Guía para el cálculo de la permeabilidad intestinal a partir de datos de ensayos con cultivos celulares

Transcripción

1 CALCULO DE LA PERMEABILIDAD INTESTINAL IN VITRO PASO 1. Descripción del ensayo Insertar en las celdas preparadas el efecto los datos sobre nuestro sistema experimental, es decir, área en cm2 de los insertos utilizados, volúmenes en ml de la cámara dadora y receptora, volumen de muestra que se toma en ml concentración inicial de la solución de fármaco por ejemplo micromolar. La cantidad inicial de fármaco se obtiene multiplicando el Donor V* Init Conc f corresponde al factor de dilución que se calcula como (Receivel Vol Sample Vol)/Receiver Vol PASO 2. Inserción de los datos experimentales Se introducen los tiempo de toma de muestras en minutos pero se trasforman a segundos para obtener las permeabilidades den las unidades habituales. Se tabulan las concentraciones experimentales obtenidas en las muestras. Para calcular las cantidades en compartimento receptor se multiplican las concentraciones experimentales "Cexp" por el volumen de la cámara receptora "Receiver Vol" 1

2 Hay que considerar por otra parte que con cada muestra se ha eliminado una cantidad de fármaco del compartimento receptor. Esta cantidad se calcula en la columna F multiplicando la concentración en receptor "C exp" por el volumen de la muestra "Sample Vol" En la columna G se acumulan las cantidades totales que se han extraído del sistema por el muestreo. 2

3 Por último se suman las cantidades en receptor con las cantidades acumuladas en las muestras para obtener las cantidades totales acumuladas en receptor. A partir de las cantidades acumuladas en receptor se pueden corregir las concentraciones remanentes en el compartimento dador 3

4 Esta corrección es necesaria ya que la autentica fuerza motriz para la difusión es la diferencia de concentraciones entre cámara dador y receptora y no es exacto suponer que la concentración en dador no cambia o que la concentración en receptor es despreciable frente a la que hay en dador (condiciones sink donde Creceiver<0.1*C donor). Una vez corregida la concentración en dador se puede comparar con la de receptor para contrastar si se mantienen las condiciones sink (o sumidero). Si Cexp(receiver)/C donor< 0.11 se acepta que hay condiciones sink. En caso contrario aparece la alerta NOsink. Para crear esa alerta se hace con una función lógica cuya sintaxis se muestras a continuación El último paso consiste en calcular las fracciones transportadas en cada intervalo de tiempo, que corresponden a la diferencia [cantidad en receptor en el instante t+1] [cantidad en receptor en el instante t] dividido por al área de transporte A y por la concentración promedia en dador entre esos dos tiempos. 4

5 Ahora mediante regresión lineal de las fracciones transportadas frente al tiempo se obtiene una pendiente que representa directamente la permeabilidad en cm/s 5

6 En la aproximación clásica para el cálculo de permeabilidades se hace la regresión de cantidades acumuladas en receptor frente la tiempo y la pendiente se corrige por el área de transporte y por la concentración inicial para calcular la Peff como se ve en la siguiente figura Sin embargo ello supone asumir que la Concentración en dador permanece constante, lo que habitualmente no se cumple, en el ejemplo presente disminuye de 50 micromolar a 16 micromolar. Por ello la permeabilidad calculada bajo el supuesto de dador infinito (cuya C no varía) y condiciones sink obtiene un permeabilidad infraestimada. La corrección realizada para tener en cuenta el cambio de concentración en dador y por tanto el cambio de la fuerza motriz de la difusión permite obtener una permeabilidad más aproximada al valor real. 6

7 No obstante en este método de cálculo se ignora la violación de la condiciones sink. Para tener en cuenta este factor hay que utilizar la ecuación integrada completa que describe la evolución de las concentraciones en compartimento receptor cuya implementación se sale del ámbito de este curso. Los estudiantes puede encontrar una descripción completa en las siguientes referencias bibliográficas: Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., Artursson, P., (2002). "Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport". Methods Mol Biol 188: Mangas Sanjuán V., Gonzalez Alvarez M., González Alvarez I., Bermejo Sanz, M. (2011) "Caco 2 cells for studying intestinal absorption mechanisms: comparison and correlations with rat model" in Caco 2 cells and their users" Ed. Megan A. Schulz ISBN: