la encefalomielitis autoinmune (EA) experimental, una enfermedad animal que es similar a la enfermedad de la mielina, ha permitido demostrar que las células madre mesenquimales (CMM) podrían ser capaces de lograr la reparación del tejido nervioso [Park DH et al, 2007].

31 Figura 7. Cultivo de células mesenquimales. A) Células madre mesenquimatosas de médula ósea al adherirse y formar colonias. B) Diferenciación hacia el linaje neural. En condiciones experimentales las CMM tienen la facultad de diferenciarse en otros tipos celulares incluso neuronas. En fecha más recientes diversos estudios han demostrado que las CMM pueden influir en las funciones de las células del sistema inmunitario, entre ellas lis linfocitos T y B activados. En presencia de CMM los linfocitos y otras células inmunitarias no proliferan y no pueden sintetizar citocinas inflamatorias, los mensajeros que desencadenan la referida respuesta inmunitaria anormal. La facultad de las CMM para modular la respuesta inmunitaria y su aparente capacidad para diferenciarse en neuronas, ha propiciado su investigación como posible tratamiento de la enfermedad EA [Park DH et al, 2007]. La inyección intravenosa de CMM en ratones con EA propició una sorprendente mejoría del curso clínico de la enfermedad y redujo la inflamación y la desmielinización. Este efecto benéfico se observó en ratones que fueron tratados poco después de la aparición de la enfermedad, y estuvo asociado con una moderación de la respuesta de los linfocitos B y T contra los antígenos de la mielina detectados en los ganglios linfáticos, lo cual parece indicar que las CMM podrían ser capaces de modular la respuesta inmunitaria contra la mielina. [Park DH et al, 2007]. En modelos animales se ha observado el mejoramiento tanto en el daño neurológico traumático como el de origen neonatal. Los efectos benéficos fueron observados aún

32 si las CMM no se colocaran directamente en el órgano dañado, esto, debido al papel que desempeñan los factores de reparación y crecimiento en el área lesionada. Las CMM de SCU tienen la habilidad de diferenciarse en múltiples tipos de células nerviosas y extenderse específicamente a áreas dañadas, tanto en cerebro como en medula espinal donde participan en la regeneración axonal, en la recuperación de la función motora así como en el mejoramiento de la percepción sensorial. La reducción del área infartada, de las hemorragias por oclusión o embolismo, además de efectos beneficiosos luego de 48 horas del evento trombótico, han sido documentadas [Rice KN, 2010].

33 Conclusiones Las células madre nos ofrecen la oportunidad de reconstruir órganos dañados ya sea por la formación de nuevo tejido o por la mejoría del paciente. Por ejemplo, un corazón infartado podría ser econstruido a partir de sus diferentes partes, es decir, células endoteliales, cardiomiocitos y células de músculo liso. Lo que era una noción radical hace 10 años, ahora es una verdad experimental, múltiples estudios se están realizando actualmente en el mundo entero. Gran parte de la comunidad científica, se encuentran entusiasta sobre los resultados y mejoras que la terapia celular podría brindar a millones de enfermos La cardiomioplastía celular es una innovadora terapia cuyo objetivo es inducir la angiogénesis y el crecimiento de las fibras musculares para la remodelación postisquémica Estudios han demostrado la regeneración y reparación de células nerviosas en cerebro y médula espinal contrario al oscuro panorama terapéutico existente. Las células madre procedentes de Médula ósea son las indicadas para regenerar el tejido hepático dañado. La posibilidad de usar células madre no embrionarias provenientes de médula ósea, cordón umbilical, tejidos y órganos adultos, promueve la posibilidad de realizar múltiples investigaciones permitiendo un equilibrio entre la ciencia y la ética sin detener el avance científico

34 Cuadro 1. Glosario de términos. Término Células madre o stem cells Células madre embriónicas Células madre adultas Hemangioblasto Células madre hematopoyéticas Células precursoras endoteliales Definición Células con capacidad para extender su permanencia y con habilidad para diferenciarse en múltiples tipos celulares. Células pluripotenciales derivadas de la masa celular cercana al blastocisto; que proporciona el crecimiento celular de las tres capas germinativas. Presentes en todos los tejidos renovables; estas células se dividen para asegurar su renovación y diferenciarse en múltiples tipos de progenitores celulares. Célula madre embriogénica precursor de células sanguíneas y endoteliales. Células madre medulares precursor de células sanguíneas y células endoteliales. Células madre hematopoyéticas con marcadores específicamente definidos Células madre mesenquimatosas Células madre medulares precursores de células de estroma y fibroblastos. Células autólogas Células provenientes del mismo individuo. Células alogénicas Células provenientes de la misma especie. Células heterólogas Células provenientes de diferentes especies. Plasticidad o transdiferenciación Células sanguíneas de cordón umbilical Capacidad de las células madre adultas que residen en un tejido para diferenciarse en células maduras de un tejido no relacionado o diferente al de su origen embrionario. Células con alto contenido de células madre hematopoyéticas primitivas con la ventaja de que las células inmunitarias que posee se encuentran inmaduras, lo que disminuye la incidencia de enfermedad severa de injerto contra huésped.

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