Titulo: INMUNOTERAPIA PARA CANCER CERVICO UTERINO

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1 Titulo: INMUNOTERAPIA PARA CANCER CERVICO UTERINO Autor: M. En C. Rosalva Rangel-Corona y Dra. Teresa Corona-Ortega, Lab. de Oncología de la Unidad de Investigación en Diferenciación Celular y Cáncer (UIDCC), FES- Zaragoza, UNAM. rancor@servidor.unam.mx La línea de investigación en Inmunoterapia se desarrolla en el laboratorio de Oncología de la UIDCC, FES-Zaragoza (L327), en dicha línea participan profesores de carrera y asignatura en el desarrollo de las investigaciones, asimismo, se cuenta con una gran participación de alumnos de las carreras de Biología y Q.F.B. quienes realizan sus tesis de licenciatura y posgrado cubriendo objetivos particulares de los proyectos. Bajo esta línea de investigación en Inmunoterapia hemos trabajado diversos proyectos que tienen como objetivo principal desarrollar alternativas terapéuticas para las pacientes con cáncer cérvico uterino (CaCu). Nuestro modelo de estudio es el CaCu por ser un problema de salud pública muy importante en México y a nivel mundial ya que en los países desarrollados se ha observado un reciente incremento de este padecimiento, aunque en nuestro país representa la principal causa de muerte por neoplasias en mujeres económicamente activas 1. Debido a que este tumor está asociado fuertemente a una etiología viral se piensa que podría ser un buen candidato para el uso de inmunoterapia empleando IL-2 para activar in vivo células NK y linfocitos citotóxicos. Tomando en consideración lo antes mencionado nuestro primer proyecto de investigación se enfoco en la generación de linfocitos citotóxicos específicos contra células de CaCu (Apoyo CONACyT D ). Los datos publicados de esta investigación demuestran, que por medio de un modelo autólogo, es posible generar in vitro linfocitos T citotóxicos (LTC) de memoria contra células de CaCu, a partir de leucocitos de sangre periférica de pacientes y una combinación de citocinas 2. Esta información dejo claro que los LTC no han perdido su capacidad de reconocer antígenos tumorales y despertar una respuesta de rechazo contra las células que los portan, sin embargo, es evidente que existen, in vivo, otros factores que regulan negativa la respuesta inmunológica de rechazo tumoral y que es necesario investigar más acerca del papel que desempeñan las citocinas y sus receptores presentes en las células tumorales.

2 Posteriormente, trabajamos en la determinación de la presencia del receptor para IL- 2 (RIL-2) en las líneas de CaCu CALO e INBL, líneas celulares generadas en la FES- Zaragoza a partir de biopsias de pacientes mexicanas, para aclarar el papel del RL-2 en el escape inmunológico de este tipo de tumor, además de evaluar el efecto de IL- 2 sobre la proliferación in vitro de dichas células (Apoyo PAPIIT IN211595). En primer lugar al comparar los resultados de la expresión del RIL-2 de las líneas celulares con muestras de tumores de CaCu en diferentes estadios, observamos que existe una expresión diferencial del RIL-2 en el CaCu. En estadios iniciales (neoplasias intraepiteliales y estadio I y II) solo podemos detectar la presencia de la cadena alfa del receptor, pero en estadios avanzados (III y IV) detectamos las tres cadenas que conforman el RIL-2 3. Por otra parte, al estudiar el efecto de IL-2 sobre la proliferación de las líneas CALO e INBL pudimos aclarar que el RIL-2 que expresan las células de CaCu es funcional y que dependiendo de la dosis de IL-2 administrada en cultivos de las líneas celulares podemos inhibir la proliferación de las células de CaCu en presencia de altas dosis de IL-2 exógena (100 UI/mL), sin embargo, en presencia de 5-10 UI/mL de IL-2 podemos inducir la proliferación de esa mismas células tumorales 4. Estos datos sugieren la dependencia de las líneas celulares de CaCu CALO e INBL por IL-2, y que dicha células pueden competir por la citocina con los Linfocitos de Sangre Periférica (LSP), citocina requerida para generar una respuesta inmunológica de rechazo en este caso del tumor. Si existe competencia los LSP estarían en desventaja, ya que las pruebas in vitro demuestran que las células tumorales requieren entre 5-10 UI/ml de IL-2 para proliferar mientras que los LSP en las mismas condiciones necesitan cuando menos 100 UI/mL de esta citocina. Los resultados de inhibición de la proliferación son interesantes ya que esta citocina se podría usar como terapia para este tumor. Sin embargo, la IL-2 utilizada sola o en combinación en la inmunoterapia adoptiva tanto en animales como en humanos para inducir regresión de tumores en estadios avanzados, ha mostrado una modesta respuesta antitumoral, pero su aplicación vía sistémica perturba vías de regulación hematopoyética importantes y puede provocar serios efectos secundarios, por lo cual su uso es limitado. Por lo tanto debemos de contar con una vía de administración que disminuya los efectos colaterales como síndrome de goteo-capilar, fiebre, dolor de cabeza e hipotensión para usar IL-2 como alternativa terapéutica para el CaCu.

3 Para ello se trabajó en la implementación de una alternativa segura para la administración de IL-2. En este proyecto se pensó en el uso de membranas biológicas como acarreadores de proteínas en altas concentraciones. La colaboración con el laboratorio de Biomembranas de la Escuela de Ciencias Biológicas del IPN nos ha permitido demostrar tanto in vivo como in vitro que los liposomas son una alternativa plausible para evitar los efectos colaterales por la administración de IL-2 en altas concentraciones. En dicho proceso establecimos en FES-Zaragoza las condiciones para inducir masas tumorales de CaCu en ratones singénicos de la cepa CBA. Una vez establecidas las masas tumorales en los ratones se administra IL-2 en forma libre y encapsulada en liposomas de diferentes formulaciones. Hasta ahora hemos observado que el tratamiento con IL-2 reduce significativamente las masas tumorales y que al encapsular la IL-2 en liposomas catiónicos se obtiene una menor cantidad de efectos adversos en los ratones y una mayor reducción de las masas tumortales 4.5. Ahora bien en un trabajo de colaboración con el laboratorio de la Dra. Morrison en California (Apoyo PAPIIT IN215300), quien ha creado a partir de transfección, una proteína de fusión llamada TAPW cuya característica es la de reconocer a la molécula HER-2 sobre células tumorales además de expresar dos moléculas de IL-2 en su fracción constante. Dicha molécula fue creada con el propósito de concentrar en la vecindad del crecimiento tumoral una cantidad suficiente de IL-2, que permita la generación de células citotóxicas específicas de memoria que puedan combatir eficientemente el tumor. Por la construcción de TAPW se puede facilitar la llegada de éste a las células tumorales, que sobre expresan HER-2, permitiendo la acumulación de IL-2 en el microambiente tumoral. Esta estrategia es muy práctica si pensamos que por un lado se inhibe el crecimiento tumoral con el anticuerpo y por otro lado, se puede activar una respuesta inmunológica antitumoral por la acumulación de IL-2. Los datos preliminares indican que la IL-2 en forma de TAPW tiene el mismo efecto inhibidor que la IL-2 libre tanto in vivo como in vitro, y cuando se encapsula disminuye los efectos colaterales. El tratamiento con TAPW reduce la cantidad de IL-2 necesaria para generar el mismo efecto anti-tumoral que IL-2 sola 5,6. Actualmente, trabajamos para esclarecer las interacciones de los liposomas con IL-2 y la interacción liposoma célula tumoral para determinar la posición de IL-2 en los

4 liposomas e identificar los liposomas en las masas tumorales (Apoyo PAPIIT IN216502). Los resultados de microscopia electrónica demuestran que los liposomas cambian su morfología cuando contienen IL-2, estos datos nos servirán para localizar los liposomas en posteriores estudios que involucren la farmacocinética de IL-2 administrada en liposomas 7. Otro dato relevante de este proyecto es el haber confirmado que la IL-2 se encuentra en el interior de los liposomas y no unida al liposoma 8. Hasta el momento contamos con información muy importante para encapsular IL-2 en liposomas sin que ésta pierda su efecto inhibidor de la proliferación de células de CaCu, además de poder localizar a los liposomas-il-2 por los cambios morfológicos que produce en los liposomas la IL-2. La resonancia magnética nuclear nos indica que los liposomas-il-2 se organizan en bicapas, lo cual significa que no se altera la estructura de los liposomas y por tanto puede haber una fusión correcta con la membrana de las células blanco lo cual garantiza que la citocina llegara al tumor sobre todo si dirigimos a los liposomas utilizando un anticuerpo contra HER-2 ya que esta molécula se sobre expresa en células de CaCu. Cabe mencionar que la relevancia del proyecto, Regresión de tumores por el uso de proteína de fusión encapsulada en liposomas, es el contar con un tratamiento a base de IL-2 que elimine crecimientos tumorales de CaCu sin causar efectos colaterales en las pacientes, esto último lo coloca como una posible alternativa terapéutica para las pacientes con CaCu. Durante el desarrollo de las investigaciones arriba mencionadas, los alumnos que participaron y participan en ellas han recibido Menciones honoríficas y premios por los avances presentados en foros nacionales. Se espera que en un futuro la información generada por esta línea de investigación en Inmunoterapia para CaCu pueda ser utilizada para el establecimiento de terapias moleculares para curar el cáncer. Otros datos de gran importancia, que se han obtenido hasta el momento y que contribuyen a conocer más, acerca de la biología del CaCu es el haber demostrado que las líneas CALO e INBL co-expresan el receptor para Steel factor (SF) y el receptor c-kit, que participan en la interacción dependiente de la densidad de estas células y les confieren sobrevivida, demostrando que c-kit, una tirosina cinasa, participa en la patogénesis de estas líneas celulares 6. También hemos publicado que SF induce fosforilación del RIL-2 en ausencia de IL-2 9. Asimismo, hemos

5 comprobado que la unión de IL-2 a su receptor modifica el patrón de fosforilación en tirosina de diferentes proteínas, como la cinasa JAK3, STAT3 y STAT5 10. Propuestas para el fortalecimiento de la investigación Cabe mencionar que la investigación que se realiza en las Escuelas y Facultades es una actividad muy importante, ya que es una de nuestras tareas sustantivas, sin embargo, para los profesores de estas entidades la docencia tiene un papel preponderante. Por ello, los profesores que realizamos investigación básica, podemos enriquecer las clases impartidas en el pregrado y posgrado con datos y experiencias generadas de las investigaciones que desarrollamos, además de contar con información actualizada que al ser transmitida a los alumnos contribuye a un mejor aprendizaje y aprovechamiento escolar. Lo antes mencionado es la razón por la cual los investigadores deben impartir clases a nivel licenciatura para incentivar a los alumnos y despertar en ellos el interés por la investigación básica y aplicada. No obstante, se requiere contar con instalaciones apropiadas para ubicar los laboratoros dedicados a investigación. También sería deseable contar con apoyo técnico para una mejor organización de las actividades del quehacer científico, además de supervisar el buen funcionamiento y mantenimiento de equipo de precisión con que se cuenta. Es necesario destacar que a pesar de contar con apoyos tanto de DGAPA como de CONACyT, los recursos asignados no son suficientes para adquirir equipo costoso, como ultracentrífugas, citómetro de flujo y microscopio confocal, necesarios para la implementación de técnicas de frontera. La falta de este tipo de equipo puede modificar las metas o alterar los cronogramas propuestos en los diversos proyectos. En nuestro caso hemos podido superar este obstáculo con el establecimiento de colaboraciones con investigadores de dependencias de la UNAM o de otras Instituciones que cuentan con estos equipos, que además de permitir un avance de las investigaciones hacen posible que se de un intercambio de experiencias que enriquecen el trabajo. Otra posible solución, es el planteamiento de proyectos interdisciplinarios con la participación de varios grupos de investigación, en una o varias dependencias, para poder consolidar grupos de investigación y comprar equipos que permitan optimizar el tiempo dedicado a la investigación y mejorará las clases que se imparten en los laboratorios y aulas del pregrado, hecho que repercutiría en la formación de los

6 alumnos. Sería importante que la DGAPA, a través de algún programa en particular, considerara la posibilidad de formalizar y fomentar la colaboración entre diferentes grupos de trabajo, tanto en la misma dependencia como entre otras. Estamos seguros que estas acciones nos permitirían optimizar recursos humanos e infraestructura y formar recursos humanos altamente especializados, para sostener, fortalecer y consolidar la investigación que se realiza en Facultades y Escuelas. COLABORADORES FES-ZARAGOZA CIENCIAS BIOLÓGICA UCLA UNAM IPN USA Dr. Benny Weiss-Steider Dr. Miguel A. Ibáñez-Hernández, Dra. Sheri Morrison Biol. José L. Acosta-Ramírez Dra. Isabel Baeza-Ramírez Dr. Manuel Penichet Q.F.B. Miriam Hernández-Jiménez Mtra. Emma Leiva Q.F.B. Antonio Ayala-Alpuche Biol. Miguel López-Hernández Biol. Reynalda Roldan-Pérez CITAS 1.- González-Garay, M.L., Barra-Saldaña, H.A., Aviles L.B., Álvarez-Salas, L.M., and Gariglio P Revalence in two Mexican cites of human papillomavirus DNA sequences in cervical cancer. Rev. Investg. Clin., 44: , Rosalva Rangel, Leticia Rocha, José Luis Ramírez, Ma. J. Ibarar, Gilberto Solorza, Alberto Monroy, Miguel A.Ramírez, Angel Herrera, and Benny Weiss-Steider. Generation of memory CD4+, CD8+, CD45Ro+ and CD16+ lymphocytes activated with IL-2 IFNg and TNFa with specific citotoxicity against autologous cervical cancer cell in mixed lymphocytes tuour culture. Eur. Cytokine Netw., 6: R. Rangel-Corona, L. Rodríguez-Cruz, G. Flores-Flores, C. Gómez-Ruiz, I. Soto-Cruz, J.F. Mendoza-Rincon and B Weiss-Steider. Differential expression of the two components of the Interleukin-2 receptor in cervical cancer cells. MonduzzieEditors(3) PP , Alvarado, M. J. A. Presencia de la cadena α y β del receptor para interleucina 2 (RIL-2) en células tumorales de carcinoma cérvico uterino (CaCu) y el efecto proliferador inducido por la interleucina 2 (IL-2 ) en estas células tumorales: un posible mecanismo de escape inmunológico. Tesis de Licenciatura. FES-Zaragoza.< UNAM. México, D.F Rangel-Corona R., Corona-Ortega T., Soto-Cruz I., Penichet M, Weiss-Steider B. Inducción a la proliferación y citotoxicidad de linfocitos de sangre periférica por anticuerpos biespecíficos Revista de Hematología Vol- 2 No Cáceres -Cortés JR, Alvarado-Moreno JA, K. Waga., Rangel-Corona R, A. Monroy-García, L. Rocha-Zavaleta, J. Urdiales-Ramos, Weiss-Steider B, A. Haman, Brousseau R, Hoang T. Implication of tirosine kinase receptor and Steel Factor in cell-density dependent growth in cervical cancers and leukemias. Cancer Res. 61: , R. Rangel-Corona, M.A. Hernández-Jiménez, T Corona-Ortega, M.A. Ibáñez-Hernández, I. Baeza- Rodríguez and B. Weiss-Steider. Interleukin-2 interaction with liposomes of different formulations (Neutral and Cationics) Immunology Miriam Araceli Hernández Jiménez. Determinación de la interacción de liposomas catiónicos con IIL-2. Tesis de Licenciatura,. FES-Zaragoza, UNAM. México D.F Leticia Rocha-Zavaleta, Carlos Huitron, Julio R. Cáceres-Cortes, José A. Alvarado-Moreno, Arturo Valle-Mendiola, Isabel Soto-cruz, Benny Weiss Steider, Rosalva Rangel-Corona. Interleukin-2 (IL-2) Receptor-bg signalling is actived by c-kit in the absence of Il-2, or by exgenous IL-2 via JAK37STAT5 in human papillomavirus-associated cervical cancer. Cellular Signalling 16: , Soto-Cruz,I., Santiago-Pérez, A.R., Moreno-Morales, X., Rangel-Corona, Rosalva, R., Cáceres- Cortés, J.R. Implication of tyrosine kinase receptors c-kit and HER-2 in cell growth of cervical carcinoma. Res. Adv. Can. Aceptado, 2003.