ATAC No. 2/ Palabras Clave: IFOPOL, caña, AIS, HYDROMAG, transferasas, oligosacáridos, prebióticos.

Transcripción

1 Inhibidores especificos para las transferasas de la caña de azúcar Eduardo L. Ramos y Susana Ravelo 1 RESUMEN Los inhibidores específicos para las transferasas de la caña de azúcar pueden ser usados para inhibir selectivamente cada una de las diferentes enzimas presentes en la caña involucradas en la transformación de la sacarosa en oligosacáridos, como son las Kestosas, la Rafinosa, la Lactosacarosa, etcétera. Se caracterizan los inhibidores por ser derivados de los carbohidratos obtenidos a través de la reacción aminocarbonílica, conocida como reacción Maillard, en condiciones tales que se optimizan sus propiedades como inhibidores específicos para cada una de las diferentes transferasas de la caña de azúcar. Estos nuevos inhibidores específicos permiten manipular la acción de extractos de las enzimas de la caña, donde esté presente la mezcla de todas las transferasas, para obtener a partir de la sacarosa aquellas mezclas de oligosacáridos que resultan de interés para la industria alimenticia y farmacéutica. INTRODUCCIÓN Los productos de la reacción Maillard o amino carbonílica (Maillard, 1912) (Reynold, 1963; Reynold, 1965) han mostrado capacidad inhibidora de enzimas (Schumacher y Kroh, 1996; Friedman M., 1992), en especial las asociadas a la formación de oligosacáridos y polisacáridos, tal es así que se han logrado preparados que han mostrado alta eficiencia en la inhibición de la formación de estas sustancias por la acción de enzimas producidas por la caña de azúcar y los microorganismos. Estos productos, conocidos comercialmente con el nombre genérico de IFOPOL, y su variante optimizada IFOPOL S (Ramos) logran, en concentraciones en agua corriente menores de 10 ppm, inhibir las enzimas involucradas en la transformación de la sacarosa presente en la caña y sus jugos. Con el uso de estos productos se logran reducir, sensiblemente, las pérdidas de sacarosa y la formación de impurezas, como son los oligosacáridos y polisacáridos, de reconocido efecto depresor de la eficiencia industrial. Generalmente se asocia la presencia de las anteriores impurezas al aumento de la viscosidad de los productos intermedios de la fábrica, la inhibición del crecimiento y la deformación del cristal de sacarosa, todo lo cual conduce a la formación de microcristales alargados por su eje c. Estos efectos negativos sobre la cristalización de la sacarosa se suman, provocando la aparición de mieles finales de altas purezas al no poder agotarlas ni impedir el escape de microcristales a través de las telas de las centrífugas (Ramos y col., 2002). No obstante, la tendencia a la formación de oligosacáridos en los jugos de la caña de azúcar se hace notoria para un gran número de variedades, hallándose que la concentración de estos Azúca- Palabras Clave: IFOPOL, caña,, HYDROMAG, transferasas, oligosacáridos, prebióticos. 1 Instituto Cubano de Investigaciones Azucareras (ICINAZ). ATAC No. 2/

2 res que Impurifican la Sacarosa en los jugos en el momento de su madurez,, resulta ser un índice de la velocidad de auto-degradación de las diferentes variedades de caña luego del corte. De hecho, este índice define la calidad de la caña para la producción eficiente de azúcar (Ramos y col., 2006). Paradójicamente, los oligosacáridos formados por las diferentes variedades de caña, que de cierta manera las caracterizan, poseen interés para la industria alimentaria y farmacéutica al resultar prebióticos. Es decir, que aquellas variedades propensas a formar altos niveles de oligosacáridos funcionales podrían ser de interés para la producción de estos azúcares. Entre los oligosacáridos identificados están las Kestosas, la Rafinosa y la Lactosacarosa (Ramos y col., 2006) (Ramos y col., 2007) Con el propósito de manipular las enzimas presentes en estas variedades, recientemente se sintetizó a través de la optimización de las condiciones de desarrollo de la reacción Maillard, un inhibidor de las enzimas hidrolasas y polimerasas, IFOPOLIP, que permite acentuar la formación en los jugos de caña de los oligosacáridos, al reducir la hidrólisis y la formación de polisacáridos (Ramos y Ravelo, 2006). No obstante, para completar las herramientas necesarias para actuar sobre el sistema enzimático de la caña (para obtener solo las mezclas de oligosacáridos que resulten de interés por sus propiedades benéficas a la salud del hombre) resulta necesario poder inhibir selectivamente a las transferasas presentes en los extractos de enzimas. En este trabajo se describen las propiedades de varios inhibidores que permiten inhibir selectivamente a cada una de las transferasas presentes en la caña de azúcar. PARTE EXPERIMENTAL Las cañas utilizadas en este trabajo se seleccionaron en un jardín de variedades de la ETICA localizada en las tierras ferralíticas del sur de La Habana. Las variedades de caña seleccionadas se muestran en la Tabla 1, todas primaveras de 12 meses en el mes de abril, seleccionándose cañas primarias sanas de varios plantones elegidos al azar. Las cañas utilizadas para medir también el efecto inhibidor de los Productos de la Reacción Maillard (PRM) sobre las enzimas de los microorganismos (flora microbiana habitual presente en caña), se dejaron deteriorar a la intemperie por varios días. Los jugos se extrajeron desfibrando las cañas y prensándola inmediatamente a 200 Kg/cm 2 por un minuto. Las actividades de las enzimas hidrolasas, polimerasas y transferasas en la caña y sus jugos se determinaron a través de la formación de azúcares reductores, polisacáridos y oligosacáridos, respectivamente. Con este fin se usó la técnica colorimétrica de reductores basada en el uso del reactivo 3,5 dinitrosalicílico y los métodos analíticos para polisacáridos y oligosacáridos () reportadas en anteriores trabajos (Ramos y col., 2002; Ramos y col., 2006), basados en la separación por filtración por gel y el empleo del adsorbente HYDROMAG (Ramos), desarrollado en el ICINAZ. La determinación del efecto de los Inhibidores de las Transferasas Específicos, (ITE), se realizó por elusión frontal desde una columna de HYDROMAG de 2,5 x 12 cm de cada tipo de azúcar formado por las transferasas de la caña, usando soluciones hidroalcohólicas de concentraciones adecuadas. En el caso de los polisacáridos, se separaron y determinaron los mayores de ua usando gel Sephadex G-15. Los inhibidores se sintetizaron a través de la reacción Maillard, empleando diversos azúcares, aminas, catalizadores y condiciones de reacción, optimizándose sus propiedades inhibidoras de las enzimas con la ayuda de varias técnicas de optimización experimental (Matas, 1980). El efecto inhibidor de los PRM en los jugos se determinó usando concentraciones entre 5 y 100 ppm con relación al peso del jugo (previamente desinfectado) y comparando con un testigo sin inhibidor. En el caso de la caña, esta se empleó fresca y troceada (25-30cm), para ello se mojó uno de los extremos de cada trozo (20-25 trozos) con una solución a 10 ppm del inhibidor estudiado. El efecto del inhibidor se estimó a las 24 horas (se dejó la caña a la intemperie) luego de cortar los trozos a la mitad y determinar la composición del jugo de las mitades tratadas y los testigos. DISCUSIÓN Según los últimos resultados de los estudios dirigidos a determinar las posibilidades prácticas de emplear el sistema enzimático de la caña para la producción de oligosacáridos de interés para la industria alimentaria o farmacéutica (funcionales), se ha podido determinar que existen variedades de caña que muestran una especial tendencia a acumular oligosacáridos en sus jugos; se ha establecido, además, que poseen capacidad de formar mezclas de oligosacáridos (prebióticos) constituidas por 1-Kestosa, Rafinosa y Lactosacarosa, entre otros azúcares, (Ramos y col., 2006) 48 ATAC No. 2/2008

3 Los oligosacáridos 1-Kestosa, Lactosacarosa y Rafinosa, son azúcares que normalmente resultan impurezas dañinas para el proceso de producción de azúcar e impiden el normal crecimiento del cristal de sacarosa (Ver com). No obstante, al tratar de incrementar el contenido de estos azúcares en los jugos, empleando el inhibidor de las enzimas IFOPOLIP, con capacidad de inhibir a las invertasas y las polimerasas y no a las transferasas de la caña, no se observaron incrementos notorios en los rendimientos, ver Tabla 1. Este comportamiento del sistema enzimático de la caña parece estar asociado a la presencia de mecanismos de control de la formación de oligosacáridos en la gramínea que pueden responder a la presencia de inhibidores de las transferasas formados por la propia caña. Recientemente se han podido aislar extractos de algunas partes de la caña con un alto poder inhibidor de la formación de oligosacáridos en los jugos (Ramos y col., 2007). Tabla No. 1 Influencia del IFOPOL IP sobre los rendimientos de diferentes variedades de caña de azúcar VARIE- DADES INICIAL, % Bx SIN Para manipular efectivamente el sistema enzimático de la caña en la producción de oligosacáridos de interés como alimentos funcionales, debe evitarse o reducirse la formación de otros azúcares que no posean tales propiedades. Para ello deben eliminarse las enzimas que no resulten de interés a través de complejas separaciones cromatográficas o, de ser posible, inhibiendo su acción sobre la sacarosa. Los trabajos encaminados en esta última dirección han permitido la preparación de productos Inhibidores de las Transferasas Específicos, IFOPOL(E), que pueden ser usados durante la preparación de mezclas de oligosacáridos a partir de la sacarosa, empleando extractos de las enzimas Transferasas presentes en las diferentes variedades de caña. Los productos IFOPOL(E) se han logrado obtener a través de la reacción aminocarbonílica y están constituidos por mezclas de productos FINAL, % Bx CON IFOPOLIP C ,70 0,10 0,06 8,13 0,55 0,21 9,02 0,12 0,06 C ,34 0,26 0,10 13,60 0,40 0,18 15,12 0,25 0,09 Ty ,17 0,20 0,06 12,04 0,20 0,11 13,14 0,16 0,06 C ,80 0,10 0,06 1,53 0,21 0,12 2,00 0,09 0,04 J ,57 0,10 0,10 1,81 0,80 0,19 6,48 0,70 0,07 MY ,84 0,15 0,14 1,40 0,30 0,15 1,62 0,10 0,07 PROM. 2,74 0,15 0,09 6,42 0,41 0,16 7,90 0,24 0,07 Amadori y N-Glicósidos que resultan particularmente estables, y que, además, poseen un poder inhibidor inusual y con alta especificidad para las diferentes transferasas presentes en la caña. Los inhibidores IFOPOL(E) permiten la preparación de mezclas de los oligosacáridos que sean de interés para la industria alimentaria y farmacéutica, por medio de la mezcla de transferasas de la caña, al impedir la formación de determinados oligosacáridos indeseables en la mezcla edulcorante. Los productos IFOPOL(E) resultan novedosos por su capacidad de inhibir específicamente a cada transferasa de la caña, diferenciándose por esta propiedad del IFOPOL S que están dirigidos a la inhibición de los tres tipos de enzimas: las hidrolasas, polimerasas y transferasas de la caña y el IFOPOL IP, que inhibe solo a los dos primeros tipos de enzimas y no a las transferasas. En la Tabla 2 se muestran las características de variantes comerciales de los dos primeros tipos de inhibidores. Como se puede apreciar el primero inhibe con alta eficiencia los tres tipos de enzimas, por lo que no puede usarse para la preparación de oligosacáridos usando extractos de las mezclas de estas enzimas de la caña. El segundo permite la acción solamente de las transferasas, facilitando la acumulación de los oligosacáridos en los jugos. Los productos IFOPOL(E) además de poseer propiedades excepcionales como inhibidores específicos de las transferasas producidas por la caña, son altamente estables, lo cual facilita su empleo en la industria azucarera para la diversificación de la producción de edulcorantes a partir de la sacarosa. Durante la preparación de mezclas de oligosacáridos (funcionales) los productos IFOPOL(E) controlarían la formación de determinados oligosacáridos indeseables. No obstante, los tres tipos de inhibidores se obtienen igualmente a través de la reacción Maillard (reacción que normalmente se desarrolla entre los azúcares y las proteínas durante la cocción de los alimentos), y que hemos sintetizado en condiciones tales que no resultan tóxicos. Esto último se ha podido comprobar en estudios realizados en CENPALAB usando diferentes animales (Arteaga y col., 2006). ATAC No. 2/

4 Tabla No. 2 Características de los inhibidores IFOPOL S e IFOPOL IP PRODUCTO INHIBIDOR DE LAS ENZIMAS HIDROLASAS, POLIMERASAS Y TRANSFERASAS. EFICIENCIA COMO INHIBIDOR SOBRE LAS ENZIMAS* Enzimas de la caña (jugos estériles de cañas frescas) Transferasas 84 Hidrolasas 93 imerasas 79 Enzimas de los microorganismos (jugos de cañas atrasadas) Transferasas 85 Hidrolasas 100 imerasas 100 Todas las enzimas (caña troceada) Transferasas 77 Hidrolasas 6%** imerasas 82 S PRODUCTO INHIBIDOR DE LAS ENZIMAS HIDROLASAS Y POLIMERASAS DE LOS JUGOS DE CAÑA* Jugos estériles de cañas frescas Transferasas (0) Hidrolasas 88 imerasas 100 Jugos de cañas deterioradas Transferasas (10,4) Hidrolasas 89,9 imerasas 89 *Valores medios de tres corridas, obtenidos al tratar jugos con dosis de 10 ppm de IFOPOLIP. Las medias reportadas poseen un intervalo de confianza (P = 95) de ±8 para las transferasas e hidrolasas y de ± 4 para las polimerasas. **Ganancia de sacarosa. IP Nota: El efecto inhibidor de los INHIBIDORES obtenidos se determinó añadiéndolo a 10 ppm con relación al peso del jugo o (mojando la caña con sus soluciones,10 ppm), en corridas paralelas con un testigo no tratado. En este último caso se reporta el efecto al aplicar los inhibidores sobre uno de los extremos de los trozos de cañas troceadas (25-30 cm) y comparar la composición de los jugos de ambas mitades, a las 24 horas a la intemperie. En resumen: 1. Los productos inhibidores de las transferasas IFOPOL(E) son altamente específicos y efectivos en la inhibición de las diferentes transferasas presentes en la caña de azúcar. 2. Los productos IFOPOL(E) resultan estables, manteniendo su poder inhibidor de las enzimas presentes en la caña y sus jugos. 3. Los productos desarrollados no resultan tóxicos. La actividad inhibidora de los IFOPOL(E) se hace manifiesta al añadir uno o varios de los inhibidores en un rango de concentraciones de ppm a los jugos. Se observa de 90 a 100 % de reducción en la concentración de aquellos oligosacáridos que forman las transferasas inhibidas, ver Tabla 3. Los inhibidores mantienen su actividad por largos Inhibidor Tabla No. 3 Inhibidores específicos para las transferasas de la caña, IFOPOL(E) OLIGOSACÁRIDO (de la Glucosa) Grado de inhibición de la formacion de cada azúcar D-XILOSA* RAFINOSA 1-KESTOSA LACTO-SACAROSA IFOPOL(F) IFOPOL(L) IFOPOL(G) IFOPOL(X) * Monosacárido que se forma colateralmente durante la acción de la mezcla de enzimas presentes en muchas variedades caña. IFOPOL- Inhibidor de la Formación de Oligosacáridos y isacáridos () -La letra entre paréntesis indica las condiciones óptimas particulares que fueron empleadas para la síntesis del inhibidor. Nota: El error ponderal en los valores del porcentaje de inhibición para 4 corridas resultó menor de 2 %. El guión en las casillas indica que las variaciones en la formación de esos azúcares resultaron estadísticamente no significativas. 50 ATAC No. 2/2008

5 períodos y pueden usarse directamente luego de diluirse a la concentración de trabajo. Las soluciones diluidas resultan estables por varios días o pueden estabilizarse por períodos de hasta un año. CONCLUSIONES 1. Se ha logrado desarrollar a través de la reacción Maillard productos inhibidores de las enzimas con alta especificidad para cada una de las transferasas presentes en los jugos de las diferentes variedades de la caña de azúcar. Estos están formados por una mezcla particularmente activa de N-glicósidos y productos Amadori, cuyas propiedades inhibidoras están determinadas por las características estereoquímicas y proporciones de los residuos de los azúcares que forman tales compuestos. 2. Los productos IFOPOL(E) resultan particularmente estables y no resultan tóxicos. 3. Los IFOPOL(E) pueden emplearse para la preparación de mezclas de aquellos oligosacáridos formados por las variedades de caña, que posean propiedades de interés para la industria alimentaria y farmacéutica. BIBLIOGRAFÍA 1. Friedman M. : Dietary impact of food processing Annual-Review-of-Nutrition -/12: , Many Ref., Maillard L. C.: Formation d`humus et de combustible mineraux sans intervetion de l oxigen atmospherique des microorganismes des haute temp. ou des torte prescious Compt. Rend. -/155: 1554 (f), Mata A. J.: Técnicas de optimización experimental, Parte 1. El método simplex modificado, Ingeniería Química, Abril: 68, Ramos E. L, S. Ravelo y S. Gutiérrez La Composición de Carbohidratos de los Jugos de Caña y la Pureza de las Mieles Finales ATAC 63/ 2, 13-19, Ramos E. L., IFOPOL S. Nuevo producto ifopol capaz de mejorar la calidad de la caña topcities.com/ifopols.htm 6. Ramos E. L. y S. Ravelo: Los inhibidores de las enzimas IFOPOL y su impacto en la industria ATAC, Vol. 67, No. 1, enero-junio, pp , Ramos E. L., HYDROMAG. Un soporte cromatográfico diseñado para la separación de monosacáridos y de oligosacáridos. topcities.com/hydromag.htm 8. Ramos E. L., S. Ravelo y S. Pino: La auto-degradación de la caña de azúcar. Un factor a considerar en la selección de variedades. Partes I y II, en Memoria del 49 Congreso de la ATAC, CD-ROM, ISBN: , noviembre, Ramos E. L., S. Ravelo y S. Pino: La auto-degradación de la caña de azúcar. Efecto de los Azúcares que impurifican la sacarosa e inhibidores de las enzimas, ATAC, Vol. 68, No. 2, mayo-diciembre, pp , Reynold T. M.: Chemistry on non enzymatic browning Adv. Food Res. a -/12: 1 51 (i), 1963; b -/14: (i), Schumacher D., and Kroh L. W. : The effect of Maillard reaction products on enzyme reactions Z-Lebensm-Unters-Forsch, Sept. 35/3: , Arteaga M. E., E. L. Ramos, C. González, A. Mancebo, A. M. Bada, O. G. Bárbara: Evaluación del IFOPOL S mediante el método de las clases toxicidad y toxicidad aguda dérmica. CENPA- LAB/ICINAZ, Salud Animal, Vol. 29, No. 3, pp , ATAC No. 2/